一种鸢尾科植物红葱VIGS沉默体系的构建方法及其应用与流程

一种鸢尾科植物红葱vigs沉默体系的构建方法及其应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种鸢尾科植物红葱vigs沉默体系的构建方法及其应用。


背景技术：

2.鸢尾科植物红葱(eleutherine bulbosa(mill.)urb.)原产于西印度群岛、美洲等地，后经云南民间引入栽培，发展成为云南、广西等西南地区传统民间药用植物。红葱具有抗菌、消炎等多重功效(padhi and panda,2015)，亦可作为野菜食用(潘俊等,2011；王晓艺等,2015；徐巧林等,2014)。鸢尾科红葱与人们熟知的蔬菜葱科葱属植物红葱(香葱)(allium ascalonicuml.)，在其鳞茎外观、名称均相似，易被混淆。上世纪80年代已经开展了对红葱化学成分和药理活性的研究，目前从红葱中分离得到的化合物主要有萘酚、萘醌、蒽醌及其衍生物、甾体、葡萄糖苷及其他小分子类化合物(gallo et al.,2010；han et al.,2008；段文娟等,2016；邱峰等,2005)。红葱其化学成分具有多种药理作用，包括血管舒张、抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等一系列的活性(padhi and panda,2015；kamarudin et al.,2020；nugrohoet al.,2018)。红葱的红色素色泽纯正柔和，作为天然红色素的来源具有广阔的发展前景；其中蒽醌类是提取物红色素的主要成分，可为新型天然红色素的开发供理论依据。红葱提取物应用广泛，在食品加工、功能食品、植物饲料添加剂、功能性化妆品、植物源药品等方面有很好的应用前景(何云等,2014)。
3.虽然红葱化学成分及药理活性方面早有研究开展(jiang et al.,2018；徐晓梅等,2018)，但是关于其分子生物学方面的研究甚少，特别是基因序列信息的匮乏和自身遗传转化体系尚未构建，导致其基因表达分析、功能研究及有效活性成分合成机理等研究相对滞后。病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,vigs)是一种rna介导的防御机制，即转录后水平的基因沉默(post-transcriptional gene silencing,ptgs)，是植物体内普遍存在的遗传免疫机制。该技术利用携带植物功能基因cdna的病毒，在侵染植物体后可诱导植物发生基因沉默从而引起表型改变，以通过植物表型或生理指标上的变化反映该基因的功能。与转基因等方法相比，vigs具有简便高效、周期短、可沉默基因家族、不需获取转基因植株、高通量等优点，同时可在不同遗传背景的植物间进行基因功能比较，是研究功能基因组和特定基因功能的有效工具。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种鸢尾科植物红葱vigs沉默体系的构建方法及其应用。
5.因此，本发明的第一个目的是提供一种红葱vigs沉默体系的构建方法，包括以下步骤：
6.a.将红葱目的基因特异性片段连接至ptrv2载体的多克隆位点上，获得ptrv2-目的基因特异性片段重组质粒，将重组质粒转化农杆菌，获得ptrv2-目的基因特异性片段农杆菌，培养收集菌体备用；
7.b.用缓冲液分别将ptrv1农杆菌、ptrv2-目的基因特异性片段农杆菌的菌体重悬分散制成农杆菌菌液，然后将ptrv1农杆菌菌液与ptrv2-目的基因特异性片段农杆菌菌液混合为侵染液；
8.c.将红葱植株洗净，吸干表面水分，完全浸泡于侵染液中，进行真空渗透处理；
9.d.用无菌水清洗植株上多余的侵染液，然后将植株于20℃下黑暗培养24h，25℃黑暗条件下平衡24h，随后正常培养，构建得到红葱的目的基因vigs沉默体系。
