一种结合CD40L的融合蛋白及其应用的制作方法

一种结合cd40l的融合蛋白及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种结合cd40l的融合蛋白及其应用。


背景技术：

2.cd40l(seq id no:24)又称cd154，属于肿瘤坏死因子(tnf)家族成员。cd40l是ⅱ型跨膜糖蛋白，主要表达于成熟的活化cd4阳性t淋巴细胞和血小板，部分表达于自然杀伤细胞、树突状细胞、单核巨噬细胞、b淋巴细胞，以及非造血系统起源的内皮细胞、上皮细胞和血管平滑肌细胞等(d'orlando o,et al."outside inside signalling in cd40-mediated b cell activation."j biol regul homeost agents.2007；21(3-4):49-62.；antoniades c,et al."the cd40/cd40 ligand system:linking inflammation with atherothrombosis."journal of the american college of cardiology,2009,54(8):669-677.)。cd40l通常以膜结合型cd40配体(mcd40l)和可溶性cd40l(scd40l)两种形式存在。mcd40l与scd40l均以三聚体形式与相应受体cd40(seq id no:25)结合，在启动免疫、调节炎症反应中发挥重要作用。
3.cd40与cd40l结合活化后激活包括核转录因子nf-κb在内的下游信号通路，促进t细胞、b细胞的活化，增加il-1，il-6，il-8，il-12，ifn-γ，tnf-α，单核细胞趋化蛋白(mcp-1)和巨噬细胞炎性蛋白-1(mip-1)等炎症因子在单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞上的表达。cd40/cd40l通过这一系列生物学效应，在自身免疫性疾病的发生发展和炎症反应的调节中发挥重要的作用(karnell,jodi l.,et al."targeting the cd40-cd40l pathway in autoimmune diseases:humoral immunity and beyond."advanced drug delivery reviews 141(2018).)。免疫系统长时间的过度激活会诱发诸如类风湿性关节炎、多发应硬化、银屑病等自身免疫性疾病，而开发针对cd40/cd40l通路的免疫拮抗型药物具有治疗多种自身免疫性疾病的潜力。
4.针对cd40l蛋白开发的抗体类药物在wo2002018445、cn1247472a、cn108135969a、us20180193454a1、cn106687133a等专利中已有报道，这些抗体类的药物含有人抗体fc结构域或者通过peg化的形式延长了药物在体内的半衰期。然而含有人抗体fc的抗cd40l抗体类药物在临床实验中出现了严重的血栓栓塞，导致药物的研发失败，原因是抗体fc段与其受体fcγriia结合后会导致血小板的活化和聚集进而引发血栓栓塞。另一方面，考虑通过peg化的方式消除该风险，但是经过peg化的蛋白免疫原性会增加，同时peg化还会影响蛋白的功能结构域导致活性下降，另外peg化存在连接位点不确定导致工艺质控难度增加。
5.目前尚未有针对cd40l的治疗性抗体药物上市，亟需开发结合cd40l的融合蛋白分子用于免疫系统疾病的治疗，同时进一步降低其副作用。


技术实现要素：

6.针对上述不足，本发明提供了一种结合cd40l的融合蛋白及其应用。本发明提供的结合cd40l的融合蛋白不含有人抗体fc结构域，通过研究发现该融合蛋白在结合cd40l的同
时，不引起任何血小板的活化，在保证其生物活性的同时，极大地提高了其安全性，降低了治疗副作用，为免疫系统疾病的治疗提供了一种新思路及方法。另外，该融合蛋白在稳转细胞系的构建和筛选过程中表现出了极高的表达量，有益于大规模的开发和生产。
7.为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
8.一方面，本发明提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白包括结合人cd40l蛋白的抗体片段和人血清白蛋白或结合人血清白蛋白的抗体片段。
9.具体地，所述的结合人cd40l蛋白的抗体片段包含：
10.(1)seq id no:1所示的氨基酸序列或其变体序列的轻链互补决定区1lcdr1；
11.(2)seq id no:2所示的氨基酸序列或其变体序列的轻链互补决定区2lcdr2；
12.(3)seq id no:3所示的氨基酸序列或其变体序列的轻链互补决定区3lcdr3；
13.(4)seq id no:4所示的氨基酸序列或其变体序列的重链互补决定区1hcdr1；
14.(5)seq id no:5所示的氨基酸序列或其变体序列的重链互补决定区2hcdr2；
15.(6)seq id no:6所示的氨基酸序列或其变体序列的重链互补决定区3hcdr3；
16.优选地，所述变体序列为与其来源的cdr相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的cdr序列；所述的置换为保守置换。
17.进一步具体地，所述的结合人cd40l蛋白的抗体片段包含：
18.(1)、seq id no:7所示的氨基酸序列的轻链可变区vl；和/或，seq id no:8所示的氨基酸序列的重链可变区vh；
