用于检测碳青霉烯酶酶型的检测试剂和方法与流程

1.本发明涉及碳青霉烯酶酶型的检测技术领域，具体而言，涉及用于检测碳青霉烯酶酶型的检测试剂和方法。


背景技术：

2.近年来的流行病学提示，随着广谱抗生素及碳青酶烯类抗生素在疾病感染中的广泛使用，耐碳青酶烯肠杆菌(carbapenem-resistant enterobacteriaceae,cre)感染发生率逐年上升，多项研究提示，若发生cre感染，传统抗生素治疗效果差，患者死亡率高。碳青霉烯酶是指能够水解碳青霉烯类抗生素的一大类β-内酰胺酶，可分为a类、b类和d类酶。a类、d类为丝氨酸酶，b类为金属酶。而a类的kpc丝氨酸酶是近年来肠杆菌科细菌最主要的耐药机制，能被新型酶抑制剂阿维巴坦、雷利巴坦所抑制，临床多用头孢他啶-阿维巴坦治疗产kpc酶的细菌感染。另外，b类的ndm金属酶对氨曲南的水解活性弱，不被β-内酰胺酶抑制剂所抑制，因此，氨曲南与头孢他啶-阿维巴坦联合用药是治疗产ndm酶细菌感染的有效方法。所以，临床可以依据碳青霉烯酶的分型选择有效的治疗方案，提高cre治疗水平。
3.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供用于检测碳青霉烯酶酶型的检测试剂和方法。该检测试剂不仅能实现碳青霉烯酶的分型，同时操作简单，结果易读，成本低，非常适合临床用于碳青霉烯酶表型检测。
5.本发明是这样实现的：
6.第一方面，本发明提供一种用于检测碳青霉烯酶酶型的检测试剂，其原料包括乙二胺四乙酸类化合物和三氨基苯硼酸，且含有所述乙二胺四乙酸类化合物的溶液的浓度为0.8-1.2mol/l，含有所述三氨基苯硼酸的浓度为40-60mg/ml。
7.在可选的实施方式中，所述乙二胺四乙酸类化合物包括乙二胺四乙酸和乙二胺四乙酸盐；
8.优选地，所述乙二胺四乙酸盐为乙二胺四乙酸钠盐。
9.在可选的实施方式中，所述检测试剂包括含有乙二胺四乙酸类化合物的第一溶液和含有三氨基苯硼酸的第二溶液，所述第一溶液中乙二胺四乙酸类化合物的浓度为0.8-1.2mol/l，所述第二溶液中三氨基苯硼酸的浓度为40-60mg/ml。
10.在可选的实施方式中，所述第一溶液和所述第二溶液的体积比为1：1-3：2。
11.在可选的实施方式中，所述第一溶液是将所述乙二胺四乙酸类化合物溶解后形成的溶液；
12.所述第二溶液是将所述三氨基苯硼酸和二甲基亚砜与水的混合溶剂混合后形成的溶液。
13.在可选的实施方式中，所述第一溶液和所述第二溶液均于2-8℃条件下进行保存。
14.在可选的实施方式中，在使用所述检测试剂时，再将所述第一溶液和所述第二溶液混合。
15.在可选的实施方式中，所述第一溶液中乙二胺四乙酸的浓度为0.5mol/l，所述第二溶液中三氨基苯硼酸的浓度为50mg/ml，所述第一溶液和所述第二溶液的体积比为1：1。
16.第二方面，本发明提供一种检测碳青霉烯酶酶型的方法，包括：利用前述实施方式任一项所述的用于检测碳青霉烯酶酶型的检测试剂进行检测。
17.本发明具有以下有益效果：本发明实施例通过采用乙二胺四乙酸类化合物和三氨基苯硼酸配合，并限定二者的配比，不仅能实现碳青霉烯酶的分型，同时操作简单，结果易读，成本低，非常适合临床用于碳青霉烯酶表型检测。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
19.图1为本发明实施例2提供的检测碳青霉烯酶酶型的方法中纸片具体贴的位置图；
20.图2为本发明实施例2提供的产丝氨酸酶的理论纸片结果图；
21.图3为本发明实施例2提供的产金属酶的理论纸片结果图；
22.图4为本发明实施例2提供的同产丝氨酸酶和金属酶的理论纸片结果图；
23.图5为本发明实施例2提供的实验结果图。
具体实施方式
24.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
25.本发明实施例提供用于检测碳青霉烯酶酶型的检测试剂，其原料包括乙二胺四乙酸类化合物和三氨基苯硼酸，且含有所述乙二胺四乙酸类化合物的溶液的浓度为0.8-1.2mol/l，含有所述三氨基苯硼酸的浓度为40-60mg/ml。
26.采用乙二胺四乙酸类化合物和三氨基苯硼酸配合，并限定二者的配比，不仅能实现碳青霉烯酶的分型，同时操作简单，结果易读，成本低，非常适合临床用于碳青霉烯酶表型检测。
27.其中，乙二胺四乙酸类化合物包括乙二胺四乙酸和乙二胺四乙酸盐，优选地，所述乙二胺四乙酸盐为乙二胺四乙酸钠盐。
28.进一步地，检测试剂包括含有乙二胺四乙酸类化合物的第一溶液和含有三氨基苯硼酸的第二溶液，其中，所述第一溶液中乙二胺四乙酸类化合物的浓度为0.8-1.2mol/l，例如为0.8mol/l、0.85mol/l、0.9mol/l、1.0mol/l、1.05mol/l、1.1mol/l、1.15mol/l以及1.2mol/l等0.8-1.2mol/l之间的任意数值；所述第二溶液中三氨基苯硼酸的浓度为40-60mg/ml，例如为40mg/ml、45mg/ml、47mg/ml、50mg/ml、52mg/ml、55mg/ml、58mg/ml以及
