一种从积雪草原料出发快速制备高含量积雪草苷的方法与流程

1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种从积雪草原料出发快速制备高含量积雪草苷的方法。


背景技术：

2.积雪草以其显著的药用价值和广泛的地理分布，越来越受到市场的关注。2020版中国药典中收录了积雪草药材，并规定其积雪草总苷含量不低于0.8％(按干燥品计)。大众接触到积雪草相关的产品多涉及到皮肤护理和烫伤手术伤口恢复等方面，这些产品中主要活性成分就是来自于积雪草中的积雪草总苷等三萜类成分，积雪草苷是其主要成分之一，积雪草苷具有神经保护、抗肿瘤、抗缺血再灌注损伤、抗支架再狭窄、保护肺脏等多方面作用。
3.目前关于积雪草中积雪草苷提取分离的研究很多，但基本上都用到有机溶剂提取，并采用两种或两种以上的大孔树脂等分离材料进行分离，或者用到制备色谱、膜分离等先进设备等等，这些方法涉及到的一次性投入成本较大，且现有的柱层析分离积雪草苷时，洗脱所需要的有机溶剂用量较大，还会存在生产周期较长、溶剂残留、环保等问题。
4.经发明人研究发现，积雪草中积雪草苷成分直接用水很难提取出来，这一点与文献报道的差异大，但是改用一定浓度的酸水后就可以很好地将积雪草苷成分提取出来。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于针对背景技术提出一种从积雪草原料出发快速制备高含量积雪草苷的方法。
6.为了实现本发明的目的，本发明采取的技术方案为：
7.一种从积雪草原料出发快速制备高含量积雪草苷的方法，包括如下步骤：
8.步骤一、将采摘的积雪草鲜草洗净去除杂草和泥土，晒干或烘干后粉碎，得到积雪草粉末；
9.步骤二、将得到的积雪草粉末，加入氢离子浓度为0.01mol/l-0.08mol/l的无机酸水溶液进行加热回流提取1-3次，每次提取1-3h，得到的提取液合并，过滤得到总提取液；积雪草粉末与无机酸水溶液的质量体积比为1：10-33g/ml；
10.步骤三、将总提取液的ph值调节至7，得到中和后的提取液；
11.步骤四、将中和后的提取液装入聚酰胺树脂柱中以0.5bv/h-2.0bv/h的流速进行上柱，积雪草粉末与聚酰胺树脂的质量体积比为3:5g/ml；
12.步骤五、将聚酰胺树脂以纯水进行水洗，洗至流出液澄清无色，得到水洗过后的聚酰胺树脂；
13.步骤六、将水洗过后的聚酰胺树脂用2bv-4bv的30％的乙醇水溶液进行洗脱，并收集洗脱液；
14.步骤七、将洗脱液浓缩，干燥，得到白色的固体或粉末状的积雪草苷产品。
15.进一步的，步骤二中积雪草粉末与无机酸水溶液的料液比为1:33。
16.进一步的，无机酸水溶液中氢离子浓度为0.03mol/l。
17.进一步的，步骤二中的无机酸水溶液为硫酸水溶液、盐酸水溶液或磷酸水溶液任意一种。
18.进一步的，步骤二中加热回流提取次数为2次，每次提取1h。
19.进一步的，步骤三中调节总提取液ph值的方式为：向总提取液中加入3％-4％的碱水溶液进行中和直至总提取液ph值为7。
20.进一步的，碱水溶液为氢氧化钠水溶液或氨水溶液。
21.进一步的，步骤四中的聚酰胺树脂为规格为60-300目的聚酰胺树脂。
22.与现有技术相比，本发明的优点在于：
23.1、本发明采用的酸水提取工艺，积雪草中积雪草苷总苷的提取率可以达到70％以上，与传统的乙醇水提取的效果相当，说明采用酸水提取并不会对积雪草中积雪草苷成分造成明显的水解破坏，同时用酸水提取避免了乙醇水提取后处理比较麻烦和成本较高的弊端，本发明用的酸水浓度较低，也避免了对设备产生比较强的腐蚀作用。
24.2、用酸水提取可以避免提取过程中使用大量的有机溶剂，且酸水提取得到的提取液颜色较浅，避免积雪草中大量的叶绿素等色素成分被提取出来，有利于提取液的后续处理和分离纯化。
25.3、采用聚酰胺树脂进行上柱，聚酰胺树脂对于积雪草苷的吸附度较低，只需低浓度的乙醇溶液就能轻易的洗脱下来，可以避免更多其他杂质成分被洗脱出来，提高了所得产品的纯度。
26.4、本发明采用酸水提取后的提取液中和后即可直接上聚酰胺树脂柱进行分离纯化，避免了提取液的比较繁琐的中间处理，明显缩短工艺时间。且经聚酰胺树脂纯化后得到的积雪草苷产品品质好，为白色固体或粉末。
附图说明
27.图1为积雪草总苷的对照品色谱图；
28.图2为积雪草原料的色谱图；
29.图3为积雪草原料酸水提取液的色谱图；
30.图4为聚酰胺柱纯化后的积雪草苷样品色谱图；
31.其中：a.羟基积雪草苷；b.积雪草苷。
具体实施方式
32.为更进一步阐述本发明为达成预定目的所采用的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实例，对依据本发明提出的一种从积雪草原料出发快速制备高含量积雪草苷的方法，详细说明如下：
