非酒精性脂肪肝标志微生物及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体的，本发明涉及非酒精性脂肪肝标志微生物及其应用，更具体的，本发明涉及一种试剂盒、试剂在制备试剂盒中的用途、用于预防或者治疗非酒精性脂肪肝的药物组合物或者食品组合物、确定个体是否患有非酒精性脂肪肝的方法、确定个体是否患有非酒精性脂肪肝的装置、一种装置、一种筛选药物的方法。


背景技术：

2.非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，nafld)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。非酒精性脂肪性肝病是遗传、环境、代谢相关性疾病，为西方国家最常见的慢性肝病，在我国是继病毒性肝炎后第二位的常见肝病，常与肥胖、2型糖尿病、高血压等代谢综合征并存。近几年，非酒精性脂肪性肝病与遗传的关系越来越受到关注。
3.已有研究表明，肠道微生物有害产物会导致肝脏损伤，形成非酒精性脂肪性肝病，因此，积极探索非酒精性脂肪肝相关微生物物种标志物对研究、治疗及预防非酒精性脂肪肝具有重要意义。


技术实现要素：

4.本技术是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
5.本技术的申请人通过前期大量研究，意外地发现一些微生物可以作为检测非酒精性脂肪肝的标志微生物，为早期发现非酒精性脂肪肝提供一种非侵入性方法；合理有效地应用标志微生物，扶持肠道有益菌的生长，抑制肠道潜在致病菌，可以治疗或减轻非酒精性脂肪肝的临床症状。
6.为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括适于检测第一微生物集中的至少一种菌种的试剂，所述第一微生物集由以下菌种组成：gardnerella菌属、butyricimonas菌属、odoribacter菌属、alistipes菌属、anaerococcus菌属、peptoniphilus菌属、anaerotruncus菌属、梭菌属(clostridium)iv、flavonifractor菌属、考拉杆菌属phascolarctobacterium、sneathia菌属、oxalobacter菌属、parasutterella菌属和cloacibacillus菌属。本发明实施例的标志微生物是发明人通过对大量患非酒精性脂肪肝个体和大量健康对照个体的粪便样本中微生物的丰度进行差异比较分析和验证而确定下来的，从而明确了非酒精性脂肪肝相关的微生物标志物，根据本发明实施的包含检测所述标志微生物中第一微生物集的至少之一菌种的试剂的试剂盒可以非侵入性的在早期发现或辅助检测非酒精性脂肪肝，准确确定个体患有非酒精性脂肪肝的概率高低或者处于健康状态的概率高低。
7.在本发明的第二方面，本发明提出了试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂适于检测第一微生物集中的至少一种菌种。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于诊断脂非酒
精性脂肪肝或检测非酒精性脂肪肝的治疗效果，所述第一微生物集由以下菌种组成：gardnerella菌属、butyricimonas菌属、odoribacter菌属、alistipes菌属、anaerococcus菌属、peptoniphilus菌属、anaerotruncus菌属、梭菌属(clostridium)iv、flavonifractor菌属、考拉杆菌属phascolarctobacterium、sneathia菌属、oxalobacter菌属、parasutterella菌属和cloacibacillus菌属。根据本发明具体实施例的试剂制备的试剂盒，可以准确的检测所述第一微生物集中的至少一种菌种，极准确的区分非酒精性脂肪肝患者和健康个体，由此，可以有效的在早期进行非酒精性脂肪肝诊断，或用于检测治疗过程中非酒精性脂肪肝的变化。
8.在本发明的第三方面，本发明提出了一种用于预防或者治疗非酒精性脂肪肝的药物组合物或者食品组合物。根据本发明的实施例，含有第一微生物集中的至少一种菌种，所述第一微生物集由以下菌种组成：gardnerella菌属、butyricimonas菌属、odoribacter菌属、alistipes菌属、anaerococcus菌属、peptoniphilus菌属、anaerotruncus菌属、梭菌属(clostridium)iv、flavonifractor菌属、考拉杆菌属phascolarctobacterium、sneathia菌属、oxalobacter菌属、parasutterella菌属和cloacibacillus菌属。根据本发明实施例的非酒精性脂肪肝标志微生物中第一微生物集的菌种可以非侵入性的在早期发现或辅助检测非酒精性脂肪肝，确定个体患有非酒精性脂肪肝的概率高低或者个体处于健康状态的概率高低；同时，提高非酒精性脂肪肝高风险人群或已脂肪肝患者肠道内的所述第一微生物集中的各种菌种，可以降低患非酒精性脂肪肝的概率或减缓、治愈脂肪肝，因此，所述包含所述第一微生物集中的至少一种菌种的药物或者食品组合物能够用于平衡肠道菌群，有效预防或治疗非酒精性脂肪肝。