10.优选，所述的缓冲液含有10mm mes、200μm乙酰丁香酮和10mmmgcl2，余量为水，ph 5.6。
11.优选，所述的ptrv1农杆菌菌液、ptrv2-目的基因特异性片段农杆菌菌液的od600＝1，ptrv1农杆菌菌液与ptrv2-目的基因特异性片段农杆菌菌液按体积比1：1混合为侵染液。
12.优选，所述的用于真空渗透处理的红葱植株为6～8个月生长期的红葱植株。
13.优选，所述的真空渗透处理为：于真空渗透装置中，在真空度到达0.5～0.7atm后，保持30s，随后缓慢放气恢复正常气压；然后重复上述步骤一次。
14.优选，所述的红葱vigs沉默体系的构建方法，还包括对照，所述的对照是用ptrv2农杆菌替换ptrv2-目的基因特异性片段农杆菌，其余步骤均相同。以空白侵染液真空渗透处理的红葱植株为对照，观察侵染液真空渗透处理的红葱植株表型，检测目的基因表达情况。
15.本发明还提供红葱vigs沉默体系的构建方法在研究红葱色素合成相关基因功能中的应用。
16.本发明还提供一类红葱色素合成相关功能基因，为核苷酸序列如seq id no.2所示的八氢番茄红素脱氢酶基因、核苷酸序列如seq id no.3所示的ebmyb5基因、核苷酸序列如seq id no.4所示的ebmyb52基因、核苷酸序列如seq id no.5所示的查尔酮异构酶基因、核苷酸序列如seq id no.6所示的查尔酮合成酶基因、核苷酸序列如seq id no.7所示的无色花色素双加氧酶基因、核苷酸序列如seq id no.8所示的黄酮糖基转移酶基因和核苷酸序列如seq id no.9所示的类黄酮3
’‑
羟化酶基因。
17.本发明中，筛选侵染范围比较广泛的烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus，trv)作为vigs体系的载体。trv是广泛应用于各种植物物种中最常见的病毒载体，它具有侵染后症状较轻、基因沉默效率高、可在多个组织产生沉默且效果长久等优点。
18.本发明以红葱八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase，pds)基因作为目的基因来创建适合红葱的vigs沉默体系；八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase，pds)基因调控类胡萝卜素合成途径，pds是类胡萝卜素合成途径的一个中间体，当pds被沉默后，植物体的类胡萝卜素合成受抑制，植物呈现光漂白现象。利用基于trv病毒的vigs表达载体(图1)，创建红葱整体植株vigs沉默体系。本发明在红葱中建立病毒诱导的vigs实验体系，vigs沉默体系的建立对于红葱基因功能研究具有重要意义。
附图说明
19.图1是烟草脆裂病毒trv的vigs载体图谱，包括图a的ptrv1载体和图b的ptrv2载体。
20.图2是ebpds与其他物种氨基酸序列比对分析；注：atpds，拟南芥pds基因；nopds，西洋菜pds基因；bnpds，油菜pds基因；bopds，芥蓝pds基因；slpds，番茄pds基因。
21.图3是ebpds目的片段克隆；注：m，marker；1、2泳道为ebpds目的片段条带。
22.图4是vigs沉默红葱植株ptrv2-ebpds pcr鉴定；注：m，marker；1、2、3泳道为沉默红葱植株生物学重复样。
23.图5是ebpds基因相对表达水平；注：ck为空白对照组；ebpds为处理组；竖线柱表示标准误(n＝5)，t-检验，*表示同列数据间在p≤0.05水平上差异显著。
24.图6是ptrv2-ebpds沉默的红葱植株叶片表型；其中，图a为对照组红葱样品叶片；图b为ptrv2-ebpds处理组红葱叶片出现漂白表型。
25.图7是trv2-ebmyb5和trv2-ebmyb52沉默红葱植株表型；其中，图a：对照组红葱植株；图b、c：trv2-ebmyb5处理组红葱植株；图d：对照组红葱植株；图e、f：trv2-ebmyb52处理组红葱植株。
