一种提高淡紫链霉菌海南变种产中生菌素效价的方法与流程

1.本发明属于农药领域，具体涉及一种提高淡紫链霉菌海南变种产中生菌素效价的方法。


背景技术：

2.中生菌素（zhongshengmycin）又名农抗751菌素、链丝菌素，属n-糖苷类抗生素。中生菌素有效成分为链丝菌素（streptothricins）f，是由waksman等于1942年从streptomyces lavendulae中分离到的；随后，链丝菌素的其它组分(链丝菌素 a、b、c、d、e和x)也相继被发现，其各组分的结构中均包含一分子古洛糖胺、一分子链里定内酰胺和数量不等的 β-赖氨酸。中国农业科学院生物防治研究所首次从海南土壤中分离得到并命名淡紫链霉菌海南变种。中生菌素抗菌谱广，能抗革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、分枝杆菌、酵母菌及丝状真菌等，对昆虫也有一定的杀灭作用。其杀菌机理是能够抑制polyu引导的多肽合成，并能导致蛋白翻译中的错读，使细菌不能合成蛋白质而死亡。中生菌素在农业上防治细菌性病害有广普性，如对猕猴桃的溃疡病、黄瓜细菌性角斑病和霜霉病、番茄细菌性斑疹病和叶霉病、西瓜细菌性角斑病、苹果斑点落叶病和褐斑病、梨黑星病、葡萄霜霉病、白粉病和黑痘病、柑橘溃疡病等。由于具有显著且直接杀菌作用，因此产生中生菌素的链霉菌在自然界比较容易被发现并分离得到，如秦岭链霉菌（streptomyces qinlingnensis sp. nov）等多个链霉菌均能产生中生菌素。在国内，中生菌素原料药生产是通过淡紫链霉菌海南变种发酵获得的，如何提高中生菌素发酵过程中的生产效价，是生产企业亟需解决关键技术问题。


技术实现要素：

3.为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种提高淡紫链霉菌海南变种产中生菌素效价的方法，通过在淡紫链霉菌海南变种产中生菌素的发酵培养基依次添加沼泽红假单胞菌滤膜处理液、松树叶、刺五加和虎杖蒸煮液，有效底提高了淡紫链霉菌海南变种产中生菌素的效价，也进一步提高了中生菌素原料的含量。
4.为了实现发明目的，本发明采用如下技术方案：一种提高淡紫链霉菌海南变种产中生菌素效价的方法，包括以下步骤：（1）配制沼泽红假单胞菌培养液培养沼泽红假单胞菌更为具体的，沼泽红假单胞菌培养基配方：谷氨酸钠0.169g；k2hpo4，0.05g；kh2po4，0.05g；乙二胺四乙酸二钠，0.02g；mgso4·
7h2o，0.02g；nacl，0.1g；cacl2，0.008g；，naac 4g；生长因子，1-2ml；微量元素，1-2ml；蒸馏水，96-98ml；ph调节为7.0；更为具体的，生长因子组成如下：维生素b1，0.0005-0.002mg；尼克酸0.05-0.25mg；对氨基苯甲酸，0.05-0.3mg；生物素，0.0005-0.002mg；蒸馏水1000ml；过滤除菌；更为具体的，微量元素组成如下：
fecl3·
6h2o 4-10mg；cuso4·
6h2o 0.01-0.09mg；h3bo4，0.5-1.5mg；mncl2·
4h2o，0.01-0.09mg；znso4·
7h2o，0.5-1.5mg；co(no3)
·
6h2o，0.1-0.9mg；蒸馏水1000ml；过滤除菌；更为具体的，配置方法为：按配比称取所需原料，然后加入适量蒸馏水，在加热条件下搅拌溶解，待其全部溶解后取出，放在室温环境下冷却后，加入生长因子和微量元素各1-2ml调节溶液的ph至7.0，再灭菌后，放入4℃的环境下保存备用；（2）培养沼泽红假单胞菌，培养条件为：用低温保存的培养基接种沼泽红假单胞菌，在室温下培养，采用4500-5000lx的光照强度，在培养过程中，每天的光照环境24小时，培养5-7d，沼泽红假单胞菌最高浓度为1.05-1.50
×
10
