一种与烟草成熟期集中落黄性状相关的SNP标记分子和应用

一种与烟草成熟期集中落黄性状相关的snp标记分子和应用
技术领域
1.本发明属于农业生物技术技术领域，具体涉及一种与烟草成熟期集中落黄性状相关的snp标记分子和应用。


背景技术：

2.烟草(nicotiana tabacum l.)是一种叶用经济作物，其烟叶在成熟期叶绿素的自然降解，称为“落黄”1.。由于烟草叶片一般是由下至上逐层落黄
2.，正常烟草植株需要一个多月的时间从底部至顶部叶片依次变黄，进行3～5次采收，极大地增加了烟草生产的工作量。因此，改善烟叶成熟期，提高烟叶的集中成熟度对于减少烟叶采收、烘烤等生产环节的用工量具有重要的意义。而烟草质体色素(叶绿素，类胡萝卜素等)在烟草的调制加工过程中会发生降解，色素降解速率快、降解量大、残存色素量低的品种烘烤过程中烟叶变黄快，烤后黄烟率高、青烟率低，易烤性好
3.。此外，质体色素的降解会产生很多挥发性香气物质(如叶绿素降解会产生新植二烯)，这些烟草中致香成分的种类及含量的不同对烟草的香气质和香气量具有显著的影响，进而影响到烟草的吸食品质
4.。
3.烟草中常见的叶色突变类型有白肋型、黄叶型、黄绿型和紫色型等
5.。其中，白肋型烟草叶绿素含量受两对连锁的隐性核基因控制
6.；黄叶型突变性状由两对独立遗传的隐性核基因控制
7.；黄绿型突变受一对隐性基因控制
8.；而紫色型突变体是由b染色体上的显性基因“r”调控
9.。但是，目前关于烟草集中落黄烟草突变体的遗传规律及相关调控基因的研究目前还未见报道。
4.参考文献
5.[1]严希.烟草黄叶突变体的光合特性及小分子代谢物分析[d].贵州大学,2015.
[0006]
[2]杨铁钊.烟草育种学[m].北京:中国农业出版社,2003:47-48.
[0007]
[3]王传义.不同烤烟品种烘烤特性研究[d].中国农业科学院,2008.
[0008]
[4]韩富根.烟草化学[m].北京:中国农业出版社,2010:102-105.
[0009]
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[0011]
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[0012]
[8]孙明铭,蒋彩虹,罗朝鹏,杨军,张剑锋,蒲文宣,刘万峰,杨爱国,程立锐.烟草黄绿叶突变体的遗传分析与基因定位[j].植物遗传资源学报,2018,19(05):942-950.
[0013]
[9]杨铁钊.烟草育种学[m].北京:中国农业出版社,2017:53-54.


技术实现要素：

[0014]
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种与烟草成熟期集中落黄性状相关的snp标记分子和应用。
[0015]
本发明提供了一种与烟草成熟期集中落黄性状相关的snp标记分子，所述snp标记分子的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述核苷酸序列的第160位存在a/t多态性位点。
[0016]
本发明提供了一种用于扩增所述snp标记分子的引物对，包括核苷酸序列如seq id no:2所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:3所示的反向引物。
[0017]
本发明提供了所述snp标记分子或所述引物对在培育集中落黄烤烟品种中的应用。
[0018]
优选的，所述集中落黄烤烟品种的培育方法包括对各烤烟子代进行分子鉴定；
[0019]
所述分子鉴定的方法，包括以下步骤：
[0020]
1)采用所述引物对对各烤烟子代进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；
[0021]
2)对步骤1)所述pcr扩增产物判断基因型，当pcr产物第160位碱基的基因型为aa或at时，表明所述烤烟子代具有成熟期集中落黄性状，否则不具有成熟期集中落黄性状。
[0022]
优选的，所述pcr扩增的反应体系如下：2
×
dream taq green pcr mastermix 10μl、10μm上游引物1μl、10μm下游引物1μl、100～200ngdna模板、双蒸水补至20μl；
[0023]
