技术特征：
1.一种nkt细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）自外周血中分离出外周血单个核细胞，采用无血清培养基重悬；（2）将步骤（1）重悬后的细胞接种在cd3抗体和缬草油包被的培养容器中，培养12小时后加入il-2、ifn-γ、异丙肌苷、钛酸钙、抗坏血酸，继续培养过程中及时补充添加il-2、ifn-γ、异丙肌苷、钛酸钙、抗坏血酸的无血清培养基；（3）培养3-4天后补充的无血清培养基中添加以下成分：羟基芫花素、2-巯基乙醇、维生素b3、il-2、il-21，每隔2-3天补液一次，培养至第14天收获nkt细胞。2. 根据权利要求1所述nkt细胞的培养方法，其特征在于，步骤（2）中添加的il-2、ifn-γ、异丙肌苷、钛酸钙、抗坏血酸在培养基中的终浓度为：il-2 1000-1500u/ml、ifn-γ500-1000 u/ml、异丙肌苷10-15μg/ml、钛酸钙3-8μg/ml、抗坏血酸6-10μg/ml。3.根据权利要求1所述nkt细胞的培养方法，其特征在于，步骤（2）中添加的il-2、ifn-γ、异丙肌苷、钛酸钙、抗坏血酸在培养基中的终浓度为：il-2 1300u/ml、ifn-γ800u/ml、异丙肌苷12μg/ml、钛酸钙6μg/ml、抗坏血酸8μg/ml。4. 根据权利要求1所述nkt细胞的培养方法，其特征在于，步骤（3）中添加的羟基芫花素、2-巯基乙醇、维生素b3、il-2、il-21在培养基中的终浓度为：羟基芫花素20-30ng/ml、2-巯基乙醇10-20 ng/ml、维生素b3 1-5μg/ml、il-21000-1500u/ml、il-21 800-1200 u/ml。5.根据权利要求1所述nkt细胞的培养方法，其特征在于，步骤（3）中添加的羟基芫花素、2-巯基乙醇、维生素b3、il-2、il-21在培养基中的终浓度为：羟基芫花素25ng/ml、2-巯基乙醇15ng/ml、维生素b3 3μg/ml、il-2 1200u/ml、il-21 1000u/ml。6.根据权利要求1所述nkt细胞的培养方法，其特征在于，无血清培养基为aim-v培养基。7.根据权利要求1所述nkt细胞的培养方法，其特征在于，步骤（2）中培养容器的包被过程如下：向pbs中加入cd3抗体和缬草油，cd3抗体和缬草油在pbs中的浓度为：cd3抗体4-8μg/ml、缬草油1-5ng/ml，在4℃下包被过夜。8.根据权利要求1所述nkt细胞的培养方法，其特征在于，步骤（1）中细胞密度为1-3
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106个/ml。
技术总结
本发明公开了一种NKT细胞的培养方法，包括以下步骤：（1）自外周血中分离出外周血单个核细胞，采用无血清培养基重悬；（2）将步骤（1）重悬后的细胞接种在CD3抗体和缬草油包被的培养容器中，培养12小时后加入IL-2、IFN-γ、异丙肌苷、钛酸钙、抗坏血酸，继续培养过程中及时补充添加IL-2、IFN-γ、异丙肌苷、钛酸钙、抗坏血酸的无血清培养基；（3）培养3-4天后补充的无血清培养基中添加以下成分：羟基芫花素、2-巯基乙醇、维生素B3、IL-2、IL-21，每隔2-3天补液一次，培养至第14天收获NKT细胞。采用上述培养过程得到的NKT细胞数量多，增殖效率有显著提高，而且得到的NKT细胞活性高，临床应用效果更好。临床应用效果更好。
技术研发人员：李国强 石连勇
受保护的技术使用者：李国强
技术研发日：2021.11.24
技术公布日：2022/1/21