19.或者(2)、与(1)中vl相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的vl；和/或，与(1)中vh相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的vh；
20.或者(3)、与(1)中vl相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的vl；和/或，与(1)中vh相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的vh；所述的置换是保守置换。
21.进一步具体地，所述的结合人cd40l蛋白的抗体片段包含：
22.(1)、包含seq id no:9所示的氨基酸序列的轻链lc；和/或，seq id no:10所示的氨基酸序列的重链hc；
23.或者(2)、重链和轻链，其中，与(1)中的重链和轻链相比，所述重链具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；和/或，所述轻链具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
24.进一步具体地，所述的结合人cd40l蛋白的抗体片段的形式为fab或者scfv。
25.具体地，所述的人血清白蛋白包含seq id no:11所示的氨基酸序列。
26.具体地，所述的结合人血清白蛋白的抗体片段为单域抗体，所述的单域抗体包含seq id no:12所示的氨基酸序列。
27.具体地，所述的人血清白蛋白或结合人血清白蛋白的抗体片段通过柔性连接肽连
接到结合人cd40l蛋白的抗体片段轻链或重链的n端或c端。
28.进一步具体地，所述的柔性连接肽为seq id no:13、seq id no:14或seq id no:15所示的氨基酸序列的任意一个，优选为seq id no:15所示的氨基酸序列。
29.具体地，所述的融合蛋白包含：
30.(1)如seq id no:16所示的lc，和/或如seq id no:10所示的hc；或，
31.(2)如seq id no:17所示的lc，和/或如seq id no:10所示的hc；或，
32.(3)如seq id no:18所示的lc，和/或如seq id no:10所示的hc；或，
33.(4)如seq id no:19所示的lc，和/或如seq id no:10所示的hc；或，
34.(5)如seq id no:9所示的lc，和/或如seq id no:20所示的hc；或，
35.(6)如seq id no:9所示的lc，和/或如seq id no:21所示的hc；或，
36.(7)如seq id no:9所示的lc，和/或如seq id no:22所示的hc；或，
37.(8)如seq id no:9所示的lc，和/或如seq id no:23所示的hc。
38.另一方面，本发明提供了一系列编码所述融合蛋白的核酸分子。
39.具体地，所述的核酸分子包含一种或多种经密码子优化的核酸分子。
40.又一方面，本发明提供了一系列载体，所述的载体包含本技术所述的一个或多个核酸分子。
41.具体地，所述的载体包括但不限于质粒、病毒、噬菌体。
42.又一方面，本发明提供了一系列包含上述核酸分子或上述载体的宿主细胞。
43.具体地，所述的宿主细胞包括但不限于微生物、植物或动物细胞，可通过本领域技术人员已知的方法将本发明所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等方法。
44.又一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包含上述融合蛋白、核酸分子、载体和/或宿主细胞。
45.具体地，所述的药物组合物还包含任选的药学上可接受的载体。
46.进一步具体地，所述的药学上可接受的载体包括但不限于：稀释剂、赋形剂、填充剂、润湿剂、崩解剂、矫味剂和粘合剂。
47.具体地，所述的药物组合物还包含组合治疗剂，所述的组合治疗剂包括但不限于化学治疗剂、放射治疗剂、免疫抑制剂、细胞毒性药物。
48.又一方面，本发明提供了上述融合蛋白的生产方法，所述的方法包括在使得所述融合蛋白表达的情况下，培养上述宿主细胞。
49.又一方面，本发明提供了所述的融合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞、和/或药物组合物在制备治疗自身免疫性疾病、抗器官移植排斥反应或器官移植前的脱敏治疗的药物、试剂盒和/或医疗装置中的应用。
50.具体地，所述的自身免疫性疾病包括但不限于：类风湿性关节炎、白塞病、多发性硬化症(包括复发缓解型、继发进展型和原发进展型)、系统性硬化、视神经炎、哮喘、干燥综合征、自身免疫性溶血性贫血、银屑病、白癜风、干眼症、葡萄膜炎、交感性眼炎、伏格特-小柳-原田综合征(vogt-koyanagi-harada syndrome)、结膜类天疱疮、瘢痕性类天疱疮、stevens-johnson综合征、behcet病、肉芽肿性血管炎或韦格纳肉芽肿(wegener's granulomatosis)、斑秃、年龄相关性黄斑变性(amd)、卵巢炎、系统性红斑狼疮、狼疮性肾
炎、药物诱导的自身免疫性疾病或药物诱导的狼疮、血小板减少性紫癜、重症肌无力、甲状腺炎、过敏性鼻炎、鼻息肉、溶血性贫血、炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、igg4相关性疾病、x连锁高igm综合征、混合性结缔组织病、慢性淋巴性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、甲状腺相关眼病、移植物抗宿主病、i型糖尿病、血管炎、强制性脊柱炎、特应性皮炎、湿疹、原发性胆汁性肝硬化、多发性肌炎/皮肌炎、心肌炎、自身免疫性脑炎、视神经脊髓炎谱系疾病和动脉粥样硬化、胰岛素抵抗。