所述pcr扩增的反应条件如下：94℃预变性5min、94℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸20s，30个循环；最后72℃延伸5min。
[0024]
本发明提供了一种利用所述snp标记分子辅助筛选集中落黄烤烟品种的方法，包括以下步骤：
[0025]
1)以k326为母本，以突变体pync95为父本杂交，获得的f1杂交种子；
[0026]
2)所述f1杂交种子种植后所得植株为亲本，以k326为轮回亲本，配置bc1f1分离群体；
[0027]
3)采用所述snp标记分子对所述bc1f1分离群体进行分子鉴定，筛选含有at基因型并且长势长相偏向轮回亲本k326的植株继续与k326回交，获得bc2f1分离群体；
[0028]
4)以bc2f1分离群体为初始材料，按照步骤3)的培育方法连续回交5次，得到遗传背景基本恢复到k326且携带目标基因型的bc6f1单株个体；
[0029]
5)将步骤4)中所述bc6f1单株个体种子种植后，进行自交，获得bc6f2种子，将bc6f2种子种植后，采用权利要求1所述snp标记分子对所述bc6f2分离群体进行分子鉴定，筛选含有aa基因型的纯合单株进行自交，培育得到集中落黄烤烟品种。
[0030]
本发明提供了一种与烟草成熟期集中落黄性状相关的snp标记分子，所述snp标记分子的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述核苷酸序列的第160位存在a/t的多态性位点。本发明以成熟期集中落黄突变体为材料，通过重测序和连锁标记定位分析，获得了与烟草成熟期集中落黄基因ntpy紧密连锁的snp分子标记。所述snp标记分子位于11号染色体上，通过分子鉴定，基因型为aa或at的烟草植株具有成熟期集中落黄性状。因此基于所述snp分子标记进行辅助育种，培育了烟草成熟期集中落黄k326新品系。
[0031]
由于我国的烟叶实行分级制销售，一株烟分部位和成熟度需要采摘五六次，使得农机很难适应，难以实现全自动机械化。而人工多次采收，劳动量大、成本高，而且效率低。与国外烟叶采收时不分等级，一次性采收后成堆烘烤，高度机械化有很大差距。因此，需要
打通烟草生产全程机械化“最后一公里”，促进降工减本、提质增效。本发明利用与烟叶成熟期紧密连锁的分子标记培育的烟草集中落黄新品种，可实现1～2次集中采收，大大缩短烟叶收获期、减轻劳动强度，降低生产成本，同时有助于烟叶机械化采摘技术的推广。
附图说明
[0032]
图1为突变体材料py和对照植株和叶片表型
[0033]
图2为苗期和旺长期，近等基因系ck1、nil1，ck2、nil2其叶绿素总量、叶绿素a、b及类胡萝卜素的含量分析
[0034]
图3为成熟期时(第一次采收)，近等基因系ck1、nil1，ck2、nil2其叶绿素总量、叶绿素a、b及类胡萝卜素的含量分析；
[0035]
图4为烟草成熟期集中落黄基因ntpy连锁标记分析；
[0036]
图5为2020年湖南浏阳pyk326新品系和对照k326叶绿素相对含量spad值的动态变化及田间表型；apyk326新品系和对照k326上部烟叶叶绿素相对含量spad值；b pyk326新品系和对照k326中部烟叶叶绿素相对含量spad值；c pyk326新品系和对照k326下部烟叶叶绿素相对含量spad值；
[0037]
图6为打顶后第4天pyk326新品系与对照k326田间落黄情况。
具体实施方式
[0038]
本发明提供了一种与烟草成熟期集中落黄性状相关的snp标记分子，所述snp标记分子的核苷酸序列如seq id no:1(acctctgccttcctgtgataccatattgaagtgtgtgaccatctcataaaaaatcttaaactttcaaagaaaacatactttttatttactaaattatgtcttagatacagtaatattcttgggctgcttataagtgatgtgctctaaaatatacagaattctacatgtctacatcagaagttctagtatattcaacatacaaacttcaatcagtcaagcgcctcatatttcctaattagttgagagtgactatatgaaattgctctcatcttgtactattttaactattaactttttaatcagtccaaccaaacaacccttaaacgttaaaatattgtccaaataaatgattttataccacataaagcctggtcca)所示，所述核苷酸序列的第160位存在a/t的多态性位点。在本发明中，所述snp标记分子位于烟草11号染色体上，与ntpy基因紧密连锁。