33.(一)不同溶剂对积雪草中积雪草总苷的提取效果
34.称取同一积雪草原料6份，每份3g，分别加入甲醇、50％乙醇、95％乙醇、纯水、β-环糊精水溶液、0.08mol/l盐酸水溶液100ml，进行回流提取1次，提取2h后过滤得到提取液，然后将各提取液分别加入质量分数3％-4％的氢氧化钠溶液进行中和，并置于100ml容量瓶中
分别定容至刻度，混匀后观察溶液颜色，溶液经0.45μm滤膜过滤后，再运用薄层色谱(tlc)和高效液相色谱(hplc)进行定量定性分析，以积雪草总苷(积雪草苷、羟基积雪草苷)成分为参照，筛选得到更适合积雪草中积雪草总苷成分提取的溶剂体系。
35.经试验得到的结果如下：
36.(1)提取液外观颜色：水提液、β-环糊精水提液和50％乙醇水提液颜色相近，呈棕色或棕黄色澄清液；95％乙醇提取液与甲醇提取液均呈草绿色澄清液，其中95％乙醇提取液颜色更深；酸水提取液呈浅褐色微浑浊液。
37.(2)薄层色谱(tlc)结果：经与积雪草总苷提取物作对照，发现水提液、β-环糊精水提液几乎没有积雪草总苷成分，50％乙醇水提液、95乙醇提取液、甲醇提取液和酸水提取液均具有明显的积雪草总苷成分。
38.(3)高效液相色谱(hplc)检测：
39.1)色谱条件为：色谱柱：inertsustain色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)；流动相：乙腈：甲醇：水＝26:24:50；流速：0.8ml/min；检测波长：204nm；进样量：10μl。积雪草总苷对照品与样品的色谱图如图1～图4所示。
40.2)对照品溶液制备：精密称取羟基积雪草苷对照品、积雪草苷对照品各15mg于25ml容量瓶中，用甲醇充分溶解并定容至刻度，所得溶液过0.45μm微孔滤膜备用。
41.3)样品检测结果：由表1中数据可知，在回流提取1次，提取2h的条件下，不同溶剂对积雪草中积雪草总苷的提取效果依次顺序为95％乙醇》甲醇》50％乙醇》酸水》水提》β-环糊精水提，醇提的效果要优于酸水提取，这与传统的积雪草中积雪草总苷的提取多采用醇提工艺相吻合，但采取醇提工艺时的溶剂和提取液后续处理成本大，且酸水一次提取的效率就可达醇提的60％左右，故为了说明酸水提取的合理性，还需进一步优化酸水提取的工艺条件。
42.表1不同溶剂对积雪草中积雪草总苷的提取效果
43.提取液种类羟基积雪草苷峰面积积雪草苷峰面积积雪草总苷含量水提液138.06876.0090.30％β-环糊精水提液未检出未检出未检出50％乙醇水提液2513.7111003.7284.90％甲醇提取液2741.7521237.0165.56％95％乙醇提取液2847.9761390.1535.92％酸水提取液1447.268978.6793.41％
44.(二)酸水提取的单因素试验
45.(1)考察不同酸水浓度对积雪草中积雪草总苷的提取效果
46.称取以上同一积雪草原料6份，每份3g，分别加入0.08mol/l、0.06mol/l、0.04mol/l、0.03mol/l、0.02mol/l、0.01mol/l盐酸水溶液100ml，进行回流提取1次，提取2h后过滤合并提取液，然后将不同酸浓度的提取液分别加入质量分数3％-4％的氢氧化钠溶液进行中和，并置于100ml容量瓶中分别定容至刻度，混匀后观察溶液颜色，并进行积雪草总苷含量检测，得到的结果如表2所示：
47.表2不同酸水浓度对积雪草中积雪草总苷的提取效果
48.不同酸水浓度羟基积雪草苷峰面积积雪草苷峰面积积雪草总苷含量
0.08mol/l1447.268978.6793.41％0.06mol/l2578.3611480.4295.69％0.04mol/l2395.6331334.9585.23％0.03mol/l3314.0512300.4727.89％0.02mol/l3434.0541837.0347.38％0.01mol/l2948.3191442.2776.14％
49.由表2可知，不同酸水提取效果差别较大，随着酸水浓度的增加，积雪草中积雪草总苷的提取效果呈先增加后降低的趋势，这说明酸性环境有利于积雪草总苷等三萜皂苷类成分溶出，但酸性不能过大，否则可能会发生水解。进一步发现0.02mol/l与0.03mol/l酸水提取效果均较佳，两者结果相差较小，故选择0.02mol/l～0.03mol/l的酸水作为提取溶剂。
50.(2)考察不同提取次数对积雪草中积雪草总苷的提取效果
51.称取以上同一积雪草原料3份，每份3g，分别加入0.02mol/l盐酸水溶液50ml，分别进行回流提取1次、2次、3次，每次提取2h，过滤后合并提取液，然后将不同提取次数的提取液分别加入质量分数3％-4％的氢氧化钠溶液进行中和，适当浓缩后置于100ml容量瓶中分别定容至刻度，混匀后观察溶液颜色，并进行积雪草总苷含量检测，得到的结果如表3所示：