26.图8是trv2-ebmyb5和trv2-ebmyb52 pcr鉴定；注：m，marker；图a：泳道1、2、3为trv2-ebmyb5处理红葱植株生物学重复样，图b：泳道1、2、3为trv2-ebmyb52处理红葱植株生物学重复样。
27.图9是trv2-ebmyb5沉默植株后目的基因及其他色素合成相关基因表达水平；其中，图a为ebmyb5转录因子表达水平；图b为查尔酮异构酶(chi)表达水平；图c为查尔酮合成酶(chs)表达水平；图d为黄酮糖基转移酶(ufgt)表达水平；图e为无色花色素双加氧酶(ldox)表达水平；图f为类黄酮3
’‑
羟化酶(f3’h)表达水平。
28.图10是trv2-ebmyb52沉默植株后目的基因及其他色素合成相关基因表达水平；注：图a为ebmyb52转录因子表达水平；图b为查尔酮异构酶(chi)表达水平；图c为查尔酮合成酶(chs)表达水平；图d为黄酮糖基转移酶(ufgt)表达水平；图e为无色花色素双加氧酶(ldox)表达水平；图f为类黄酮3
’‑
羟化酶(f3’h)表达水平。
具体实施方式
29.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
30.实施例1：红葱pds基因vigs体系建立
31.一、方法
32.(1)菌种
33.大肠杆菌dh5α感受态细胞(产品规格cat#:dl1001)与农杆菌gv3101感受态细胞(产品规格cat#:ac1001)购于上海唯地生物技术有限公司；ptrv1载体(货号：biovectorptrv1)、ptrv2载体(货号：biovectorptrv2)购自普如汀生物技术(北京)有限公司。
34.(2)试剂
35.rna提取试剂盒：北京华越洋超快型植物rna提取试剂盒；反转录试剂盒：starscript iicdna第一链合成预混试剂(含去基因组)；dna胶回收试剂盒：diaspin柱式dna胶回收试剂盒；质粒提取试剂盒：sanperp柱式质粒dna小量抽提试剂；酶切与连接：clonexpressii one step cloning kit。
36.(3)实验过程
37.①
为验证vigs体系在研究红葱基因功能方面的可行性，利用八氢番茄红素脱氢酶(pds)进行vigs体系建立，pds是类胡萝卜素合成途径的一个中间体，当pds被沉默后，植物体的类胡萝卜素合成受抑制，植物呈现光漂白现象。本发明根据ncbi上公布的拟南芥atpds基因序列，利用本地blast软件检索红葱全长转录组数据库中的同源基因，并与已报道的几个物种的pds基因进行比对，筛选出红葱的ebpds，利用primer5.0设计红葱ebpds的vigs实验用载体构建引物，正向引物f(5
’‑3’
)：taccgaattctctagacacatattctttggagcttatccc；反向引物r(5
’‑3’
)：cttcgggacatgcccgggatccatgtttttcctgaagaaaac，使用primerstar maxpremix(2
×
)高保真酶对ebpds目的片段进行特异性扩增。
38.②
ptrv2病毒载体线性化：
39.ptrv2病毒载体的限制性酶切位点选择smaⅰ和xbaⅰ，限制性酶切反应体系如下(表1)；
40.表1 ptrv2载体酶切反应体系
[0041][0042]
体系中依次加入depc-ddh2o、质粒dna、0.1％bsa、10
×
buffer、smaⅰ和xbaⅰ，混匀体系，短暂离心；在pcr仪中进行反应，37℃、60min。反应结束后，加入3倍体积的异丙醇混匀，平放于4℃冰箱，静置4h，12000g离心10min收集ptrv2线性化载体，倒掉上清液，加入100μl depc-ddh2o稀释备用。
[0043]
③
ptrv2线性化病毒载体与目的片段连接：
[0044]