60mg/ml等40-60mg/ml之间的任意数值。第一溶液和所述第二溶液的体积比为1：1-3：2。例如为1：1、1.2：1、1.5：1等1：1-3：2之间的任意数值。
29.进一步地，所述第一溶液是将所述乙二胺四乙酸类化合物溶解后形成的溶液；或者可以是将高浓度的乙二胺四乙酸类化合物溶液进行稀释得到所需浓度的第一溶液。第二溶液是将所述三氨基苯硼酸和二甲基亚砜与水的混合溶剂混合后形成的溶液。
30.且第一溶液和所述第二溶液均于2-8℃条件下进行保存，继而能够减少第一溶液和第二溶液内成分变质，有利于提升检测结果。
31.进一步地，在未需要使用该检测试剂时，第一溶液和所述第二溶液分开存放，在使用所述检测试剂时，再将所述第一溶液和所述第二溶液混合。
32.第二方面，本发明提供一种检测碳青霉烯酶酶型的方法，包括：利用前述实施方式任一项所述的用于检测碳青霉烯酶酶型的检测试剂进行检测。
33.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
34.实施例1
35.本发明实施例提供一种用于检测碳青霉烯酶酶型的检测试剂，其配置方法如下：
36.配置第一溶液，0.1mol/l edta，利用0.5mol/l edta溶液配置成0.1mol/l：具体地，取0.5mol/l edta200ul再加800ul灭菌水，即得到了0.5m的edta一毫升。
37.配置第二溶液：50mg/ml 3-氨基苯硼酸：将25mg的三氨基苯硼酸、250ml的蒸馏水和250ml的二甲基亚砜混合，得到500ml的50mg/ml 3-氨基苯硼酸。得到的第一液和第二液就是检测碳青霉烯酶酶型所用的稀释液。分装，即得。
38.实施例2
39.本实施例提供检测碳青霉烯酶酶型的方法，包括：利用实施例1的检测试剂进行检测，具体地：
40.(1)：将待测cre菌株调0.5麦氏浓度，用无菌棉拭子蘸取调好的菌液，在试管壁挤去多余的液体，涂布在m-h平板上表面，每次旋转平板60度，共涂三次，沿着周边擦绕两圈，使整个平板涂布均匀。
41.(2)：平板放置3-5分钟，用无菌镊子取药敏纸片，在已涂有待测cre菌株的mh平板上分别贴4片亚胺培南纸片，纸片均匀分布，纸片间距不少于24mm左右，纸片中心距平板边缘不少于15mm。
42.(3)：第1片imp上不任何处理，第2片imp上滴加10ul第一溶液，第3片imp上滴加10ul第二溶液，第4片imp上第一溶液和溶液加各10ul。(滴加顺序可以根据实验室操作方便进行调整，确保四片纸片中，一片不加任何检测液作为空白对照和验证是否为cre；一片滴加第一溶液；一片滴加第二溶液；一片滴加第一溶液和第二溶液。)纸片具体贴的位置参见图1。
43.(4):平板反转放置36
±
1℃，普通恒温培养箱放置18-24小时，用游标卡尺测量抑菌圈直径，然后根据结果判读规则判断结果。
44.以上操作步骤均为微生物实验室常规操作步骤，无需额外培训。
45.(5)结果判读
46.结果判读规则
47.1.不添加任何试剂的纸片抑菌圈直径≤19mm表示待测菌株为cre；
48.2.第一溶液(edta稀释液)抑菌圈直径-不添加任何试剂的纸片抑菌圈直径≥5mm，产丝氨酸酶；理论纸片结果参见图2；
49.3.第二溶液(三氨基苯硼酸分析纯稀释液抑菌圈直径-不添加任何试剂的纸片抑菌圈直径≥5mm，产金属酶；理论纸片结果参见图3；
50.4.第一溶液(edta稀释液)、第二溶液(三氨基苯硼酸分析纯稀释液与不添加任何试剂的纸片相比抑菌环均为≤5mm，第一溶液(edta稀释液)加第二溶液(三氨基苯硼酸分析纯稀释液)抑菌圈直径-不添加任何试剂的纸片抑菌圈直径≥5mm同产丝氨酸酶和金属酶，理论纸片结果参见图4。
51.5.均不满足上诉判读规则，复检后仍不满足，则可能是产其他酶型，需要其他检测方法。
52.该碳青霉烯酶检测试剂一共可以判读出四种结果：
53.1.产丝氨酸酶
54.2.产金属酶
55.3.同产丝氨酸酶和金属酶
56.4.其他酶型或者非产酶
57.检测结果参见图5，2个培养皿为重复性实验，1-4四个纸片上，1号未加任何试剂；4e号滴加第一溶液；2p号滴加第二溶液；3e+p号滴加第一溶液和第二溶液。36℃普通恒温培养箱连续培养18小时，结果如图所示：
58.1号纸片结果为7mm，抑菌圈直径小于19mm，表示待测菌株为cre；
59.2p号-1号抑菌圈直径为12mm≥5mm，为金属酶。
60.所以该待测菌株的酶型为金属酶。
61.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。