一种粪肠球菌穿梭质粒载体及其构建方法和应用

1.本发明属于质粒载体构建技术领域，更具体地，涉及一种粪肠球菌穿梭质粒载体及其构建方法和应用。


背景技术：

2.粪肠球菌是人和动物肠道中的正常菌群，也是一种重要的乳酸菌，具有较好的肠道粘附能力，能产生乳酸及一些抗菌物质，抑制肠道腐败菌、致病菌的繁殖及肠道感染，降低腹泻率，促进营养物质的消化吸收，增强免疫力，提高采食量及饲料转化率，促进动物健康，是畜牧生产及食品工业首选使用的益生菌菌种之一。粪肠球菌表现多种优良性状，其中一个主要原因是含有多种质粒，本实验室从粪肠球菌中分离得到一种质粒，命名为质粒plw4，该质粒具有多种位点和抗性，具有良好的载体特征。
3.pmd20是一种高效克隆pcr产物的专用载体。该载体以puc19载体为基础，在其多克隆位点处的xba i和bamh i位点之间增加了spe i、nde i、ecor v三种酶切位点，经ecor v酶切后再在两侧的3’端添加“t”制备而成。因大部分耐热性dna聚合酶进行pcr反应时都有在pcr产物的3’端添加一个“a”的特性，所以可以大大提高pcr产物的连接、克隆效率。
4.虽然质粒plw4和pmd20均可单独作为载体来使用，但是如果可以将其优点相结合，就可以发挥它们各自的优势，本发明结合质粒plw4和pmd20两方面的优点，利用现代技术构建了一种全新的穿梭质粒载体plwpu01，可以为乳酸菌基因操作提供新工具，便于开展相关基因功能研究和遗传育种工作。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种全新的质粒载体，为乳酸菌基因操作提供新工具，便于开展相关基因功能研究和遗传育种工作。
6.具体地，本发明的第一方面提供一种穿梭质粒载体，该穿梭质粒载体由粪肠球菌质粒plw4与载体pmd20连接构建而成；所述粪肠球菌质粒plwpu01为双链环状 dna 分子，共7415bp，含有6个开放阅读框，gc含量为33.12%。
7.具体地，所述粪肠球菌质粒plw4的核苷酸序列如seq id no：2所示（质粒图谱如图3所示）。
8.最具体地，所述穿梭质粒载体的核苷酸序列如seq id no：1所示（质粒图谱如图2所示）。
9.本发明的第二方面提供一种穿梭质粒载体的构建方法，包括以下步骤：（1）以粪肠球菌质粒plw4为模板，通过引物p1和p2进行pcr，得到线性化plw4质粒，纯化后回收该线性化plw4质粒；p1的核苷酸序列如seq id no：3（5
’‑
atcagcgctataccgttcacgg-3’）所示，p2的核苷酸序列如seq id no：4（5
’‑
ctgctctaggtagcggacagat-3’）所示；（2）用t4连接酶将纯化回收后的线性化plw4质粒和载体pmd20进行连接；
（3）将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞（例如e.coli dh5α感受态细胞），挑取转化子，提取得到所述穿梭质粒载体。
10.本发明的第三方面提供上述穿梭质粒载体的应用。
11.具体地，本发明提供所述穿梭质粒载体在筛选粪肠球菌标记抗性基因构中的应用。
12.本发明所述标记抗性基因筛选是将标记抗性基因连入所述穿梭质粒载体，然后再将得到的载体转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子，最后将阳性转化子转入粪肠球菌，获得具有标记抗性基因的粪肠球菌。
13.具体地，本发明还提供所述穿梭质粒载体在粪肠球菌基因敲除中的应用。
14.本发明所述基因敲除是将标记抗性基因、待敲除基因的同源序列连入所述穿梭质粒载体，然后再将得到的载体转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子，最后将阳性转化子转入粪肠球菌，获得敲除目标基因的粪肠球菌。
15.本发明的有益效果在于：本发明提供的穿梭质粒载体可在大肠杆菌和粪肠球菌中复制。粪肠球菌中遗传操作体系尚不成熟、转化步骤较繁琐，且其转化效率相对较低，而大肠杆菌中基因克隆操作十分便利。利用该穿梭质粒载体在大肠杆菌中完成外源基因克隆和重组质粒构建，便于开展相关基因功能研究和遗传育种工作。
16.本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
17.通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
18.图1为穿梭质粒载体plwpu01构建示意图。
19.图2为穿梭质粒载体plwpu01图谱。
20.图3为质粒plw4图谱。
21.图4为质粒plw4经pcr线性化后的凝胶电泳图。