9.在本发明的第四方面，本发明提出了一种确定个体是否患有非酒精性脂肪肝的方法。根据本发明的实施例，包括：(1)确定所述个体的粪便样本中标志微生物的丰度，所述标志微生物包括第一微生物集和梭菌属(clostridium)xi中的至少一种菌种；(2)将步骤(1)中得到的所述丰度与预定的阈值进行比较，以便确定所述个体是否患有非酒精性脂肪肝；其中，所述第一微生物集由以下菌种组成：gardnerella菌属、butyricimonas菌属、odoribacter菌属、alistipes菌属、anaerococcus菌属、peptoniphilus菌属、anaerotruncus菌属、梭菌属(clostridium)iv、flavonifractor菌属、考拉杆菌属phascolarctobacterium、sneathia菌属、oxalobacter菌属、parasutterella菌属和cloacibacillus菌属。根据本发明实施例的方法可以依据个体的粪便样本中的所述标志微生物中的各种菌种的丰度确定个体是否患有非酒精性脂肪肝，所述标志微生物是发明人对大量已知状态的粪便样本进行验证，通过差异比较分析各种肠道微生物的丰度，而确定下来的。
10.在本发明的第五方面，本发明提出了一种确定个体是否患有非酒精性脂肪肝的装置。根据本发明的实施例，包括：丰度确定单元，用于确定所述个体的粪便样本中标志微生物的丰度，所述标志微生物包括第一微生物集和梭菌属(clostridium)xi中的至少一种菌种；比较单元，用于将所得到的所述丰度与预定的阈值进行比较，以便确定所述个体是否患有非酒精性脂肪肝；其中，所述第一微生物集由以下菌种组成：gardnerella菌属、butyricimonas菌属、odoribacter菌属、alistipes菌属、anaerococcus菌属、peptoniphilus菌属、anaerotruncus菌属、梭菌属(clostridium)iv、flavonifractor菌属、
考拉杆菌属phascolarctobacterium、sneathia菌属、oxalobacter菌属、parasutterella菌属和cloacibacillus菌属。所述标志微生物是发明人通过差异比较分析各种肠道微生物在脂肪肝患者和健康人群的粪便样本中的丰度后经过分析以及对大量已知状态的粪便样本的验证而确定下来的，根据本发明实施例的装置可以准确确定所述个体是否为非酒精性脂肪肝的高风险人群或非酒精性脂肪肝患者。
11.在本发明的第六方面，本发明提出了一种装置。根据本发明的实施例，包括：计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述程序用于第四方面所述的方法；以及一个或者多个处理器，用于执行所述计算机可读存储介质中的程序。根据本发明实施例的装置可以准确确定个体是否为非酒精性脂肪肝的高风险人群或脂肪肝患者。
12.在本发明的第七方面，本发明提出了一种筛选药物的方法。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或者预防非酒精性脂肪肝，所述方法包括：将候选药物施用于受试者，检测施用前后，所述受试者粪便中标志微生物的丰度，所述标志微生物包括第一微生物集和梭菌属(clostridium)xi中的至少一种菌种，其中，满足下列条件至少之一的候选药物适于用于治疗或者预防非酒精性脂肪肝：(1)进行所述施用后，所述第一微生物集中的至少一种菌种的所述丰度升高；和(2)进行所述施用后，所述梭菌属(clostridium)xi的所述丰度降低；其中，所述第一微生物集由以下菌种组成：gardnerella菌属、butyricimonas菌属、odoribacter菌属、alistipes菌属、anaerococcus菌属、peptoniphilus菌属、anaerotruncus菌属、梭菌属(clostridium)iv、flavonifractor菌属、考拉杆菌属phascolarctobacterium、sneathia菌属、oxalobacter菌属、parasutterella菌属和cloacibacillus菌属。根据本发明实施例的方法可以生产或筛选出促进所述标志微生物中第一微生物集中各种菌种生长，和/或抑制肠道标志微生物中梭菌属(clostridium)xi生长的药物，对于辅助减轻脂肪肝的临床症状具有重要意义。
13.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