9 cell/ml；（3）当培养的沼泽红假单胞菌最高浓度为1.05-1.50
×
10
9 cell/ml时，收集沼泽红假单胞菌，超声破碎沼泽红假单胞菌，超声频率为20-40khz，功率为1-4.0kw，超声时间为30-60min，然后0.22μm微孔滤膜过滤，得到沼泽红假单胞菌滤膜处理液；（4）配置淡紫链霉菌海南变种发酵培养基更为具体的，淡紫链霉菌海南变种发酵培养基的配方为：可溶性淀粉（ar）1.0%、mgso4·
7h2o（ar）0.045%、kh2po4（ar）0.10%、kcl（ar）0.045%、nano3（ar）0.125%、feso4·
7h2o（ar）0.001%，其余是蒸馏水，ph6.8-7.0，经高温消毒配置；（5）上述步骤（3）的沼泽红假单胞菌滤膜处理液添加步骤（4）的淡紫链霉菌海南变种发酵培养基中去，作为淡紫链霉菌海南变种发酵培养基备用。
5.在本发明的优选的实施方式中，步骤（1）中，沼泽红假单胞菌培养基配方：谷氨酸钠0.169g；k2hpo4，0.05g；kh2po4，0.05g；乙二胺四乙酸二钠，0.02g；mgso4·
7h2o，0.02g；nacl，0.1g；cacl2，0.008g；，naac 4g；生长因子，1ml；微量元素，1ml；蒸馏水，98ml；ph值用磷酸调节为7.0。
6.在本发明的优选的实施方式中，步骤（3）中，超声频率为30khz，功率为2.0kw，超声时间为40min。
7.在本发明的优选的实施方式中，步骤（4）的淡紫链霉菌海南变种发酵培养基与步骤（3）的沼泽红假单胞菌滤膜处理液的体积比为12.5-50：1，优选为25:1。
8.在本发明的优选的实施方式中，步骤（5）中，在配置的溶液中添加松树叶、刺五加叶和虎杖蒸煮过滤液，按质量百分比计为，松树叶：刺五加叶：虎杖=4:4:1～20:20:1，其中松树叶、刺五加叶与虎杖物质水分含量低于30%。
9.在本发明的优选的实施方式中，松树叶、刺五加叶和虎杖蒸煮液的制备方法如下：1l蒸馏水添加松树叶、五加叶、虎杖量为20g、20g和5g粉末物，然后高温高压蒸煮熬制，熬制液经10000rmp超速离心10min 获得上清液，将上清液添加到步骤（4）的淡紫链霉菌海南变种发酵培养基中去，作为淡紫链霉菌海南变种发酵培养基备用。
10.在本发明的优选的实施方式中，高温高压蒸煮时，压强为1.5mpa，温度100℃，时间1.5h。
11.在本发明的优选的实施方式中，淡紫链霉菌海南变种发酵培养基与松树叶、刺五加叶及虎杖蒸煮过滤液体积比12.5-100:1，优选为50:1。
12.在本发明的优选的实施方式中，淡紫链霉菌海南变种发酵培养基，沼泽红假单胞菌滤液和松树叶、刺五加叶及虎杖蒸煮过滤液的体积比为100:1:1～100:5:2，优选为50:1:
1。
13.与现有技术相比，本发明通过在淡紫链霉菌发酵培养基依次添加一定量的沼泽红假单胞菌滤膜处理液和添加松树叶、刺五加叶和虎杖蒸煮处理液，有效的提高了淡紫链霉菌产中生菌素的生物效价，也进一步提高中生菌素原料药生产企业效率。
附图说明
14.下面结合附图做进一步的说明：图1为本发明的沼泽红假单胞菌培养装置；其中，白炽灯（1）；反应瓶（2）； 磁力搅拌器(3)；温度控制器(4)；产气收集筒(5)；玻璃水箱(6)。
15.图2为中生菌素标准品的高效液相色谱；其中，1为中生菌素f，2为中生菌素e，3为中生菌素d，4为中生菌素c，5为中生菌素b。
16.图3为中生菌素发酵液的高效液相色谱；其中，1为中生菌素f，2为中生菌素e，3为中生菌素d，4为中生菌素c，5为中生菌素b。
具体实施方式
17.下面结合实施例用于说明本发明作进一步详细的描述，但不用来限制本发明的范围。
18.采用本发明的一种提高淡紫链霉菌海南变种产中生菌素效价的方法，包括以下步骤：（1）配制沼泽红假单胞菌培养液培养沼泽红假单胞菌沼泽红假单胞菌培养基配方：谷氨酸钠0.169g；k2hpo4，0.05g；kh2po4，0.05g；乙二胺四乙酸二钠，0.02g；mgso4·