22.图5为转化e.coli dh5α后提取的穿梭质粒载体plwpu01单、双酶切鉴定电泳图。
具体实施方式
23.下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
24.实施例中未注明具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
25.实施例1：本实施例用于说明穿梭质粒载体plwpu01的构建，构建示意图如图1所示。
26.1、质粒plw4的提取挑取mrs平板上单菌落，接种于100ml新鲜的mrs液体培养基中，37℃静置过夜培养。转接至100 ml新鲜的mrs液体培养基中，37℃静置培养24 h。10000rpm离心10min收集菌体，首先用缓冲液（10 mmol/l tris-hcl、5 mmol/l edta，ph 8.0）洗涤菌体沉淀，然后用含有30 mg/ml 溶菌酶溶液重新悬浮菌体，并于37℃处理1h，最后用takara质粒dna小量纯化
试剂盒提取质粒，-20℃储存待用。
27.2、质粒plw4线性化以质粒plw4为模板（序列如seq id no：2所示），通过设定引物（p1和p2）进行pcr，使环状质粒pbk760线性化，pcr的具体反应条件见表1，p1和p2序列如下：p1：5
’‑
atcgtcgaccctctagatgcag-3’（seq id no：3）p2：5
’‑
ctgactctagcaggtcgaggat-3’（seq id no：4）表1：plw4线性化pcr反应具体条件反应程序为：95℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃5min，30循环；72℃延伸10min；4℃保存。
28.pcr扩增后的产物通过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图4所示。电泳结果显示在理论值大小位置出现了单一的特异性条带，用质粒dna片段回收试剂盒（购自上海生工）对其进行纯化回收。
29.3、质粒plw4和载体pmd20的连接将步骤2中线性化质粒plw4和载体pmd20（购自takara公司）进行连接，反应体系如表2所示。
30.表2：质粒plw4和载体pmd20连接体系 操作步骤如下：16℃连接过夜，取2.5μl连接产物转化50μl e.coli dh5α感受态细胞，取100μl菌液涂布含有100μg/ml氨苄青霉素的lb平板进行蓝白斑筛选。挑取阳性转化子，转入5ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基，37℃培养12h，用质粒dna小量抽提试剂盒（购自上海生工）提取质粒，获得穿梭质粒载体plwpu01。通过hind iii和ecor i进行单、双酶切验证（如图5所示），确定重组质粒后进行测序分析（上海生工）。序列分析结果如seq id no：1，绘制载体图谱如图2所示。
[0031] 实施例2 ：本实施例用于说明穿梭质粒载体plwpu01的应用。
[0032]
1、穿梭质粒载体plwpu01转化粪肠球菌。
[0033]
a、粪肠球菌感受态的制备。
[0034]
1）挑取mrs平板上单菌落，接种于100ml新鲜的gm17液体培养基中，30℃静置培养过夜。
[0035]
2）将过夜培养物以1%的接种量接种于100ml新鲜的sgm17液体培养基中，30℃静置培养5~6 h。
[0036]
3）离心收集菌体沉淀，用冰浴的电击缓冲液洗涤两次后，重悬于100μl电击缓冲液
中，放置在冰上待用。
[0037]
b、转化感受态细胞。
[0038]
4）向100μl感受态细胞中加入100 ng重组质粒，轻轻混匀，置于冰上备用。
[0039]
5）将含有重组质粒的粪肠球菌感受态细胞混合液小心加入冰预冷的电转杯中，然后进行电击转化。电击转化参数为1.8kv、200ω、25μf，脉冲时间为4.0ms。
[0040]
6）电击完成后，立即向电转杯中加入900μl新鲜的sgm17 液体培养基，30℃静置复苏 2 h。
[0041]
7）取复苏后的菌液涂布于含2.5μg/ml红霉素的mrs固体平板，30℃培养24~48 h。
[0042]
3）挑取阳性转化子，转入5ml含2.5μg/ml红霉素的mrs液体培养基，30℃培养12h，用质粒dna小量抽提试剂盒（购自上海生工）提取质粒，通过hind iii和ecor i进行双酶切验证（如图5），结果证明确为质粒plwpu01。
[0043]
以上实施例说明本发明穿梭载体plwpu01构建成功，该穿梭载体能够在粪肠球菌复制表达。
[0044]
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。