一种桑树青枯病菌噬菌体及其应用

1.本发明属于生物防治领域，具体地涉及一种桑树青枯病菌噬菌体及其应用。


背景技术：

2.桑树是一种落叶乔木，属蔷薇目(urticales)、桑科(moraceae)、桑属(morus)、桑种(morus alba)，广泛分布在世界各地。在我国，桑树的自然分布和人工栽培更是遍及全国各地，我国也是世界上桑树品种资源最丰富的国家。在桑树栽培过程中，极易受到青枯病的危害，危害严重。
3.造成植物青枯病的是一种土传的植物病原细菌，主要分布在热带、亚热带及部分暖温带地区，感染植物涉及范围广泛。通过伤口、根尖或者次生根萌发处侵入植物，定殖在根部皮层迅速繁殖，并进入维管束继续向其它组织蔓延。同时分泌果胶酶、纤维素酶等分解植物的中胶层，导致植物枯萎直至死亡。青枯病是危害最大、分布最广、造成损失最严重的植物细菌病害之一，该病害堪称“植物癌症”，一旦发病就难以控制，造成的经济损失难以估量。
4.对于青枯病的防治国内外已有大量的探索，提出了多种防治措施，包括化学防治、物理防治、改进农业栽培方式以及生物防治等等。如使用化学熏蒸剂和抗生素处理土壤，种植抗病品种、作物轮作和套种，利用无致病力青枯病菌菌株、芽胞杆菌、链霉菌等生防菌等等 (yuliar et al.,2015)。虽然这些防治措施有一定效果，但是并不稳定，而且化学农药的残留对土壤和水污染严重，危害人畜健康，细菌也极易对抗生素产生耐药性，生防菌不能在土壤中稳定定殖，并且其生产、储藏和使用都有一定难度。因此，开发新型防治技术势在必行。
5.近年来，利用噬菌体疗法防控细菌性病害引起了研究者的广泛关注。噬菌体是一类能够侵染细菌的病毒，做为细菌的“捕食者”，可直接被用于防控病原菌。yen等人证实噬菌体鸡尾酒疗法可抑制霍乱弧菌在小鼠和兔子体内的定殖，有效缓解该菌引起的腹泻症状(yen etal.,2017)。近年来，利用噬菌体防治植物病原细菌的报道也越来越多，田间试验结果显示噬菌体对丁香假单胞菌、链霉菌、苛养木杆菌、解淀粉欧文氏菌和黑胫病菌等植物病原菌都有很好的防治效果 (buttimer et al.,2017)。也发现青枯病菌噬菌体фrsl1和pe204等可显著降低番茄青枯病的发病率(bae et al.,2012；fujiwara et al., 2011)，表明噬菌体疗法在防治青枯病方面具有巨大潜力。
6.噬菌体疗法具有其独特的优势，专一性强，对同一种细菌的不同菌株也表现出不同的感染效果，这一特性使噬菌体不会影响周边其他微生物，对微生态环境无不利影响。但是在噬菌体的应用过程中，细菌也会逐渐产生抗性，目前研究发现使用不同类型、不同宿主谱的噬菌体，制成混合噬菌体制剂(噬菌体鸡尾酒)可减少噬菌体抗性的出现，拓宽噬菌体制剂的应用范围。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种麦根腐平脐蠕孢的lamp检测引物组，可快速检测麦根腐平脐蠕孢，灵敏度高，特异性强。
8.为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
9.本发明的一个目的在于提供一种桑树青枯病菌噬菌体，所述噬菌体为caudovirales phage muly4，保藏编号为cctcc m 20211330。
10.本发明中，所述噬菌体muly4基因组的全长为52699bp，g+c 含量为49.4％，其末端为166bp的正向重复序列。
11.本发明所述噬菌体属于caudovirales目噬菌体。
12.本发明的另外一个目的为提供一种药物制剂，包括上述的噬菌体，以及农药学上可接受的载体。
13.作为优选的，本发明的药物制剂还包括一种或多种与上述噬菌体不同的桑树青枯病菌噬菌体。
14.优选的，所述噬菌体为青枯病菌裂解液的粗提物或纯化物。
15.更优选的，所述裂解液粗提物或纯化物经冷冻干燥、或溶于适当溶媒中。