按照clonexpress ii one step cloning kit试剂盒操作说明，连接反应体系如下(表2)；
[0045]
表2连接反应体系
[0046][0047]
使用移液枪吸打混匀体系，短暂离心后，在pcr仪中进行反应，37℃、30min；反应结束后，获得的ptrv2-ebpds重组质粒，重组质粒转化大肠杆菌dh5α；阳性菌落鉴定及转化农杆菌，获得含有ptrv2-ebpds重组质粒的农杆菌。
[0048]
④
农杆菌侵染液准备
[0049]
取-80℃保存的菌种以1/100的比例于1ml lb液体培养基中进行活化摇菌，28℃、200rpm，2h后取150μl于lb培养基固体平板(25mg/l rif+50mg/l kana)上涂布培养12-16h；挑取单克隆于5ml lb液体培养基(25mg/l rif+50mg/l kana)中，28℃、220rpm过夜培养，12-16h；将1ml过夜培养的农杆菌液接种至200ml lb液体培养基(25mg/l rif+50mg/lkana)中，分别摇菌ptrv1、ptrv2、ptrv2-ebpds农杆菌液，于28℃、220rpm培养至od600＝1～2；5000rpm离心10min收集菌体，配制侵染液：用缓冲液(每100ml无菌水加入1ml 1m mes(终浓度10mm)、400μl乙酰丁香酮(终浓度200μm)、1ml mgcl2(终浓度10mm))重悬菌体至od600＝1，ph调至5.6；将od600＝1的ptrv1农杆菌菌液与od600＝1的ptrv2农杆菌菌液按体积比1：1混合为侵染液(作为对照，不含ebpds目的片段)、将od600＝1的ptrv1农杆菌菌液与od600＝1的ptrv2-ebpds农杆菌菌液按体积比1：1混合为侵染液，20℃放置4h后，进行侵染。
[0050]
⑤
ptrv2-ebpds农杆菌侵染红葱植株
[0051]
1、注射法侵染：无菌注射器(无针头)吸取ptrv1农杆菌菌液与ptrv2-ebpds农杆菌菌液的混合侵染液，从叶背面注射，每株红葱注射3片成熟叶；以ptrv1农杆菌菌液与ptrv2农杆菌菌液的混合侵染液注射组为对照。接种后26℃避光培养2d，转入光照培养箱，培养条件：22℃/16h光照、20℃/8h黑暗，持续观察。由于红葱属于单子叶植物，叶片表皮光滑，注射法侵染过程压力过小无法注入叶片内部，注射压力过大会造成注射口区域叶片可见性损伤。
[0052]
2、真空法侵染：将6～8个月生长期的红葱植株洗净，吸干表面水分，完全浸泡于侵染液中，侵染液对照组为ptrv1农杆菌菌液与ptrv2农杆菌菌液的混合侵染液、实验组为ptrv1农杆菌菌液与ptrv2-ebpds农杆菌菌液混合侵染液。利用真空渗透装置(真空泵型号：品牌：台湾洛科rocker，型号：rocker410；)，使植株在侵染液中保持，真空处理方法分别设计：a，真空渗透30s，渗透1次；b，真空渗透30s，渗透2次；c，真空渗透60s，渗透1次；d，真空渗透60s，渗透2次；渗透处理过程设置为，以真空度到达0.5～0.7atm后，保持30s、1min，随后缓慢放气，恢复正常气压(真空渗透2次时，重复操作)。用无菌水清洗植株上多余的菌液。将植株于20℃下黑暗培养24h，25℃黑暗条件下平衡24h，随后正常光照培养，期间观察红葱植
株表型变化。
[0053]
⑥
ebpds基因沉默对红葱植株表型的影响及检测
[0054]
vigs侵染处理后的红葱植株正常培养2周左右，观察记录ptrv2-ebpds处理的植株表型变化，比较ptrv1与ptrv2的混合侵染液沉默植株和ptrv1与ptrv2-ebpds混合侵染液沉默植株叶片表型变化，包括叶色、叶斑和叶片衰老等表型变化。同时，以沉默植株内是否含有trv病毒为依据，分别提取对照组植株叶片、实验组具有沉默表型的植株叶片总rna、逆转录合成cdna，以此cdna为模板，分别用jc-ptrv2跨越酶切位点两端的特异性检测引物，正向引物f(5
’‑3’