52.表3不同提取次数对积雪草中积雪草总苷的提取效果
53.不同提取次数羟基积雪草苷峰面积积雪草苷峰面积积雪草总苷含量1次2277.3541322.5825.05％2次3480.5911867.8857.49％3次3903.4532105.3568.41％
54.由表3可知，随着提取次数的增加，积雪草总苷的提取效果呈递增趋势，且趋势逐渐变平缓，但提取次数越多，所需的提取时间和后续提取液处理成本越大，综合考虑选择提取2次为佳。
55.(3)考察不同料液比对积雪草中积雪草总苷的提取效果
56.称取以上同一积雪草原料3份，每份3g，分别加入0.02mol/l盐酸水溶液30ml、50ml、100ml，进行回流提取1次，提取2h后过滤合并提取液，然后将不同酸浓度的提取液分别加入质量分数3％-4％的氢氧化钠溶液进行中和，并置于100ml容量瓶中分别定容至刻度，混匀后观察溶液颜色，并进行积雪草总苷含量检测，得到的结果如表4所示：
57.表4不同料液比对积雪草中积雪草总苷的提取效果
58.不同料液比羟基积雪草苷峰面积积雪草苷峰面积积雪草总苷含量1:101664.241711.7033.31％1:163150.3771719.2266.82％1:333434.0541837.0347.38％
59.由表4可知，随着酸水的用量增加，积雪草总苷的提取效果呈递增趋势，但实际应用时料液比不应过大，一方面受设备的容量限制，另一方面料液比过大也务必增加了提取液的后续处理难度和成本，综合提取效果选择100ml液料比为1:33的酸水提取。
60.(4)考察不同提取时间对积雪草中积雪草总苷的提取效果
61.称取以上同一积雪草原料3份，每份3g，分别加入0.02mol/l盐酸水溶液100ml，进行回流提取1次，分别提取1h、2h、3h后过滤得提取液，然后将各提取液分别加入质量分数
3％-4％的氢氧化钠溶液进行中和，并置于100ml容量瓶中分别定容至刻度，混匀后观察溶液颜色，并进行积雪草总苷含量检测，得到的结果如表5所示：
62.表5不同提取时间对积雪草中积雪草总苷的提取效果
63.不同提取时间羟基积雪草苷峰面积积雪草苷峰面积积雪草总苷含量1h1803.0061023.2763.96％2h3434.0541837.0347.38％3h1740.684890.7773.68％
64.由表5可知，提取时间对积雪草中积雪草总苷的提取效果影响显著，随着提取时间的增加，积雪草总苷的提取效果先增加后降低，这说明长时间的酸性环境提取可能对积雪草总苷成分造成一定的破坏，综合考虑选择提取2h为佳。
65.(三)酸水提取的正交试验
66.根据单因素的实验结果，进一步设计四因素三水平l9(34)正交试验优化酸水提取积雪草中积雪草总苷的提取条件，经试验得到积雪草中积雪草总苷的提取结果如下表6所示：
67.表6正交试验数据及分析
[0068][0069]
由表6数据可知，影响积雪草中积雪草总苷提取效果的因素顺序为酸水浓度》料液比》提取时间》提取次数，得到酸水提取的最优条件为0.03mol/l酸水浓度、料液比为1:33、提取2次、每次提取1h。
[0070]
(四)酸水提取与50％乙醇水提取的比较
[0071]
将正交试验的最优酸水提取条件进行试验，并与50％乙醇水提取进行对比，得到的提取结果如下表7所示。
[0072]
表7酸水提取与50％乙醇水提取的对比试验
[0073][0074]
由表7数据可知，虽然50％乙醇提取物的积雪草总苷含量要高于酸水提取，这可能是因为酸水把积雪草中大量的水溶性物质提取出来了；但是从积雪草总苷提取率来看，酸水提取积雪草中积雪草总苷的提取效果与50％乙醇提取效果相当，甚至还要略优于后者，说明酸水提取完全能够达到传统醇提的效果。
[0075]
(五)聚酰胺柱层析分离纯化
[0076]
称取以上同一积雪草原料60g，按照酸水提取最优条件进行提取后合并提取液，并加入质量分数3％-4％的氢氧化钠溶液进行中和，再取100ml的聚酰胺树脂(60-300目)进行装柱，然后将中和后的提取液按照0.5bv/h-2bv/h的流速进行上柱，上柱结束后继续用2bv的纯化水进行水洗，水洗至流出液无色。接着加入2bv-4bv的30％乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩，干燥后得到产品，经检测积雪草苷的含量大于80％，产品为白色固体，检测图谱如上图4所示。
[0077]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。