14.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
15.图1是根据本发明实施例的实验分析流程示意图；以及
16.图2是根据本发明实施例的15个标志微生物综合指标auc评价图，其中，specificity表示特异度，即预测为阳性且实际为阳性，真阳性，纵坐标sensitivity表示敏感度，即真阴性，confidence interval表示置信区间：
17.2-a为一期58个样品数据roc曲线下auc值和置信区间；
18.2-b为二期25个样品数据roc曲线下auc值和置信区间。
具体实施方式
19.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
20.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性
或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
21.术语“任选地”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。由此，限定有“任选地”的特征可以明示或者隐含地包括或不包括该特征。
22.生物学标志物是从生物学介质中可以检测到的细胞/生物化学或分子改变。生物学介质包括各种体液、组织、细胞、粪便、头发、呼气等。
23.微生物的丰度是指在某一微生物群体中该种微生物的丰富程度，例如在肠道微生物群体中的该种微生物程度，可表示为该种微生物在该群体中的含量。
24.根据本发明提供的一种试剂盒，所述试剂盒包括适于检测第一微生物集中的至少一种菌种的试剂，所述第一微生物集由以下菌种组成：gardnerella菌属、butyricimonas菌属、odoribacter菌属、alistipes菌属、anaerococcus菌属、peptoniphilus菌属、anaerotruncus菌属、梭菌属(clostridium)iv、flavonifractor菌属、考拉杆菌属phascolarctobacterium、sneathia菌属、oxalobacter菌属、parasutterella菌属和cloacibacillus菌属。
25.根据本发明的具体实施方案，所述试剂盒进一步包括适于检测梭菌属(clostridium)xi的试剂。
26.根据本发明的具体实施方案，所述试剂盒包括适于检测所述第一微生物集中全部所述菌种的试剂。
27.根据本发明的具体实施方案，所述标志微生物是发明人通过对大量患非酒精性脂肪肝个体和大量健康对照个体的粪便样本中的微生物的丰度的差异比较分析、以及验证，而确定下来的，明确了肠道微生物中非酒精性脂肪肝相关的微生物标志物。利用包含检测所述标志微生物的试剂的试剂盒能够确定个体处于患有非酒精性脂肪肝状态的概率高低或者处于健康状态的概率高低，能够用于非侵入性的早期发现或辅助检测非酒精性脂肪肝。
28.根据本发明的具体实施方案，所述适于检测所述第一微生物集和/或梭菌属(clostridium)xi的试剂不受特别限制，可以检测所述微生物菌种的试剂均包含在本发明的范围内，如通过形态学特征、生理生化反应特征、生态学特征以及血清学反应、对噬菌体的敏感性、分子生物学等方面检测所述微生物菌种的试剂等，具体的，如抗体、酶、核酸分子。
29.本文中，所述微生物形态学特征指：在显微镜下观察微生物外形大小、形状、排列等，细胞构造，革兰氏染色反应，能否运动、鞭毛着生部位和数目，有无芽孢和荚膜、芽孢的大小和位置，放线菌和真菌的繁殖器官的形状、构造，孢子的数目、形状、大小、颜色和表面特征等。
30.本文中，所述微生物生理生化反应特征指：微生物利用物质的能力、代谢产物的特殊性，如是否产生h2s、吲哚、co2、醇、有机酸，能否还原硝酸盐，能否使牛奶凝固、冻化等、生长环境(适宜生长的温度、湿度、氧气及二氧化碳等气体的浓度、ph、是否耐高渗、是否有嗜盐性等)、与其它生物间的关系(如：共生、寄生、宿主范围及致病情况)等。
31.本文中，所述微生物血清学反应指：利用抗原与抗体的高度敏感特异性反应，来鉴
别相似的菌种，或对同种微生物分型，如用已知菌种、型或菌株制成的抗血清，与待鉴定的所述微生物是否发生特异性的血清学反应来鉴定微生物。
32.本文中，分子生物学方法检测微生物主要包括：利用pcr技术、高通量测序等方法。
33.根据本发明提供的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂适于检测第一微生物集中的至少一种菌种，所述试剂盒用于诊断脂肪肝或者检测脂肪肝的治疗效果，所述第一微生物集由以下菌种组成：gardnerella菌属、butyricimonas菌属、odoribacter菌属、alistipes菌属、anaerococcus菌属、peptoniphilus菌属、anaerotruncus菌属、梭菌属(clostridium)iv、flavonifractor菌属、考拉杆菌属phascolarctobacterium、sneathia菌属、oxalobacter菌属、parasutterella菌属和cloacibacillus菌属。