51.具体地，所述的器官移植包括肾脏、心脏、肺脏、肝脏、胰脏等器官移植及其联合移植，还包括骨髓、角膜、皮肤、小肠、心瓣膜、血管、气管、软骨组织、肌腱、骨骼等组织或细胞的移植。
52.又一方面，本发明提供了一种自身免疫性疾病的治疗方法，所述的治疗方法为向有需要的受试者施用有效量的上述融合蛋白、和/或药物组合物。
53.又一方面，本发明提供了一种给药装置，所述的给药装置包含：(1)用于对有需要的受试者施用所述的药物组合物的输注模块，以及(2)任选的药效监控模块。
54.与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
55.(1)本发明提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白能够部分或者完全阻断人cd40与人cd40l的结合并进一步的部分或者完全阻断人cd40l的生物学效应，这些生物学效应包括如促进t细胞的增殖、分化和细胞因子的产生，促进b细胞的增殖、分化和抗体的分泌，促进apc细胞的成熟和抗原提呈，细胞因子如il-1、il-6、il-8、il-12和tnf-α的产生。
56.(2)本发明所述的融合蛋白不含有人抗体fc结构域，在保持其生物活性或阻断活性的同时，不引起任何血小板的活化，在保证其生物活性的同时，极大地提高了其安全性，降低了治疗副作用，为免疫系统疾病的治疗提供了一种新思路及方法。
57.(3)本发明所述的融合蛋白在稳转细胞系的构建和筛选过程中表现出了极高的表达量，有益于大规模的开发和生产，降低生产成本。
附图说明
58.图1为融合蛋白1纯度检测结果图。
59.图2为融合蛋白2纯度检测结果图。
60.图3为融合蛋白3纯度检测结果图。
61.图4为融合蛋白4纯度检测结果图。
62.图5为融合蛋白对cd40和cd40l结合的阻断检测结果图。
63.图6为阳性对照抗体对血小板的激活作用检测结果图。
64.图7为融合蛋白1对血小板的激活作用检测结果图。
65.图8为阴性对照抗体对血小板的激活作用检测结果图。
66.图9为阴性对照对血小板的激活作用检测结果图。
67.图10为letolizumab对血小板的激活作用检测结果图。
68.图11为小鼠eae模型评分结果图。
69.图12为小鼠eae模型体重变化结果图。
70.图13为融合蛋白1给药治疗eae组小鼠脊髓lfb染色结果示例图。
71.图14为pbs治疗eae组小鼠脊髓lfb染色结果示例图。
具体实施方式
72.下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
73.术语定义
74.为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学用语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有的其他技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
75.本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如j.biol.chem,243,p3558(1968,iupac-iub委员会)中所述。
76.本发明所述的“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链(h)和两条相同的轻链(l)通过链间二硫键(s-s)链接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即igm、igd、igg、iga、ige，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、ε链。同一类ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如igg可以分为igg1、igg2、igg3、igg4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类ig中每类ig都可以有κ链或λ链。
77.抗体重链和轻链靠近n端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(fv区)；靠近c端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(hvr)和4个序列相对保守的骨架区(fr)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补决定区(cdr)。每条轻链可变区(vl或lcvr)和重链可变区(vh或hcvr)由3个cdr区和4个fr区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3，fr4。轻链的3个cdr区指lcdr1、lcdr2和lcdr3，重链的3个cdr区指hcdr1、hcdr2和hcdr3。
78.术语“互补决定区cdr”是指：抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。cdr主要负责与抗原表位结合。位于抗体重链可变结构域内的cdr被称作hcdr1、hcdr2和hcdr3，而位于抗体轻链可变结构域内的cdr被称作lcdr1、lcdr2和lcdr3。cdr可根据本领域已知的各种编号系统确定，例如kabat、chothia或，abm或imgt编号系统。本发明的cdr划分是基于抗体序列可变性的kabat等人对cdr的定义(kabat等人，sequences of proteins of immunological interest，第4版，u.s.department of health and human services，national institutes of health(1987))。