)：ggacattgttactcaaggaagcac，反向引物r(5
’‑3’
)：gtcgagaatgtcaatctcgtagg)、ptrv2-pds目的片段的载体构建引物：正向引物f(5
’‑3’
)：taccgaattctctagacacatattctttggagcttatccc；反向引物r(5
’‑3’
)：cttcgggacatgcccgggatccatgtttttcctgaagaaaac，两种特异性引物进行pcr分子检测，检测ptrv2、ptrv2-ebpds是否成功导入植株，并分析沉默表型是否是trv病毒所诱导。
[0055]
⑦
qrt-pcr分析ebpds基因的表达
[0056]
为了研究ptrv2-ebpds沉默植株的效果，利用qrt-pcr检测红葱沉默样品中ebpds的相对表达水平，ebpds的qrt-pcr检测引物如下：引物序列5
’‑3’
，f：actttgcctcccagaacatctcttg，r：cggtttggctggactatctactgc。
[0057]
二、结果
[0058]
(1)ebpds氨基酸序列比对分析
[0059]
以拟南芥atpds进行blastx比对，筛选获得红葱全长转录组数据库中的同源序列ebpds(八氢番茄红素脱氢酶基因，其核苷酸序列如seq id no.2所示，其编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示)，使用dnaman将ebpds与几种植物已知pds基因进行多序列比对，黑色阴影区域代表非常保守，灰色阴影区域代表相对保守，图中氨基酸序列标记黑色阴影的占大比例，说明红葱ebpds与拟南芥atpds、西洋菜nopds、油菜bnpds、芥蓝bopds和番茄slpds氨基酸序列同源性非常高，如(图2)。
[0060]
(2)目的基因片段扩增及载体构建
[0061]
以红葱混合样cdna为模板，通过同源克隆的方法，扩增获得目的基因序列片段(图3)，其中红葱的ebpds目的片段扩增产物大小为448bp。
[0062]
(3)ebpds基因沉默红葱植株的基因表达分析
[0063]
使用ptrv2-ebpds重组病毒载体的农杆菌对红葱植株进行侵染后14天，使用jc-ptrv2、ptrv2-pds引物进行pcr分子检测，检测trv病毒是否可以成功侵染红葱植株，结果表明注射法叶片内未检测到目的基因，而真空法仅处理b(真空渗透30s，渗透2次)的叶片内可检测到目的基因导入，说明trv病毒成功进入红葱体内并存活，真空法检测结果(图4)表明，ptrv2-ebpds成功导入植株。
[0064]
在真空渗透侵染法中，对pds基因沉默红葱的叶片和ptrv2对照组处理的红葱叶片分别进行叶片的总rna提取。qrt-pcr分析结果(图5)中，沉默处理组的ebpds平均表达水平相比ptrv2对照组下降了54.4％，呈显著下降。表明真空处理b法(真空渗透30s，渗透2次)沉默处理后，红葱ebpds基因的表达受到抑制，说明真空渗透30s，渗透2次可以实现trv病毒沉默红葱植株的目标基因。
[0065]
(4)沉默红葱植株的表型分析
[0066]
八氢蕃茄红素脱氢酶(pds)是类胡萝卜素合成途径的关键酶，pds基因沉默后叶片会出现光漂白现象。使用真空法进行vigs处理后，4种真空渗透处理中，(a，真空渗透30s，渗透1次；b，真空渗透30s，渗透2次；c，真空渗透60s，渗透1次；d，真空渗透60s，渗透2次；)仅处理b(真空渗透30s，渗透2次)出现光漂白表型。对成功出现漂白表型的红葱植株，红葱叶片显现不同程度的变化，叶片失绿，出现光漂白表型，叶片中间部位主要开始出现白化现象，而叶斑则在靠近叶梢处呈现(图6)。对照组红葱植株叶片未见光漂白表型，此结果表明，使用真空渗透法，设置真空渗透30s，渗透2次，trv病毒介导的vigs体系可将红葱pds基因成功沉默。
[0067]