[0039]
本发明提供了一种用于扩增所述snp标记分子的引物对，包括核苷酸序列如seq id no:2(acctctgccttcctgtga)所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:3(tggaccaggctttatgtg)所示的反向引物。本发明对所述引物对的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物对合成方法即可。在本发明实施例中，所述引物对委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0040]
本发明提供了所述snp标记分子或所述引物对在培育集中落黄烤烟品种中的应用。
[0041]
在本发明中，所述集中落黄烤烟品种的培育方法，优选包括以下步骤：
[0042]
1)采用所述引物对对各烤烟子代进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；
[0043]
2)对步骤1)所述pcr扩增产物判断基因型，当pcr产物第160位碱基的基因型为aa或at时，表明所述烤烟子代具有成熟期集中落黄性状，否则不具有成熟期集中落黄性状。
[0044]
在本发明中，所述pcr扩增的反应程序优选如下：2
×
dream taq green pcrmastermix 10μl、10μm上游引物1μl、10μm下游引物1μl、100～200ng dna模板、双蒸水补
至20μl。所述pcr扩增的反应体系优选如下：所述pcr扩增的反应条件如下：94℃预变性5min、94℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸20s，30个循环；最后72℃延伸5min。得到pcr产物后，优选进行测序，得到测序结果。当烤烟子代中第160位脱氧核糖核苷酸为a的纯合体或杂合体(基因型为aa或at)表示该烤烟子代具有成熟期集中落黄性状，作为选择对象结合其他选择标准继续培育；当pcr产物第160位脱氧核糖核苷酸为t的纯合体(基因型为tt)，表示该烤烟子代不具有成熟期集中落黄性状，不作为选择对象，淘汰该烤烟子代。
[0045]
本发明提供了一种利用所述snp标记分子辅助筛选成熟期集中落黄易烘烤烤烟品种的方法，包括以下步骤：
[0046]
1)以k326为母本，以突变体pync95为父本杂交，获得的f1杂交种子；
[0047]
2)所述f1杂交种子种植后所得植株为亲本，以k326为轮回亲本，配置bc1f1分离群体；
[0048]
3)采用所述snp分子标记对所述bc1f1分离群体进行分子鉴定，筛选含有aa或at基因型并且长势长相偏向轮回亲本k326的植株继续与k326回交，获得bc2f1分离群体；
[0049]
4)以bc2f1分离群体为初始材料，按照步骤3)的培育方法连续回交5～6次，得到遗传背景基本恢复到k326且携带目标基因型的bc6f1单株个体；
[0050]
5)将步骤4)中所述bc6f1单株个体种子种植后，进行自交，获得bc6f2种子，将bc6f2种子种植后，采用权利要求1所述snp标记分子对所述bc6f2分离群体进行分子鉴定，筛选含有aa基因型的纯合单株进行自交，培育得到集中落黄烤烟品种。
[0051]
在本发明中，所述分子鉴定的方法同上述集中落黄易烘烤烤烟品种的培育方法，在此不做赘述。所述突变体pync95是以突变体py为供体亲本，nc95为轮回亲本，回交6代后自交得到的纯合材料。
[0052]
在本发明中，一年内优选杂交两次，分别在春季和冬季进行杂交。在本发明实施例中，自2014年春开始培育，在春季杂交后，收获子代种子在冬季再次回交，收获回交分离群体，在2015年春经过分子鉴定后，选择具有目标基因型和种植后长势长相偏向轮回亲本k326的单株与k326进行回交，所得子代在2015年冬季经过所述分子鉴定后，按照上述选择标准重复回交，经过2016年和2017年重复2015年的选育操作，2017年冬经过分子鉴定的单株遗传背景基本恢复到k326，得到携带目标基因型的单株bc6f2，经过自交，得到集中落黄易烘烤烤烟新品种，田间系谱编号命名为pyk326。