79.术语“构架区”或“fr”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的cdr残基以外的那些氨基酸残基。
80.术语“特异性结合”、“选择性结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以用相互作用的解离平衡常数(kd)表示。在本文中，术语“kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，是解离速率常数和结合速率常数(分别是kdis和kon)的比例，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。解离平衡常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通
常，抗体以大约小于10-8
m，例如大约小于10-9
m、10-10
m、10-11
m或更小的亲和力(kd)结合。
81.术语“柔性连接肽”是指：由氨基酸组成的连接肽，例如单独或组合使用的甘氨酸和/或丝氨酸残基，以连接抗体中的各个可变结构域。可以被使用的柔性连接态具有多不同的序列形式，例如ggggsgggs、ggggsggggs、ggggsggggsggggs、kesgsvsseqlaqfrsld、egkssgsgseskst、gsagsaagsgef、epsgpistinsppskeshksp、gtvaapsvfifppsd、ggggiapsmvggggs、ggggkvegagggggs、ggggsmkshdggggs、ggggnlitivggggs、ggggvvpslpggggs、ggeksipggggs、rplsyrppfpfgfpsvrp、yprsiyirrrhpspsltt、tpshlshilpsfglptfn、rpvspftfprlsnswlpa、spaahfprsiprpgpirt、apgpsapshrslpsrafg、prnsihflhpllvaplga、mpslsgvlqvrylsppdl、spqypspltltlpphpsl、npslnppsylhrapsris、lpwrtsllpslplrrrp、pplfakgpvgllsrsfpp、vppapvvslrsaharppy、pnvahvlplltvpwdnlr等。
82.术语“单域抗体”是指：抗体分子的最小抗原结合单元，是从骆驼科动物和软骨鱼血清中克隆得到的只保留重链可变区的具有抗原结合活性的新型抗体，本发明中的“单域抗体”包括来自于自然界的未经改造的重链可变区序列或者经过人源化改造的重链可变区序列。
83.术语“fab”片段包括重链可变结构域和轻链可变结构域，并且还包括轻链的恒定结构域以及重链的第一恒定结构域(ch1)。在一些实施方案中，融合蛋白可以是fab和hsa或者抗hsa的单域抗体的融合，或者是scfv和hsa或者抗hsa的单域抗体的融合，融合蛋白的连接方式可以从结合cd40l抗体片段的氨基端或者羧基端开始。
84.术语“突变体”是指：通过基因水平或者氨基酸水平的插入、删除或替换的方法形成的不同于原有多肽或蛋白序列的新分子，新分子与原分子具有基本上同源的氨基酸序列，这些氨基酸序列可以因为一个或多个不同的氨基酸缺失、插入、和或取代导致新分子具有与原分子提高、相似或降低的功能或特性。本发明中的“突变体”指与原序列在氨基酸水平具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的分子。变体核酸序列可以是与参考核苷酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性可以通过目视检查和/或数学计算确定，或者通过使用用于序列比较的已知计算机程序(例如，clustal package version 1.83)比较序列信息来更容易地确定。变体可以包含具有至少一个保守取代的氨基酸的序列，这意味着给定的氨基酸残基被具有相似的生理化学特性的残基取代。保守取代的实例包括一个脂肪族残基对另一个脂肪族残基的取代，例如ile、val、leu或ala彼此的取代，或一个极性残基对另一个的取代，例如lys和arg之间的取代；glu和asp之间的取代；或gln和asn之间的取代。其他这样的保守取代，例如具有相似疏水性特征的整个区域的取代是公知的(kyte,jack&doolittle,russell.(1982)."a simple method for displaying the hydropathic character of a protein."j.mol.biol..157.105-132.)。例如，“保守氨基酸取代”可以涉及天然氨基酸残基用非天然残基的取代，使得对该位置的氨基酸残基的极性或电荷几乎没有影响。或者，原始多肽中存在的一个或多个氨基酸的取代不是保守的，其可产生与参考抗体相比具有改变的性质的变体。期望的氨基酸取代(无论是保守的还是非保守的)可以由本领域技术人员在需要这样的取代时确定。术语“变体”还包括与参考肽序列基本上同源的肽或多肽，但其具
有不同于参考序列的氨基酸序列，因为一个或多个氨基酸已经被氨基酸类似物化学修饰或取代。
85.术语“单链抗体(scfv)”是其中vl和vh区域通过连接体(例如，氨基酸残基的合成序列)连接形成连续蛋白链的抗体，其中所述连接体长度足以允许蛋白链自身折叠，从而形成单价抗原结合位点(参见，例如，bird等人，1988，science 242：423-26和huston等人，1988，proc.natl.acad.sci.usa 85：5879-83)。