34.根据本发明的具体实施方案，所述标志微生物是发明人通过对大量患非酒精性脂肪肝个体和大量健康对照个体的粪便样本中的微生物的丰度的差异比较分析、以及验证，而确定下来的，明确了肠道微生物中非酒精性脂肪肝相关的微生物标志物。利用检测所述标志微生物的试剂能够确定个体患有非酒精性脂肪肝的概率高低或者处于健康状态的概率高低，能够用于非侵入性的早期发现或辅助检测非酒精性脂肪肝。
35.根据本发明一些具体的实施方案，所述试剂进一步适于检测梭菌属(clostridium)xi。
36.根据本发明的具体实施例，所述适于检测所述第一微生物集或梭菌属(clostridium)xi的试剂不受特别限制，可以检测所述微生物菌种的试剂均包含在本发明的范围内，如通过形态学特征、生理生化反应特征、生态学特征以及血清学反应、对噬菌体的敏感性、分子生物学等方面检测所述微生物菌种的试剂等，具体的，如抗体、酶、核酸分子。
37.本文中，所述微生物形态学特征指：在显微镜下观察微生物外形大小、形状、排列等，细胞构造，革兰氏染色反应，能否运动、鞭毛着生部位和数目，有无芽孢和荚膜、芽孢的大小和位置，放线菌和真菌的繁殖器官的形状、构造，孢子的数目、形状、大小、颜色和表面特征等。
38.本文中，所述微生物生理生化反应特征指：微生物利用物质的能力、代谢产物的特殊性，如是否产生h2s、吲哚、co2、醇、有机酸，能否还原硝酸盐，能否使牛奶凝固、冻化等、生长环境(生长的温度、湿度、氧气及二氧化碳等气体的浓度、ph、是否耐高渗、是否有嗜盐性等)、与其它生物间的关系(如：共生、寄生、宿主范围及致病情况)等。
39.本文中，所述微生物血清学反应指：利用抗原与抗体的高度敏感特异性反应，来鉴别相似的菌种，或对同种微生物分型，如用已知菌种、型或菌株制成的抗血清，与待鉴定的所述微生物是否发生特异性的血清学反应来鉴定微生物。
40.本文中，分子生物学方法检测微生物主要包括：利用pcr技术、高通量测序等方法。
41.根据本发明提供的一种确定个体是否患有非酒精性脂肪肝的方法，包括步骤(1)和(2)。
42.(1)确定所述个体的粪便样本中的标志微生物的丰度。
43.所述标志微生物包括第一微生物集和梭菌属(clostridium)xi中的至少一种菌种。其中，所述第一微生物集由以下菌种组成：gardnerella菌属、butyricimonas菌属、odoribacter菌属、alistipes菌属、anaerococcus菌属、peptoniphilus菌属、
anaerotruncus菌属、梭菌属(clostridium)iv、flavonifractor菌属、考拉杆菌属phascolarctobacterium、sneathia菌属、oxalobacter菌属、parasutterella菌属和cloacibacillus菌属。
44.根据本发明的一些具体的实施方案，步骤(1)进一步包括：获得所述个体的粪便样本中的核酸测序数据；将所述测序数据与参考基因组进行比对；基于所述比对的结果，确定所述标志微生物的丰度。
45.根据本发明的具体实施方案，在步骤(1)中，按照下列公式确定所述标志微生物的丰度：ab(s)＝ab(us)+ab(ms)，其中其中，s表示所述标志微生物的编号，ab(s)表示所述标志微生物s的丰度，ab(us)＝us/ls，us为所述测序数据中与所述标志微生物s的参考基因组唯一比对的读段数目，ls为所述标志微生物s的参考基因组的总长度，ms为所述测序数据中与所述标志微生物s的参考基因组非唯一比对的读段的数目，i表示所述非唯一比对读段的编号，coi为所述第i读段对应的丰度系数，co
i,s
表示针对所述标志微生物s，所述非唯一比对的读段i的丰度系数，n为所述非唯一比对的读段i能够比对的微生物的总数，j表示所述非唯一比对的读段i能够比对的微生物的编号。
46.所称的测序数据通过对样本中的核酸序列进行测序得来，测序依据所选的测序平台的不同，可选择但不限于半导体测序技术平台比如pgm、ion proton、bgiseq-100平台，合成边测序的技术平台比如illumina公司的hiseq、miseq序列平台以及单分子实时测序平台比如pacbio序列平台。测序方式可以选择单端测序，也可以选择双末端测序，获得的下机数据是测读出来的片段，称为读段(reads)。
47.比对可以利用已知比对软件进行，例如soap、bwa和teramap等，在比对过程中，一般对比对参数进行设置，设置一个或者一对读段(reads)最多允许有s个碱基错配(mismatch)，例如设置s≤2，若reads中有超过s个碱基发生错配，则视为该reads无法比对到(比对上)该组装片段上。所称的获得的比对结果包含各条读段与各物种的参考基因组的比对情况，包括读段是否能够比对上某个或某些物种的参考基因组、只唯一比对到一种物种还是比对到多种物种的参考基因组、比对到物种的参考基因组的位置、比对到物种参考基因组的唯一位置还是多个位置等信息。