本发明中首次利用八氢番茄红素脱氢酶(pds)基因，验证vigs体系可应用于红葱，并构建了ptrv2-ebpds的vigs沉默载体，对红葱植株进行沉默处理，结果表明vigs体系可以成功应用于红葱基因功能验证。实验中进行真空渗透处理方法的探索，设计了2个影响因素，分别为真空渗透时间、真空渗透次数。实验结果中，处理b，真空渗透30s，渗透2次，这一真空处理后，红葱植株出现了光漂白表型，其他三个处理均未出现光漂白表型。
[0068]
实施例2：利用vigs体系开展红葱ebmyb5和ebmyb52基因功能研究
[0069]
1、ebmyb5和ebmyb52引物设计及载体构建
[0070]
载体构建方法同实施例1。ebmyb5(该基因核苷酸序列如seq id no.3所示)和ebmyb52(该基因核苷酸序列如seq id no.4所示)，在vigs实验中，ptrv2-ebmyb5的载体构建使用引物：引物序列5
’‑3’
f:taccgaattctctagagtgtggcacacccacttaaag；r:cttcgggacatgcccgggtcagatatcaggcaattccagag，目的片段长度300bp。ptrv2-ebmyb52的载体构建使用引物：引物序列5
’‑3’
f:taccgaattctctagacgacccgtgtccgtcgcctcccc；r:cttcgggacatgcccgggtcatgatctatagtatctaatcac，目的片段长度351bp。在ptrv2载体中选用的酶切位点均为xba i：tctaga，上游；smal i：cccggg，下游。利用vigs技术沉默后，分别侵染得到trv2-ebmyb5或trv2-ebmyb52沉默红葱植株，利用实时荧光定量(所用引物如表3中所示)分析沉默后红葱植株中色素合成相关的ebmyb5和ebmyb52基因的表达水平。另外，选择红葱花色素苷生物合成的其他关键酶基因，分别为查尔酮异构酶基因(chi，该基因核苷酸序列如seq id no.5所示)、查尔酮合成酶基因(chs，该基因核苷酸序列如seq id no.6所示)、无色花色素双加氧酶基因(ldox，该基因核苷酸序列如seq id no.7所示)、类黄酮3
’‑
羟化酶基因(f3’h，该基因核苷酸序列如seq id no.9所示)、黄酮糖基转移酶基因(ufgt，该基因核苷酸序列如seq id no.8所示)等色素合成相关基因进行检测，引物见表3。
[0071]
表3 vigs qrt-pcr引物表
[0072][0073]
2、利用vigs体系进行ebmyb5和ebmyb52基因沉默
[0074]
利用实施例1筛选的优化的真空转化法侵染红葱植株，侵染后，于25℃、16h/8h光照/黑暗、相对湿度75％的人工气候箱中培养2～3周后进行表型观察(图7)。
[0075]
对ebmyb5、ebmyb52基因沉默红葱植株进行取样，利用跨越所选载体酶切位点两端通用的检测引物jc-ptrv2(引物序列5
’‑3’
，f：ggacattgttactcaaggaagcac，r：gtcgagaatgtcaatctcgtagg)检测沉默植株中的trv2-ebmyb5和trv2-ebmyb52成功导入植株(图8)。
[0076]
采用表3中的实时荧光定量引物检测非沉默样品(ck)、沉默对照组样品(trv2)和沉默处理组样品(trv2-ebmyb5)的ebmyb5、ebmyb52基因表达水平(图9，图10)，与红葱非沉默样品、以及沉默对照组叶片相比，沉默处理组样品被侵染的叶片中ebmyb5、ebmyb52基因表达量显著降低。花色素苷生物合成的关键酶查尔酮异构酶(chi)、查尔酮合成酶(chs)、无色花色素双加氧酶(ldox)、黄酮糖基转移酶(ufgt)的基因表达水平也显著降低。类黄酮3
’‑
羟化酶(f3’h)基因表达水平却出现上调。在分子水平上说明红葱vigs成功沉默ebmyb5、ebmyb52基因后，对红葱花色素苷生物合成的途径产生了一定的影响。