86.术语“n端”和“c端”是指多肽或者多肽片段以及蛋白质或者蛋白质片段氨基酸序列中游离的氨基端(-nh2，n端)和羧基端(-cooh，c端)。
87.术语“同一性”通常是指在比对序列后，查询序列中氨基酸残基或核苷酸与第二参考多肽序列或其部分中相同的残基所占百分比，必要时引入空位(gaps)以实现最大序列同一性百分比，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。用于确定氨基酸/核苷酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域已知的各种方式来实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，例如blast，blast-2，align，needle或megalign(dnastar)。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。同一性百分比可以在整个确定的多肽/多核苷酸序列的长度上测定，或者可以在较短的长度上，例如在从较大的确定的多肽/多核苷酸序列中获得的片段的长度上测定。应当理解，在表，附图或序列表中，本文所示的序列所支持的任何片段长度可用于作为可测量同一性百分比的长度。具有“％同一性”的序列保留与其比较或来源的序列的重要生物活性，如抗体结合特异性。具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的序列保留与其比较或来源的序列的重要生物活性，如抗体结合特异性。具有“％同一性”的核苷酸序列或相差不超过3、6、15、30或45个核苷酸的核苷酸序列能够实现与其比较或来源的核苷酸序列近似的功能，如所表达的蛋白都能特异地结合同一抗原或分子。
88.术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒(如aav1，aav2，aav5，aav6，aav7，aav8和aav9等)、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
89.术语“人血清白蛋白”是指：human serum albumin(hsa)，hsa是一种能够在血浆中长时间滞留的血浆蛋白质，其体内半衰期长达19天。hsa相对分子质量约为66000道尔顿，由3个同源结构域组成，是人体血浆的主要成分之一(含量达40g/l)。由于其水溶性良好，无免疫原性，且本身在体内即作为多种生物分子的载体。
90.术语“宿主细胞”是指：可用于表达核酸，例如本发明的核酸的细胞。宿主细胞可以是原核生物，例如，大肠杆菌(e.coli)，或其可以是真核生物，例如，单细胞真核生物(例如，酵母或其他真菌)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如，人细胞、猴细
胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。宿主细胞的实例包括猴肾细胞的cos-7细胞系(atcc crl 1651)(参见gluzman等人，1981，cell 23：175)、3t3细胞(atcc ccl 163)、中国仓鼠卵巢(cho)细胞或其衍生物例如veggie cho和在无血清培养基上生长的相关细胞系(参见rasmussen等人，1998，cytotechnology 28：31)或cho品系dx-b11(参见urlaub等人，1980，proc.natl.acad.sci.usa 77：4216-20)(所述细胞系在dhfr方面具有缺陷)、hela细胞、bhk(atcc crl 10)细胞系、来源于非洲绿猴肾细胞系cv1(atcc ccl 70)的cv1/ebna细胞系(参见mcmahan等人，1991，embo j.10：2821)、人胚胎肾细胞例如293、人表皮a431细胞、人colo20细胞、其他转化的灵长类动物细胞系、正常的二倍体细胞、来源于灵长类动物组织、灵长类动物外植体的体外培养物的细胞品系、hl-60、u937、或jurkat细胞。一般地，宿主细胞是可用编码多肽的核酸转化或转染的培养细胞，所述核酸因此可在宿主细胞中表达。
91.术语“重组宿主细胞”可用于表示已用要表达的核酸转化或转染的宿主细胞。如果不将调控序列导入宿主细胞以使其有效连接核酸，所述宿主细胞也可以是包含所述核酸但不在想要的水平上表达其的细胞。要理解，术语宿主细胞不仅是指特定的细胞还指该细胞的后代或潜在的后代。因为例如突变或环境影响的原因在连续世代中可发生某些修饰，所以所述后代事实上可以不与亲本细胞相同，但仍然包括在此处所用的术语的范围之内。
92.术语“药学上可接受的载体”或“赋形剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂，其为生理学上相容的。在一个实施方案中，载体适合胃肠外施用。可选地，载体可以适合于静脉内、腹膜内、肌肉内或舌下施用。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和无菌粉末以用于临时制备无菌注射溶液或分散液。对于药学上的活性物质使用此类介质和试剂在本领域是众所周知的。除非任何常规介质或试剂与该活性化合物不相容，否则涵盖其在本发明的药物组合物中的使用。补充性活性化合物也可以并入组合物中。所述的载体或者赋形剂是可以与其他药物或者活性物质同时或者依次使用用于疾病的治疗，这些药物或者活性物质可以选自包括可的松和强的松、甲泼尼龙、甲氨蝶呤、环磷酰胺、来氟米特、霉酚酸酯、环孢素a、他克莫司、格拉替雷、硫唑嘌呤、芬戈莫德、特立氟胺、拉喹莫德、富马酸二甲酯、蒽醌类药物、选择性鞘氨醇1-磷酸(s1p)受体调节剂、钾通道阻滞剂、依库珠单抗、那他珠单抗、干扰素、抗cd19单克隆抗体、抗cd20单克隆抗体、b细胞耗竭剂、抗il-4r单克隆抗体、抗il-33单克隆抗体、抗il-12单克隆抗体、抗il-23单克隆抗体、抗il-17单克隆抗体、抗il-6r单克隆抗体、抗tnf单克隆抗体等。