7h2o，0.02g；nacl，0.1g；cacl2，0.008g；，naac 4g；生长因子，1ml；微量元素，1ml；蒸馏水，98ml；磷酸调节ph值为7.0。
19.①
生长因子组成如下：维生素b1，0.0005-0.002mg；尼克酸0.05-0.25mg；对氨基苯甲酸，0.05-0.3mg；生物素，0.0005-0.002mg；蒸馏水1000ml；过滤除菌；
②
微量元素组成如下：fecl3·
6h2o 4-10mg；cuso4·
6h2o 0.01-0.09mg；h3bo4，0.5-1.5mg；mncl2·
4h2o，0.01-0.09mg；znso4·
7h2o，0.5-1.5mg；co(no3)
·
6h2o，0.1-0.9mg；蒸馏水1000ml；过滤除菌；配置方法为：按配比称取所需原料，然后加入适量蒸馏水，在加热条件下搅拌溶解，待其全部溶解后取出，放在室温环境下冷却后，加入生长因子和微量元素各1-2ml调节溶液的ph至7.0，再灭菌后，放入4℃的环境下保存备用。
20.（2）培养条件：用低温保存的培养基接种沼泽红假单胞菌，在室温下培养，采用4500-5000lx的光照强度，在培养过程中，每天的光照环境和黑暗环境各占10-14小时，培养5-7d，沼泽红假单胞菌最高密度为1.05-1.50
×
10
9 cell/m l。
21.（3）当培养沼泽红假单胞菌为1.25
×
10
9 cell/ml，收集沼泽红假单胞菌，超声破碎沼泽红假单胞菌，超声频率为30khz，功率为2kw，超声时间为40min，然后0.22μm微孔滤膜过滤，得到沼泽红假单胞菌滤膜处理液。
22.（4）淡紫链霉菌海南变种发酵培养基配方：可溶性淀粉（ar）1.0%、mgso4·
7h2o（ar）0.045%、kh2po4（ar）0.10%、kcl（ar）0.045%、nano3（ar）0.125%、feso4·
7h2o（ar）0.001%，其余是蒸馏水，ph6.8-7.0，经高温消毒配置。
23.（5）上述步骤（3）的沼泽红假单胞菌滤膜处理液添加步骤（4）的淡紫链霉菌海南变种发酵培养基中去，作为淡紫链霉菌海南变种发酵培养基备用。
24.在配置的溶液中添加松树叶、刺五加叶和虎杖蒸煮液，1l蒸馏水添加松树叶、刺五加叶、虎杖量为20g、20g和5g粉末物，然后高温高压蒸煮熬制（压强为1.5mpa，温度100℃，时间1.5h），熬制液经10000rmp超速离心10min 获得上清液，将上述上清液添加步骤（4）的淡紫链霉菌海南变种发酵培养基中去，作为淡紫链霉菌海南变种发酵培养基备用。
25.通过实施例一至三，分别考察沼泽红假单胞菌超声过滤液，松树叶、刺五加叶和虎杖对淡紫链霉菌海南变种发酵时的生产效价的影响，以及综合考察沼泽红假单胞菌超声过滤液及松树叶、刺五加叶和虎杖蒸煮过滤液对淡紫链霉菌海南变种发酵时的生产效价的影响。
26.实施例一：为了考察沼泽红假单胞菌滤液对淡紫链霉菌海南变种发酵时生产效价的影响，本实施例对淡紫链霉菌采用三级发酵工艺，其三级发酵设备购置南京天汇生物科技有限公司，零级发酵罐总体积为5l，一级发酵罐体积为30l，三级发酵罐体积为50l，每个发酵罐安装消毒的空气导管、消毒空气由小型空气压缩机产生并由导管输入至发酵罐（装有空气流量计），消毒罐体的水蒸气由蒸汽发生器产生并由导管输入至发酵罐（中间装有电磁阀、蒸汽计量计），每个发酵罐装有实时监控溶解氧、ph、温度、转速、补料、消泡和补酸碱系统。各级发酵罐淡紫链霉菌海南变种的发酵培养基：可溶性淀粉（ar）1.0%、mgso4·
7h2o（ar）0.045%、kh2po4（ar）0.10%、kcl（ar）0.045%、nano3（ar）0.125%、feso4·