[0053]
在本发明中，对培育的集中落黄品种进行验证。所述验证优选包括叶绿素相对含量测定。结果表明，pyk326新品系叶绿素相对含量上部烟叶》中部烟叶》下部烟叶，因此仍然是下部烟叶先落黄，其次是中部烟叶，最后是上部烟叶，符合生产上对烟叶要求。由于打顶后pyk326新品系叶绿素相对含量低于对照k326，因此，相比对照k326，pyk326新品系成熟时期落黄更集中，适宜2～3次采收。
[0054]
下面结合实施例对本发明提供的一种与烟草成熟期集中落黄性状相关的snp标记分子和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0055]
实施例1
[0056]
烟草成熟期集中落黄特性相关基因定位及其紧密连锁的snp标记开发一、试验材料构建
[0057]
试验亲本突变体pale yellow(py)、烤烟品种nc95、晾晒烟ky171由国家烟草种质
资源库提供。以突变体py为供体亲本，nc95为轮回亲本(图1)，回交5代后自交得到纯合材料pync95；以突变体py为供体亲本，ky171为轮回亲本，回交5代后自交得到纯合材料pyky171。构建nc95、pync95(ck1；nil1)和ky171、pyky171(ck2；nil2)两对近等基因系，用于基因定位，具体方法如下。
[0058]
试验分别在中国农业科学院烟草研究所即墨试验基地温室和山东省诸城市洛庄试验基地大田进行，按照规范化标准管理种植。样品于3月份播种到温室的苗盘中，待幼苗长到两叶一心时进行假植，移入假植盘。当长到5片真叶的时候，取长势一致的烟苗移入大田，单垄种植，行距1m，株距0.5m，每个材料种植30～40株，栽培土壤ph为5.56，有机质含量为11.66g/kg，碱解氮含量为52.69mg/kg，速效钾含量为105.25mg/kg，并进行正常的大田管理。
[0059]
二.叶绿素突变体近等基因系质体色素含量测定
[0060]
烟草的主要生长发育过程划分为假植期、团棵期、旺长期、现蕾期和成熟期(参照中华人民共和国烟草行业标准(yc/t142-1998)《烟草农艺性状调查方法》)。分别在这几个时期测定烟草叶片的质体色素含量，每个材料作三次重复。测定方法如下：
[0061]
取特定时期新鲜烟叶下部叶(第4片)、中部叶(第10片)、上部叶(第16片)的叶片，擦净组织表面污物，用剪刀将叶片剪成1mm
×
1mm的小片(去除叶脉)，混匀。
[0062]
每份样品称取0.2g放入25ml容量瓶中，浓度为95％的乙醇溶液20ml，放在黑暗条件下，浸泡至叶片发白，用浸提试剂定容至25ml，摇匀备用。
[0063]
使用岛津shimadzuli-6400分光光度计分别测定质体色素浸提液在665nm、649nm、470nm波长下的吸光度值。
[0064]
通过公式i～iv分别计算烟草叶片中的叶绿素a(chla)、叶绿素b(chlb)以及类胡萝卜素(car)含量，整个叶片的质体色素含量为叶片尖端，叶片中部和叶片基部三个部位色素含量的平均值，随后可以进一步计算得到总叶绿素含量及叶绿素与类胡萝卜素的比值。以上数据的计算与分析采用excel2013及dps7.05分析软件。质体色素含量计算公式如下：
[0065]
叶绿素a的含量(mg/g)＝(13.95a665-6.88a649)
×
v/(1000
×
w)
ꢀꢀ
公式i
[0066]
叶绿素b的含量(mg/g)＝(24.96a649-7.32a665)
×
v/(1000
×
w)
ꢀꢀ
公式ii
[0067]
叶绿素总含量(mg/g)＝叶绿素a的含量+叶绿素b的含量
ꢀꢀꢀ
公式iii
[0068]
类胡萝卜素的含量(mg/g)＝(1000
×
a470-2.05
×
((13.95a665-6.88a649)
×
v/(1000
×
w))-114.8
×
((24.96a649-7.32a665)
×
v/(1000
×
w)))
×
v/(1000
×w×
245)
ꢀꢀꢀ
公式iv。
[0069]
结果表明，烟草叶片中的质体色素含量随着烟草生长发育呈现一种先上升后下降的趋势，在旺长期质体色素含量最高，现蕾期以后质体色素含量开始逐渐下降。两对近等基因系ck1、nil1、ck2、nil2比较分析，发现两组样品在烟草的假植期、团棵期、旺长期及现蕾期，其叶绿素总量、叶绿素a、b的含量及类胡萝卜素的含量的统计结果未显示其有显著差异性(图2)。