48.所称菌种/微生物的参考基因组指预先确定的该微生物物种的序列，可以是预先获得的待测样本所属或者所包含的生物类别的任意参考模板，例如，目标是待测样本中的微生物，参考序列可选择ncbi数据库中的各种微生物的参考基因组和/或hmp、metahit项目公开的dacc肠道基因组，进一步地，也可以预先配置包含更多参考序列的资源库，例如依据待测样本来源的个体的状态、地域等因素选择或是测定组装出更接近的序列作为参考序列。根据本发明的一个实施例，各种微生物的参考基因组从公开的数据库中获得，通常的，一种微生物的参考基因组有多个版本，即一种微生物有多个公开的参考基因组。
49.reads与物种的参考基因组比对，比对上的可以被分为两部分：a)unique reads(u)：唯一比对上一个物种的基因组；称这些reads为unique reads。即，如果reads比对上的基因组均来自同一物种，定义这些reads为unique reads。b)multiple reads(m)：比对上一
个以上物种的基因组，定义为multiple reads。即，如果reads比对上的基因组来自至少两种物种，定义这些reads为multiple reads。
50.(2)丰度比较，以确定个体是否患有非酒精性脂肪肝。
51.根据本发明的一个实施例，将步骤(1)中得到的所述丰度与预定的阈值进行比较，以便确定所述个体是否患有酒精性脂肪肝。
52.根据本发明的一些具体实施例，所述阈值为预先设定的，包括患酒精性脂肪肝丰度阈值和不患酒精性脂肪肝丰度阈值。将标志微生物在待测个体样本中的丰度与所述的阈值比较，基于所述待测个体样本中的丰度是否达到所述阈值，进行待测个体的状态的确定。所述阈值可以为一数值或者数值范围，例如，基于已知患病或健康状态个体中的标志微生物的丰度均值，该微生物对应的阈值可以设为该丰度均值的95％的置信区间。
53.所述的置信区间是指由样本统计量所构造的总体参数的估计区间。在统计学中，一个概率样本的置信区间(confidence interval)是对这个样本的某个总体参数的区间估计。置信区间展现的是这个参数的真实值有一定概率落在测量结果的周围的程度。置信区间给出的是被测量参数的测量值的可信程度，即前面所要求的“一定概率”，这个概率被称为置信水平。
54.根据本发明的一些具体实施例，当步骤(1)中确定的标志微生物的丰度达到所述患酒精性脂肪肝丰度阈值，未达到所述不患非酒精性脂肪肝丰度阈值时，确定所述个体患有非酒精性脂肪肝，当(1)中确定的标志微生物的丰度达到不患非酒精性脂肪肝丰度阈值，未达到患非酒精性脂肪肝丰度阈值时，确定所述个体不患非酒精性脂肪肝。
55.需要说明的是，根据目的或要求不同，可能对确定个体状态结果的可信程度有不同的要求，本领域技术人员可以选择不同的显著性水平或阈值。
56.该方法基于检测个体的粪便样本中的标志微生物中的各种菌种的丰度，分别将检测确定的各种菌种的丰度与其阈值进行比较，依据获得的比较结果能够确定个体为非酒精性脂肪肝个体或者为健康个体的概率。为早期发现非酒精性脂肪肝提供一种非侵入性的辅助检测或者辅助干预治疗的方法。
57.以上任一实施例中的利用标志微生物确定个体是否患有非酒精性脂肪肝的方法的全部或部分步骤，可以利用包含可拆分的相应单元功能模块的装置/系统来施行，或者将方法程序化、存储于机器可读介质，利用机器运行该可读介质来实现。
58.根据本发明提供的一种确定个体是否患有非酒精性脂肪肝的装置，该装置包括：丰度确定单元，用于确定所述个体的粪便样本中的所述标志微生物的丰度；比较单元，用于将所得到的所述丰度与预定的阈值进行比较，以便确定所述个体是否患有非酒精性脂肪肝；其中，所述第一微生物集由以下菌种组成：gardnerella菌属、butyricimonas菌属、odoribacter菌属、alistipes菌属、anaerococcus菌属、peptoniphilus菌属、anaerotruncus菌属、梭菌属(clostridium)iv、flavonifractor菌属、考拉杆菌属phascolarctobacterium、sneathia菌属、oxalobacter菌属、parasutterella菌属和cloacibacillus菌属。上述对本发明任一实施例的利用标志微生物确定个体是否患有非酒精性脂肪肝的方法的技术特征和优点的描述，同样适用本发明这一方面的装置，在此不再赘述。
59.根据本发明的实施例，所述丰度确定单元适于通过下列步骤确定所述丰度：获得
所述个体的粪便样本中的核酸测序数据；将所述测序数据与参考基因组进行比对；基于所述比对的结果，确定所述标志微生物的丰度。