93.术语“药物组合物”通常是指这样的制剂，其以允许活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对将施用所述组合物的对象具有不可接受的毒性的另外的成分。所述组合物是无菌的。
94.术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如非人灵长类哺乳动物或人。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有自身免疫性疾病，或者，具有患有上述疾病的风险。
95.术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者
自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
96.术语“自身免疫性疾病”是指由于某些原因造成免疫系统对自身成分的免疫耐受减低或破坏，致使自身抗体或/和致敏淋巴细胞损伤自身器官组织而引起的疾病，表现为相应组织器官的功能障碍。自身免疫性疾病可以选自以下：变态反应，强直性脊柱炎，哮喘，银屑病，干燥综合征，动脉粥样硬化，自身免疫性肝炎，自身免疫性腮腺炎，结肠炎，igg4相关性疾病，白塞病，免疫性血管炎，免疫性心肌炎，移植物相关疾病，克罗恩病，糖尿病(包括1型和/或2型糖尿病)，肾小球肾炎，格雷夫斯病，格林巴利综合征，桥本氏病，溶血性贫血，特发性血小板减少性紫癜(又称原发免疫性血小板减少症)，炎性肠病，系统性红斑狼疮，多发性硬化，重症肌无力，天疱疮(例如寻常型天疱疮和落叶状天疱疮)，风湿性发热，类风湿性关节炎，结节病，硬皮病(系统性硬化症)，脊椎关节病，甲状腺炎，移植排斥。自身免疫介导的病症包括但不限于这样的状况，其中受影响的组织是初级靶标，并且在一些情况下是次级靶标。这样的病症包括但不限于aids，特应性变态反应，支气管哮喘，湿疹，组织和器官移植(如实体器官移植)，慢性疲劳综合征，阿尔茨海默病，帕金森病，心肌梗死，中风，癫痫，过敏反应。在一个具体的实施方案中，自身免疫性疾病模型是小鼠的实验性变态反应性脑脊髓炎，对应于人的多发性硬化症。
97.本发明中，除非另行规定，结合本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。
98.与重组dna、寡核苷酸合成、组织培养和转化(例如电穿孔、脂质体转染)、酶促反应和纯化技术结合使用的示例性技术是本领域已知的。许多这样的技术和程序描述于，例如，sambrook等人，molecμlar cloning：a laboratory manual(第2版，cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，n.y.(1989))，以及其他许多地方。另外，用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送、以及患者治疗的示例性技术也是本领域已知的。
99.在本技术中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。在多个从属权利要求的情况下，仅仅在替代方案中使用“或”引用一个以上的前述独立或从属权利要求。
100.如本文所述，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应被理解为包括所述范围内的任何整数的值，并且在适当时包括其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)，除非另外指明。
101.单位、前缀和符号均以它们的国际单位制(si)公认的形式表示。数值范围包括定义该范围的数字。在本文中提供的小标题不是本公开的不同方面的限制，可以通过整体上参考本说明书来获得这些方面。
102.缩略词
103.cdr：免疫球蛋白可变区中的互补决定区。
104.vh：抗体重链可变区。
105.vl：抗体轻链可变区。
106.hc：抗体重链。
107.lc：抗体轻链。
108.igg：免疫球蛋白g。
109.abm：abm cdr定义方式来源于martin的相关研究(martin acr,cheetham jc,rees ar(1989)modelling antibody hypervariable loops:a combined algorithm.proc natl acad sci usa 86:9268-9272)，此定义方法整合了kabat及chothia两者的部分定义。
110.kabat：由elvin a.kabat提出的免疫球蛋白比对及编号系统(参见，例如kabat et al.,sequences of proteins of immunological interest,5th ed.public health service,national institutes of health,bethesda,md.,1991)。
111.chothia：由chothia等人提出的免疫球蛋白编号系统，其是基于结构环区的位置鉴定cdr区边界的经典规则(参见，例如chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917；chothia等人(1989)nature 342:878-883)。