7h2o（ar）0.001%，其余是蒸馏水1l，ph6.8-7.0，经高温消毒备用。当淡紫链霉菌海南变种发酵培养基体积与沼泽红假单胞菌滤液添加量体积比依次为1:100、1:50、1：25和12.5:1时，考察沼泽红假单胞菌滤液对淡紫链霉菌海南变种发酵时的生产效价的影响，批次接种量为发酵体积的10～15%，零级发酵时间为24h，一级发酵时间24h和二级发酵时间为84h。二级罐发酵84h后的发酵液经12000rmp超速离心30min的上清液依次经陶瓷膜过滤(膜平均孔径0.1μm，跨膜压0.2-0.3mpa)，过滤液再次经纳滤膜过滤（截留分子量500以上的纳滤膜），截留液经喷雾干燥塔制得中生菌素粗粉。对零级、一级和二级不同时段的发酵液经15000rmp超速离心15min后，去上清液经0.22μm滤膜过滤高效液相色谱测试，其测试方法见表一，测试试剂配置方法见表2，测试步聚如下：a、标准溶液配制分别称取含中生菌素f约0.025g、中生菌素e约0.003g、中生菌素d约0.015g、中生菌素c约0.008g、中生菌素b约0.005g（精确至0.0001g）的中生菌素标样，置于同一50ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，备用。
27.b、试样溶液的配制
称取含中生菌素f约0.025g（精确至0.0001g）的中生菌素试样，置于50ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，用0.45μm滤膜过滤，备用。
28.c、测定在上述条件下，待仪器稳定后，连续注入数针标准溶液，直至相邻两针中生菌素峰面积相对变化小于1.2%后，按照标样溶液，试样溶液，试样溶液，标样溶液的顺序进行测定。
29.d、计算将测得的两针试样溶液以及试样前后两针标样溶液中中生菌素的面积分别进行平均，试样中中生菌素f(e、d、c、b)的质量分数ω1（%）按式（1）计算：式中：ω1（2、3、4、5）――试样中中生菌素f(e、d、c、b)的质量分数（%）；a1――标样溶液中，中生菌素f(e、d、c、b)峰面积的平均值；a2――试样溶液中，中生菌素f(e、d、c、b)峰面积的平均值；m1――中生菌素f(e、d、c、b)标样的质量，单位为克(g)m2――试样的质量，单位为克(g)；ω0――标样中中生菌素f(e、d、c、b)的质量分数（%） 生菌素总组分的计算中生菌素总组分质量分数ω（%）按照式（2）计算：ω=ω1+ω2+ω3+ω4+ω
5 ……
（2）式中：ω――中生菌素总组分的质量分数（%），具体测定结果见表3。
30.表1 测试条件表2 梯度程序
表3 沼泽红假单胞菌滤液对淡紫链霉菌海南变种发酵时生产效价的影响从表3可知，当淡紫链霉菌海南变种发酵培养基体积与沼泽红假单胞菌滤液体积比25:1时，淡紫链霉菌海南变种发酵时的生测效价最高，随着沼泽红假单胞菌滤液添加量增加，淡紫链霉菌海南变种产中生菌素各组分影响并不显著（p》0.05）。
31.实施例二：为了考察淡紫链霉菌海南变种发酵培养基体积+松树叶、刺五加叶和虎杖高温高压蒸煮过滤液联合对淡紫链霉菌海南变种发酵时生产效价的影响，本实施例对淡紫链霉菌
采用三级发酵工艺，其三级发酵设备购置南京天汇生物科技有限公司，零级发酵罐总体积为5l，一级发酵罐体积为30l，三级发酵罐体积为50l，每个发酵罐安装消毒的空气导管、消毒空气由小型空气压缩机产生并由导管输入至发酵罐（装有空气流量计），消毒罐体的水蒸气由蒸汽发生器产生并由导管输入至发酵罐（中间装有电磁阀、蒸汽计量计），每个发酵罐装有实时监控溶解氧、ph、温度、转速、补料、消泡和补酸碱系统。各级发酵罐淡紫链霉菌海南变种的发酵培养基：可溶性淀粉（ar）1.0%、mgso4·
7h2o（ar）0.045%、kh2po4（ar）0.10%、kcl（ar）0.045%、nano3（ar）0.125%、feso4·