[0070]
在烟草叶片进入成熟期以后，两组样品的上、中、下部叶位，其叶片的质体色素含量相比成熟期以前均有降低。将成熟期的ck1与nil1，ck2与nil2的上、中、下三个不同叶位的叶片的质体色素含量做显著性差异分析，分析结果显示，质体色素含量有极显著差异，与对照ck1及ck2相比，nil1及nil2的质体色素含量都有显著降低，叶绿素含量甚至能够降至
对照样品的50％左右(图3)。该研究结果表明，在烟叶的成熟期以前，对照ck1及ck2相比，nil1及nil2植株叶片的叶绿素含量和类胡萝卜素的含量没有显著性差异，但是在成熟期，nil1及nil2的上部叶、中部叶、下部叶中的叶绿素含量和类胡萝卜素的含量都显著高于ck1及ck2的植株叶片中叶绿素含量和类胡萝卜素含量。
[0071]
三、近等基因系重测序
[0072]
1.构建测序文库
[0073]
委托诺禾致源构建包含不同dna片段的基因文库，用于近等基因系的重测序，具体步骤如下：
[0074]
(1)提取突变体py、nc95、pync95、ky171、pyky171基因组dna，通过测量dna浓度以及琼脂糖凝胶电泳检测dna的质量。
[0075]
(2)将检测合格的dna使用超声打断法随机打断，使用高保真dna聚合酶进行末端修复以满足连接接头的需要。
[0076]
(3)电泳回收所需长度的dna片段，加上接头进行cluster制备，并通过进一步纯化、pcr扩增完成测序文库的构建。
[0077]
2.测序及测序数据信息分析
[0078]
文库经质检合格之后在hiseq 2000上机测序，对近等基因系nc95、pync95、ky171、pyky171以及突变体py进行20x左右的全基因组重测序。将测序原始数据过滤得到高质量数据reads用bwa(http://bio-bwa.sourceforge.net/)软件与烟草参考基因组序列进行比对。使用picart-tools(http://sourceforge.net/projects/picard/)对比对结果合并和去冗杂。使用soapsnp软件检测snp，通过过滤得到高质量的snp。首先将nc95和pync95之间产生的连续snp区段与ky171和pyky171之间产生的连续snp区段进行比较；然后将共有的snp区段与突变体py的基因型进行比较，筛选与突变体py的基因型一致的snp区段，即为候选的突变基因导入片段。
[0079]
烟草灰黄叶突变体nc95和pync95，ky171和pyky171以及原始突变体py分别进行20x左右的全基因组重测序，通过过滤后共获得高质量数据463g，每个样品平均测序深度超过20x(表1)。测序共获得2,946,603个snp位点。将两对近等基因系nc95与pync95，ky171与pyky171的snp位点进行比较，分别存在15412和39443个snp位点。通过筛选，在11号连锁群发现了两对近等基因系共有的较连续snp差异位点，其中有3.5mb基因组序列完全来自突变体，锁定为突变基因候选区域。
[0080]
表1近等基因系与参考基因组比对结果
[0081]
[0082]
四、snp分子标记的开发与精细定位
[0083]
根据近等基因系重测序结果所得到的snp差异位点，在11号染色体3.5m b区域序列内间隔设计了20对snp引物。首先对亲本nc95、突变体材料py进行pcr扩增，并使用琼脂糖凝胶电泳与测序进行筛选。在bc7f2群体中挑选812株与nc95表型一致的材料作为定位的群体，用获得的在亲本中具有多态的有效snp引物对群体单株进行基因分型，以确定与ntpy基因紧密连锁的标记。结果发现，ntpy基因与snp标记snp-462476、snp-660961、、snp-866762与snp-1110634连锁，其中标记snp-462476、snp-660961分布ntpy两侧，与基因紧密连锁(图4)。标记序列信息见表2。
[0084]
表2分子标记扩增用引物信息
[0085][0086]
实施例2
[0087]
集中落黄烤烟新品种培育方法
[0088]
利用特性前述定位的与烟草成熟期集中落黄紧密连锁的分子标记snp-660961(pcr产物376bp)，以k326为轮回亲本，多次回交后获得集中落黄新品系，在保持其他性状没有明显差异情况下，在成熟后期田间表现为集中落黄，可2～3次采收。
[0089]