112.imgt：基于由lefranc等人发起的国际免疫遗传学信息系统(the international immunogenetics information system(imgt))的编号系统，可参阅lefranc et al.,dev.comparat.immunol.27:55-77,2003。
113.mab：单克隆抗体。
114.ec50：产生50％功效或结合的浓度。
115.ic50：产生50％抑制的浓度。
116.elisa：酶联免疫吸附测定。
117.pcr：聚合酶链式反应。
118.hrp：辣根过氧化物酶。
119.hfc：人igg抗体fc段。
120.kd：解离平衡常数。
121.hcdr1：免疫球蛋白重链可变区中的互补决定区1。
122.hcdr2：免疫球蛋白重链可变区中的互补决定区2。
123.hcdr3：免疫球蛋白重链可变区中的互补决定区3。
124.lcdr1：免疫球蛋白轻链可变区中的互补决定区1。
125.lcdr2：免疫球蛋白轻链可变区中的互补决定区2。
126.lcdr3：免疫球蛋白轻链可变区中的互补决定区3。
127.实施例1.融合蛋白的表达与纯化
128.在某些实施方式中，本发明提供的抗原结合蛋白包括如下重链hc和轻链lc：
129.(1)融合蛋白1，如seq id no:21所示的hc，和/或如seq id no:9所示的lc；或，
130.(2)融合蛋白2，如seq id no:31所示的hc，和/或如seq id no:9所示的lc；或，
131.(3)融合蛋白3，如seq id no:23所示的hc，和/或如seq id no:9所示的lc；
132.(4)融合蛋白4，如seq id no:32所示的hc，和/或如seq id no:9所示的lc。
133.将融合蛋白的轻链序列分别和重链片段序列按照人宿主细胞表达系统进行氨基酸密码子优化后添加用于蛋白表达的信号肽核苷酸序列并进行基因合成，之后将合成的目的基因通过5'ecori和3'hindiii克隆至载体ptt5(氨苄抗性)，构建完成的后将轻链载体和重链载体分别进行组合表达。挑选克隆进行测序，选择测序正确的菌体进行保种并进行菌体的扩大培养，扩大的菌体用于质粒的提取。
134.按照如下的方式对提取后的质粒进行细胞转染和蛋白的分离纯化：
135.1、测定细胞密度，活力应当大于95％，用(预热的)hek293培养基将hek293细胞(购
自atcc，货号crl-1573.3)密度调节成3
×
106细胞/ml，轻轻摇匀并分装细胞(转染量为转染体系的90％)，注意摇瓶中细胞体积不超过摇瓶规格的1/3，放入摇床待用。
136.2、根据转染细胞体积计算转染缓冲液opti-mem的体积，该体积为转染体系的1/10；计算转染试剂pei的量，其比例为3μl/ml转染细胞；计算转染dna的总量，其比例为1μg/ml转染细胞。
137.具体转染的操作过程如下：
138.取1支50ml离心管，加入转染体系10％的mem，加入质粒，混匀后过滤，静置5min，向dna混悬液中加入pei，轻柔混匀(轻轻颠倒混匀2-3次)后静置15-20min。随后将复合物轻柔加入分装好的细胞中，边加入边轻轻晃动摇瓶；转染完成的细胞放入37℃摇床进行培养。用常规的亲和纯化方法分离纯化hek293细胞瞬转表达的上清中的融合蛋白，简要的步骤为用5-10倍体积的结合缓冲液平衡填料柱、上清样品上样、结合缓冲液洗脱杂蛋白、蛋白洗脱。经过纯化后，表征结果显示融合蛋白1具有97.8％的单体纯度，融合蛋白2、融合蛋白3、融合蛋白4在蛋白纯化后表现出了更低的纯度，分别为67.4％、77.3％和87.5％，检测结果如图1-4所示。
139.接下来对融合蛋白1进行进一步的评估研究。
140.实施例2.融合蛋白与人cd40l和hsa抗原的结合检测
141.采用gator非标记生物分析仪对实施例1纯化的融合蛋白1与cd40l蛋白(生产厂家：北京百普赛斯生物科技股份有限公司，货号：cdl-h5248)和hsa(生产厂家：北京百普赛斯生物科技股份有限公司，货号：hsa-h5220)的亲和力进行测定。选用抗his标签的生物传感器分别对cd40l和hsa进行捕获(上样浓度10μg/ml)，之后将捕获的样品与融合蛋白进行结合、解离的动力学检测。动力学使用1：1结合模型进行拟合分析。其中简要的作用步骤为：蛋白加载200s，结合180s，解离300s，再生30s。测定的亲和力如下表1所示。
142.表1
[0143][0144][0145]
如上表所示，融合蛋白1以高亲和力与cd40l和hsa进行结合，也说明表达的融合蛋白具有正确的折叠构象，并且结合cd40l和结合hsa的功能域不相互影响。同时，由于可以和hsa正常结合，也保证了融合蛋白1在体内具有良好的半衰期(low s,et al."vhh antibody targeting the chemokine receptor cx3cr1 inhibits progression of atherosclerosis."mabs.2020 jan-dec；12(1):1709322.)。
[0146]
实施例3.融合蛋白阻断cd40与cd40l结合的测定
[0147]
在elisa酶标板中4℃包被cd40蛋白(生产厂家：北京百普赛斯生物科技股份有限公司，货号：cd0-h5228)过夜，封闭完成后，将实施例1获得的融合蛋白1按照50μg/ml的起始浓度进行梯度稀释后与生物素化的cd40l蛋白(生产厂家：北京百普赛斯生物科技股份有限公司，货号：cdl-h82f1)混合。酶标板中每孔加入100μl混合液，37℃进行孵育、6次洗板后加入酶标二抗，37℃进行孵育、6次洗板后进行显色和结果读取。检测结果如图5所示，其ic50值为0.1182μg/ml。
[0148]
结果如图5所示，融合蛋白1可以以较低的浓度对cd40和cd40l形成有效的结合阻断，进一步表明融合蛋白具有阻断cd40和cd40l信号传导的能力。
[0149]