60.所称的测序数据通过对样本中的核酸序列进行测序得来，测序依据所选的测序平台的不同，可选择但不限于半导体测序技术平台比如pgm、ion proton、bgiseq-100平台，合成边测序的技术平台比如illumina公司的hiseq、miseq序列平台以及单分子实时测序平台比如pacbio序列平台。测序方式可以选择单端测序，也可以选择双末端测序，获得的下机数据是测读出来的片段，称为读段(reads)。
61.比对可以利用已知比对软件进行，例如soap、bwa和teramap等，在比对过程中，一般对比对参数进行设置，设置一个或者一对读段(reads)最多允许有s个碱基错配(mismatch)，例如设置s≤2，若reads中有超过s个碱基发生错配，则视为该reads无法比对到(比对上)该组装片段上。所称的获得的比对结果包含各条读段与各物种参考的基因组的比对情况，包括读段是否能够比对上某个或某些物种的参考基因组、只唯一比对到一种物种还是比对到多种物种的参考基因组、比对到物种的参考基因组的位置、比对到物种参考基因组的唯一位置还是多个位置等信息。
62.所称微生物的参考基因组指预先确定的该微生物物种的序列，可以是预先获得的待测样本所属或者所包含的生物类别的任意参考模板，例如，目标是待测样本中的微生物，参考序列可选择ncbi数据库中的各种微生物的参考基因组和/或hmp、metahit项目公开的dacc肠道基因组，进一步地，也可以预先配置包含更多参考序列的资源库，例如依据待测样本来源的个体的状态、地域等因素选择或是测定组装出更接近的序列作为参考序列。根据本发明的一个实施例，各种微生物的参考基因组从公开的数据库中获得，通常的，一种微生物的参考基因组有多个版本，即一种微生物有多个公开的参考基因组。
63.reads与物种的参考基因组比对，比对上的可以被分为两部分：a)unique reads(u)：唯一比对上一个物种的参考基因组；称这些reads为unique reads。即，如果reads比对上的参考基因组均来自同一物种，定义这些reads为unique reads。b)multiple reads(m)：比对上一个以上物种的参考基因组，定义为multiple reads。即，如果reads比对上的参考基因组来自至少两种物种，定义这些reads为multiple reads。
64.根据本发明的一个实施方案，按照下列公式确定所述标志微生物的丰度：ab(s)＝ab(us)+ab(ms)，其中，s表示所述标志微生物的编号，ab(s)表示所述标志微生物s的丰度，ab(us)＝us/ls，us为所述测序数据中与所述标志微生物s的参考基因组唯一比对的读段数目，ls为所述标志微生物s的参考基因组的总长度，ms为所述测序数据中与所述标志微生物s的参考基因组非唯一比对的读段的数目，i表示所述非唯一比对读段的编号，coi为所述第i读段对应的丰度系数，co
i,s
表示针对所述标志微生物s，所述非唯一比对的读段i的丰度系数，n为所述非唯一比对的读段i能够比对的微生物的总数，j表示所述非唯一比对的读段i能够比对的微生物的编号。上述对本发明任一实施例的利用标志微生物确定个体是否患有非酒精性脂肪肝的方法的技术特征和优点的描述，同样适用本发明这一方面的装置，在此不再赘述。
65.根据本发明提供的一种装置，包括：计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述程序用于执行前面所述的一种确定个体是否患有非酒精性脂肪肝的方法；以及一个或者多个处理器，用于执行所述计算机可读存储介质中的程序。
66.根据本发明提供的一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗或者预防非酒精性脂肪肝，所述方法包括：将候选药物施用于受试者，检测施用前后，所述受试者粪便中标志微生物的丰度，所述标志微生物包括第一微生物集和梭菌属(clostridium)xi中的至少一种菌种，其中，满足下列条件至少之一的候选药物适于用于治疗或者预防非酒精性脂肪肝：(1)进行所述施用后，所述第一微生物集中的至少一种菌种的所述丰度升高；和(2)进行所述施用后，所述梭菌属(clostridium)xi的所述丰度降低；其中，所述第一微生物集由以下菌种组成：gardnerella菌属、butyricimonas菌属、odoribacter菌属、alistipes菌属、anaerococcus菌属、peptoniphilus菌属、anaerotruncus菌属、梭菌属(clostridium)iv、flavonifractor菌属、考拉杆菌属phascolarctobacterium、sneathia菌属、oxalobacter菌属、parasutterella菌属和cloacibacillus菌属。根据本发明实施例的方法可以生产或筛选出促进所述标志微生物中第一微生物集中各种菌种生长和/或抑制肠道标志微生物中梭菌属(clostridium)xi生长的药物，对于辅助减轻脂肪肝的临床症状具有重要意义。