7h2o（ar）0.001%，其余是蒸馏水1l，ph6.8-7.0，经高温消毒备用。当上述培养基体积：沼泽红假单胞菌滤液：松树叶、刺五加叶和虎杖（其中1l蒸馏水添加松树叶粉末20g、刺五加叶粉末20g和虎杖研磨粉5g）高温高压蒸煮过滤液体积比依次为100:50:12.5，考察松树叶、刺五加叶和虎杖高温高压蒸煮过滤液对淡紫链霉菌海南变种发酵时的生产效价的影响，批次接种量为发酵体积的10～15%，零级发酵时间为24h，一级发酵时间24h和二级发酵时间为84h。二级罐发酵84h后的发酵液经12000rmp超速离心30min的上清液依次经陶瓷膜过滤(膜平均孔径0.1μm，跨膜压0.2-0.3mpa)，过滤液再次经纳滤膜过滤（截留分子量500以上的纳滤膜），截留液经喷雾干燥塔制得中生菌素粗粉。对零级、一级和二级不同时段的发酵液经15000rmp超速离心15min后，去上清液经0.22μm滤膜过滤高效液相色谱测试，其测试方法和测试试剂配置见上述实施例1，具体结果见表4。
32.表4 松树叶、刺五加叶和虎杖高温高压蒸煮过滤液对淡紫链霉菌海南变种发酵时生产效价的影响
从表4可知，当淡紫链霉菌海南变种发酵培养基体积与松树叶、刺五加叶和虎杖高温高压蒸煮过滤液添加体积比为50:1时，淡紫链霉菌生测效价最高；随着松树叶、刺五加叶和虎杖高温高压蒸煮液体积添加量增加：淡紫链霉菌产中生菌素f组分含量也相继升高。
33.实施例三：为了考察淡紫链霉菌海南变种发酵培养基体积+沼泽红假单胞菌滤液+松树叶、刺五加叶和虎杖高温高压蒸煮过滤液联合对淡紫链霉菌海南变种发酵时生产效价的影响，本实施例对淡紫链霉菌采用三级发酵工艺，其三级发酵设备购置南京天汇生物科技有限公司，零级发酵罐总体积为5l，一级发酵罐体积为30l，三级发酵罐体积为50l，每个发酵罐安装消毒的空气导管、消毒空气由小型空气压缩机产生并由导管输入至发酵罐（装有空气流
量计），消毒罐体的水蒸气由蒸汽发生器产生并由导管输入至发酵罐（中间装有电磁阀、蒸汽计量计），每个发酵罐装有实时监控溶解氧、ph、温度、转速、补料、消泡和补酸碱系统。各级发酵罐淡紫链霉菌海南变种的发酵培养基：可溶性淀粉（ar）1.0%、mgso4·
7h2o（ar）0.045%、kh2po4（ar）0.10%、kcl（ar）0.045%、nano3（ar）0.125%、feso4·
7h2o（ar）0.001%，其余是蒸馏水1l，ph6.8-7.0，经高温消毒备用。当上述培养基体积：沼泽红假单胞菌滤液：松树叶、刺五加叶和虎杖（其中1l蒸馏水添加松树叶粉末20g、刺五加叶粉末20g和虎杖研磨粉5g）高温高压蒸煮过滤液体积比依次为100:50:25～100:25:12.5，考察沼泽红假单胞菌滤液+松树叶、刺五加叶和虎杖高温高压蒸煮过滤液联合对淡紫链霉菌海南变种发酵时的生产效价的影响，批次接种量为发酵体积的10～15%，零级发酵时间为24h，一级发酵时间24h和二级发酵时间为84h。二级罐发酵84h后的发酵液经12000rmp超速离心30min的上清液依次经陶瓷膜过滤(膜平均孔径0.1μm，跨膜压0.2-0.3mpa)，过滤液再次经纳滤膜过滤（截留分子量500以上的纳滤膜），截留液经喷雾干燥塔制得中生菌素粗粉。对零级、一级和二级不同时段的发酵液经15000rmp超速离心15min后，去上清液经0.22μm滤膜过滤高效液相色谱测试，其测试方法和测试试剂配置见上述实施例1，具体结果见表5。
34.表5 同时添加上述两种过滤液对淡紫链霉菌海南变种产中生菌素效价影响
从表5可以看出，当发酵培养基：沼泽红假单胞菌滤液：松树叶+刺五加叶+虎杖蒸煮过滤液体积比为100:5:2时，淡紫链霉菌海南变种产中生菌素效价最高。
35.虽然，上文中已经用了一般性说明，具体实施方式及试验，对本发明做了详细的描述，但在本发明基础上，可以对之作做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此在不偏离本发明的基础上所做的一些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。