实施例4.融合蛋白活化血小板效应的检测
[0150]
参照实施例1对具有血小板活化功能的阳性对照抗体(参见专利wo2001030386，其中重链序列seq id no:26，轻链序列seq id no:27)和不具有血小板活化功能的阴性对照抗体(参见专利us20180193454，其中，重链序列seq id no:28，轻链序列seq id no:29)以及通过fc段的工程化改造的抗体letolizumab(参见专利cn106132429a，序列seq id no:30)进行基因合成和抗体的表达纯化。通过不同的抗体诱导血小板细胞表面标志物pac-1的情况进行血小板活化程度的评估。
[0151]
具体的，从健康志愿者抽取全血到3.2％柠檬酸钠管中，弃去前2ml。通过在120g下离心15分钟制备富血小板血浆，将血小板计数用磷酸盐缓冲盐水归一化至1
×
105个细胞/ml。通过在室温下预温育15分钟，以3:1的cd40l:抗体摩尔比制备重组人cd40l(生产厂家：北京百普赛斯生物科技股份有限公司，货号：cdl-h5248)与测试阳性对照抗体、阴性对照抗体、抗体letolizumab和融合蛋白1的免疫复合物。将免疫复合物混合物稀释至在归一化的pbs/血小板溶液中的最终浓度5μg/ml cd40l，然后在37℃下温育30分钟。阴性对照是单独的未处理血小板和cd40l。温育30分钟后，将抗人pac-1-fitc(厂家：赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号：ma5-28564)缀合的抗体加入所有样品中并温育15分钟。将样品1:1稀释到2％多聚甲醛:pbs缓冲液中，在冰上固定30分钟，以100g离心5分钟以沉淀细胞。将细胞重新悬浮于pbs中。在流式细胞仪上进行荧光活化细胞检测。
[0152]
检测结果如图6-10所示，阳性对照抗体对血小板有明显的激活效应(被活化的红细胞为21.9％)，本发明的融合蛋白1和阴性对照抗体及阴性对照对血小板均没有明显的激活，但是经过fc改造的letolizumab抗体仍然显示出了活化血小板的能力(被活化的红细胞为10.6％，表示仍然可导致血栓栓塞)。该实施例结果说明，本发明的融合蛋白1是一种更加安全的分子形式，可以在不引起血小板激活、凝集的情况下使用，可以避免受试者出现血栓栓塞的风险，这对后期药物分子的开发提供了安全性保证。
[0153]
实施例5.融合蛋白1治疗小鼠实验性变态反应性脑脊髓炎的药效测试
[0154]
将18只小鼠皮下注射mog35-55/cfa乳化剂(mog35-55购自tocris bioscience，货号2568；cfa购自merck kgaa，货号f5881，给药乳化剂当天记为day0)，并在day0和day2尾静脉注射ptx(购自apexbio technology，货号b7273)，构建小鼠实验性变态反应性脑脊髓炎模型(experimental autoimmune encephalomyelitis，eae)。
[0155]
采用随机区组法将小鼠分为2组，分组信息如下表2所示，分别在day1、day4、day8、day11、day14、day18、day21和day24尾静脉注射pbs和融合蛋白30mpk，之后按照实验计划称重并通过观察小鼠是否会出现相应的临床症状(如尾巴无力、翻正反射受损、后肢瘫痪)进行评分。在group1,pbs,i.v.,q3d*8times和group2,融合蛋白30mpk,i.v.,q3d*8times组选取部分小鼠，安乐死小鼠并取小鼠脊髓，组织固定染色后进行组织病理学检查。
[0156]
表2.实验分组信息
[0157]
组别剂量(mg/kg)数量给药方式group1,pbs,i.v.,q3d*8times/9尾静脉注射group2,融合蛋白30mpk,i.v.,q3d*8times309尾静脉注射
[0158]
临床评分系统：
[0159]
0分：小鼠健康；
[0160]
1分：小鼠尾巴无力；
[0161]
2分：小鼠翻正反射受损；
[0162]
3分：小鼠一只后肢瘫痪；
[0163]
4分：小鼠两只后肢瘫痪；
[0164]
5分：小鼠体重减轻20％及以上；
[0165]
6分：小鼠死亡或濒临死亡。
[0166]
实验结果如图11-12显示，接受融合蛋白1治疗组小鼠eae模型评分在模型发病过程中与对照组相比出现显著的统计学差异，并且有5只小鼠出现评分为0(临床治愈)，这显示了融合蛋白优秀的药效。同时，小鼠体重也随实验研究的进行出现增长的统计学差异，说明融合蛋白1不仅没有毒性而且可以保持小鼠更加健康的生长。
[0167]
对小鼠脊髓进行lfb(luxol fast blue)染色结果显示(图13-14)，发病严重的小鼠脊髓边缘出现严重的脱髓鞘现象，而接受融合蛋白治疗组小鼠脊髓相对完整，未见明显脱髓鞘损伤。这说明融合蛋白可以对小鼠脊髓组织和神经系统的损伤进行有效的治疗。
[0168]
实施例6.cho稳转细胞系的筛选
[0169]
为了获得适于工艺开发用的细胞株，将本发明的融合蛋白1进行稳转细胞系的构建，简要的，将融合蛋白1氨基酸按照真核表达宿主进行密码子优化后合成并构建至真核表达载体中，通过电转染的方式将表达载体转染至cho细胞(供应商：欧洲认证细胞培养物收藏中心，货号：85051005)，待细胞活率恢复至90％或以上时进行亚克隆稀释铺板，按照0.5个细胞/孔的密度进行96孔细胞培养和筛选。选择表达量较高的克隆进行补料流加培养，在流加培养的第14天或者细胞活率小于80％时收获培养上清进行表达量的检测，其融合蛋白1的表达量为10.30g/l，选取该细胞株进行大规模培养。其他融合蛋白采用同样的方法构建得到的细胞株表达量均较低。
[0170]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。