67.利用本发明这一方面的生产或筛选治疗非酒精性脂肪肝的药物的方法，通过合理有效地应用确定的非酒精性脂肪肝生物标志物进行筛选，能够获得能扶持肠道有益菌的生长和/或抑制肠道潜在致病菌的药物，对于辅助降低血内毒素水平和/或减轻非酒精性脂肪肝的临床症状具有重要意义。
68.下面将对实施例作具体介绍。以下实施例中涉及的未特别交待的试剂、序列、软件及仪器，都是常规市售产品。
69.实施例1生物标志物的鉴定
70.1、样本收集和dna提取
71.非酒精性脂肪肝患者和健康对照共83个个体均来自于浙江大学医学院附属第一医院，实验人员共采集了51例非酒精性脂肪肝患者和32例健康对照的粪便样品，其中每个个体的新鲜粪便样品分成200mg/份，共5份，立即-80℃冰箱冷冻保存。采用苯酚三氯甲烷处理提取dna方法提取51个中国非酒精性脂肪性肝患者的粪便样品和32例健康对照的粪便样品总dna。
72.2、构建dna文库和测序
73.dna建库按仪器制造商(illumina)的操作指南进行。对文库进行pe250 bp测序。illumina miseq平台对51例中国非酒精性脂肪性肝患者和32例健康对照总共83份粪便样品每份样品中肠道菌群dna的16s rdna高变区即v3-v4区的序列进行测序。每个样本平均产生30.48mb(sd.
±
4.16mb)高质量测序结果，总计2.53gb测序数据量。其中36例中国非酒精性脂肪性肝患者和22例健康对照作为一期，15例中国非酒精性脂肪性肝患者和10例健康对照作为二期。
74.参照图1的实验流程，鉴定非酒精性脂肪肝的相关生物标志物，其中省略的步骤或者细节为本领域技术人员所熟知，几个重要步骤介绍如下面所述。
75.3、微生物物种丰度分析
76.3.1序列优化统计
77.对所有样本的数据每个通过pandaseq(v2.9)软件利用重叠关系将双末端测序得到的成对reads拼接成一条序列，得到高变区的长reads。然后使用内部撰写的程序对拼接后的reads进行如下处理，以获取cleanreads：1)去除平均质量值低于20的reads；2)去除reads含n的碱基数超过3个的reads；3)reads长度范围为250～500nt，统计clean reads的长度分布和数量。
78.3.2 otu分析
79.为便于下游物种多样性分析，将长reads聚类为otus(operational taxonomic units)。首先把拼接的长reads中的singletons(对应reads只有一条的序列)过滤掉，因为singletons可能由于测序错误造成，故将这部分序列去除，不加入聚类分析，利用usearch(v7.0.1090)在0.97相似度下进行聚类，对聚类后的序列进行嵌合体过滤后，得到用于物种分类的otu，每个otu被认为可代表一个物种。
80.对于物种s，其丰度为ab(s)，与特有的u reads和共享的m reads相关，丰度的计算方式如下：
81.ab(s)＝ab(us)+ab(ms)，
82.其中，s表示所述标志微生物的编号，
83.ab(s)表示所述标志微生物s的丰度，
84.ab(us)＝us/ls，
85.us为所述测序数据中与所述标志微生物s的参考基因组唯一比对的读段数目，
86.ls为所述标志微生物s的参考基因组的总长度，
[0087][0088]ms
为所述测序数据中与所述标志微生物s的参考基因组非唯一比对的读段的数目，
[0089]
coi为所述第i读段对应的丰度系数，
[0090][0091]
i表示所述非唯一比对读段的编号，
[0092]
co
i,s
表示针对所述标志微生物s，所述非唯一比对的读段i的丰度系数，
[0093]
n为所述非唯一比对的读段i能够比对的微生物的总数，
[0094]
j表示所述非唯一比对的读段i能够比对的微生物的编号。
[0095]
3.3物种注释和otu丰度表分析
[0096]
从各个otu中挑选出一条序列，作为该otu的代表序列。将该代表序列，用rdp方法，与已知物种的16s数据库(rdp，http://rdp.cme.msu.edu)进行比对，从而对每个otu进行物种归类。归类后，根据每个otu中序列的条数，从而得到otu丰度表。这里得到的otu丰度表就是16s测序技术对应的物种丰度表。
[0097]
3.4物种丰度分析
[0098]
在门、纲、目、科、属水平，将每个注释上的物种或otu在不同样品中的序列数整理在一张表格中，形成profiling柱状图、星形图及统计表。
[0099]
实施例2筛选微生物物种标记物
[0100]
为了获得与非酒精性脂肪肝疾病密切相关的肠道微生物物种标记物，发明人利用一期非酒精性脂肪性肝病患者组(36例)与正常人组(22例)两组肠道微生物物种丰度数据，在物种级别做了一个与疾病相关性的研究。基于实施例1中得到的物种丰度表(即otu丰度表)，发明人设置标准如下：(1)通过结合benjamini hochberg的多重检验的wilcoxon秩和检验进行检验，得到每个物种和非酒精性脂肪性肝病疾病的相关性p值和q值；(2)使用一个具有统计意义的的阈值(p值《0.05)，利用上述参数进行筛选。发明人得到15个与非酒精性脂肪性肝病疾病密切相关的肠道微生物物种，具体实验操作及数据分析如下所示：