具体培育过程如下：
[0090]
2014年春季，以k326为母本，突变体pync95为父本配置杂交组合，获得f1杂交种子；2014年冬季，在温室以k326为轮回亲本，配置bc1f1分离群体。
[0091]
2015年春季，利用与ntpy基因紧密连锁的分子标记snp-660961对bc1f1分离群体进行分子鉴定，筛选含有目标区段基因型(含目标区段是指snp-660961标记pcr产物第160位脱氧核糖核苷酸为a的纯合体或杂合体(基因型为aa或at)，不含目标区段是指snp-660961标记pcr产物第160位脱氧核糖核苷酸为t的纯合体，基因型为tt)，并且大田种植后长势长相偏向轮回亲本k326的单株继续与k326回交，获得bc2f1。2015年冬季，播种bc2f1代种子，重复开展分子标记snp-660961辅助选择方法，进行目标区段基因型选择(含目标区段是指snp-660961标记pcr产物第160位脱氧核糖核苷酸为a的纯合体或杂合体(基因型为aa或at)，不含目标区段是指snp-660961标记pcr产物第160位脱氧核糖核苷酸为t的纯合体，基因型为tt)，同时选择田间长势长相偏向轮回亲本k326单株与k326回交，获得bc3f1。
[0092]
2016年春季，种植bc3f1，重复开展分子标记辅助选择方法，进行目标区段基因型选择，同时选择田间长势长相偏向轮回亲本k326的单株与k326回交，获得bc4f1。2016年冬季，种植bc4f1，继续利用分子标记snp-660961对bc4f1分离群体进行目标区段基因型选择，获得携带目标区段且遗传背景尽可能恢复到k326的单株个体，继续与k326回交，获得bc5f1。
[0093]
2017年春季，种植入选的bc5f1，继续利用分子标记snp-660961对bc5f1分离群体进行目标区段基因型选择，获得携带目标区段且遗传背景尽可能恢复到k326的单株个体，继续与k326回交，获得bc6f1。2017年冬季，种植入选的bc6f1，重复开展分子标记和常规育种方法相结合的选择携带目标区段的单株自交，获得bc6f2种子。种植bc6f2，结合分子标记snp-660961选择，最终确定遗传背景基本恢复到k326且携带目标区段的纯合单株，进一步自交纯合，最终培育集中落黄易烘烤新品系，田间系谱编号pyk326。
[0094]
2018-2019年先在四川西昌、山东诸城、安徽宣城进行多点小区试验，结果显示，pyk326田间表现整齐、长势强，其大田生育期、长势长相、主要植物学性状和农艺性状与对照k326基本一致。后期成熟时间提前一周，表现为集中落黄。
[0095]
2020年对pyk326新品系和对照k326在湖南浏阳产区进行小区试验，打顶后叶绿素相对含量进行了测定。
[0096]
结果表明，烟叶打顶之前，k326与pyk326新品系上部烟叶、中部烟叶和下部烟叶，其叶绿素相对含量没有显著性差异；打顶后第4天至第18天(下部烟叶打顶后10天采收)，pyk326新品系与k326上部烟叶的叶绿素相对含量没有显著性下降和差异，中部烟叶和下部烟叶的叶绿素相对含量都呈现缓慢下降趋势，且pyk326新品系中叶绿素相对含量明显低于对照k326，但是差值基本保持不变。pyk326新品系中部烟叶的叶绿素相对含量比对照k326低约5个spad值，pyk326新品系下部烟叶中叶绿素相对含量比对照k326低约7个spad值(图5)。
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pyk326新品系，烟叶打顶之前叶绿素相对含量与对照没有明显差异，因此能够正常进行光合作用、植株生长发育和物质积累。烟叶打顶之后，pyk326新品系叶绿素相对含量是一个缓慢改变的过程，既能维持植株成熟后期所需光合作用，又能加速叶片成熟落黄。此外，pyk326新品系叶绿素相对含量上部烟叶》中部烟叶》下部烟叶，因此仍然是下部烟叶先落黄，其次是中部烟叶，最后是上部烟叶，符合生产上对烟叶要求。由于打顶后pyk326新品系叶绿素相对含量低于对照k326。因此，相比对照k326，pyk326新品系落黄更集中，成熟时间短于对照，适宜2～3次采收(图6)。
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以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。