[0101]
36例中国非酒精性脂肪性肝患者和22例健康对照数据来自实施例1所述的一期数据，所得15个与非酒精性脂肪性肝病疾病密切相关的肠道微生物物种的分析数据如表1所示，其中，在非酒精性脂肪性肝病(nafld)患者中富集的有1个物种clostridium xi，在正常人(hd)中富集的有14个物种。
[0102]
表1：
[0103]
分类p值q值来源clostridium xi0.0354078750.306868247nafldgardnerella0.0011715160.032214301hdbutyricimonas0.0338401460.306868247hdodoribacter0.0004714540.032214301hdalistipes0.0010230290.032214301hdanaerococcus0.0044237590.092014193hdpeptoniphilus0.0012390120.032214301hdanaerotruncus0.0071171360.105740304hdclostridium_iv0.0056606350.098117673hdflavonifractor0.0479231360.332267077hdphascolarctobacterium0.0088577670.115150966hdsneathia0.0329523090.306868247hdoxalobacter0.040603460.32482768hdparasutterella0.0478593040.332267077hdcloacibacillus0.0221942330.256466688hd
[0104]
实施例3微生物标记物的验证
[0105]
为了验证实施例2中发现的微生物标记物，发明人参照实施例2所述的方法确定二期验证群中的10个健康人及15个非酒精性脂肪性肝患者的粪便样本中的表1所示15种菌属的丰度，并判断各样本种的这15种菌属丰度是否落入实施例2确定出的疾病组或健康组的95％的置信区间，判定1种菌种的丰度落入疾病组对应区间的样本所对应的个体的状态为非酒精性脂肪性肝患者，判定14种菌种的丰度落入健康组的对应区间的样本所对应的个体的状态不是非酒精性脂肪性肝患者。根据分析结果对表1中所示微生物物种标记物做出删选，验证群体的测序数据的获得与处理参照实施例2进行。
[0106]
验证结果如下：验证富集在非酒精性脂肪性肝病患者中的1个物种，1个在验证集找到高质量的验证(p值《0.05)，非酒精性脂肪性肝病患者富集的微生物物种标志物验证的
p值和q值情况如下表(表3)所示。
[0107]
表2：
[0108]
分类p值q值来源clostridium xi0.0268976980.487384607nafld
[0109]
发明人将非酒精性脂肪性肝病患者富集的1个微生物物种标记物作为非酒精性脂肪性肝病疾病患病的正向指标，特别用于非酒精性脂肪性肝病疾病非创伤式的检测和诊断。发明人将这1个经过验证与非酒精性脂肪性肝病疾病密切相关的微生物物种标记物，进行保护。
[0110]
利用上述物种标记物来诊断、治疗非酒精性脂肪性肝病患者，监测治疗进程，或者生产筛选药物、功能性食品、益生菌，生产检测上述物种标记物的试剂盒以及装置等为本领域技术人员所知悉，皆在本发明的保护范围之内。
[0111]
物种标志物可以选自非酒精性脂肪性肝病患者富集的物种标记物或者健康人群中富集的物种标记物中的一种或者多种。优选的，对于非酒精性脂肪性肝病患者或易感人群，应该检测到表2中的物种标志物被富集。
[0112]
治疗方案中，优选的，使表2中的物种标志物生长得到抑制或者清除，使表1中在健康人群中富集的微生物物种标记物被富集。
[0113]
在健康人群肠道内被富集的其他14个标记物虽然没有在验证过程中满足p值《0.05的条件，但是在以下roc分类判断的一期数据和二期数据评价中，都显示出一定的应用价值。
[0114]
发明人使用15个微生物物种标记物，构建一个综合指标，估计roc(receiver-operating characteristic)曲线下面积auc(auc越大，表示诊断能力越高)，评价综合得分对非酒精性脂肪性肝病的诊断能力。通过一期58个样品和二期25个样品进行评测，在一期得到auc＝84.6％，二期得到auc＝68％，都表现出了很好的诊断能力，具体结果如图2a、图2b所示。
[0115]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0116]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。