16.优选的，本发明所述药物制剂的ph为5～9。
17.优选的，本发明所述药物制剂的保存温度在28℃以下。
18.本发明还提供了上述噬菌体，以及上述药物制剂在拮抗青枯病病原菌中的应用。
19.本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
20.本发明的噬菌体muly4可侵染青枯病菌形成清亮的噬菌斑，对青枯病菌具有较强的侵染活性。噬菌体muly4的对青枯病菌有强的裂解活性，裂解量达到189pfu/细胞。本发明的噬菌体muly4易保存，在 28℃以下的中性环境中均能稳定存在。噬菌体muly4基因组中没有毒力相关基因，安全性好。
21.保藏说明
22.噬菌体caudovirales phage muly4于2021年10月27日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 20211330；地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学。
附图说明
23.图1为噬菌体muly4侵染桑青枯病菌形成的噬菌斑。
24.图2为噬菌体muly4的一步生长曲线；
25.图3为噬菌体muly4在不同ph条件下的稳定性；
26.图4为噬菌体muly4在不同温度条件下的稳定性；
27.图5为噬菌体muly4对青枯病菌en5-3的抑制效果。
具体实施方式
28.本发明以桑树青枯病菌en5-3为指示菌，利用噬菌斑纯化法进行噬菌体的分离，最终分离纯化到muly4。噬菌体muly4可侵染en5-3 形成清亮的噬菌斑(图1)，说明其具有较强的侵染活性。
29.目前，该噬菌体已经在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号： cctcc m 20211330；地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学；保藏日期：2021年10月27日，分类命名为caudovirales phagemuly4。
30.本发明的噬菌体muly4对宿主细菌具有很强的裂解活性，在 28℃以下的中性环境中均能稳定存在。
31.噬菌体muly4基因组全长52699bp，g+c含量为49.4％，其末端为166bp的正向重复序列，属于caudovirales目噬菌体。噬菌体 muly4基因组中没有毒力相关基因，应用安全性好。
32.根据本发明的又一个方面，提供一种包含如上述的噬菌体及其农药上可接受载体的药物制剂。
33.本发明的药物制剂可以根据本领域技术人员熟知的方法生产和/ 或是可商业获得。药物制剂可以为溶液剂、分散剂、悬浮剂、颗粒剂等形式。使用方式可以为喷施、撒施、沟施或随水灌溉施用。
34.在一个实施方案中，本发明的药物制剂还包括与本发明上述噬菌体不同的桑树青枯病菌噬菌体，不同噬菌体之间的复配使用，扩大噬菌体的宿主谱，提高对青枯病菌的防治效果，延缓青枯病菌抗药性的产生。
35.在一个实施方案中，本发明药物制剂中所用噬菌体为青枯病菌裂解液的粗提物或纯化物，提取或纯化方法可采用本领域中的常规方法，本发明对此不做限定。在一个实施方案中，所述裂解液粗提物或纯化物经冷冻干燥、或溶于适当溶媒中。冷冻干燥采用本领域中的常规方法。所述溶媒可选的为水、nb培养基等。
36.在一个实施方案中，本发明药物制剂的ph为5～9，在此ph范围内，噬菌体muly4能够稳定存在，并保持裂解活性。
37.在一个实施方案中，本发明药物制剂的保存温度在28℃以下，噬菌体效价相对稳定。
38.本发明的噬菌体muly4能够抑制青枯病病原菌的种群增长，因此噬菌体muly4以及含有该噬菌体制备得到的药物制剂均能够用于拮抗青枯病病原菌。
39.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
40.实施例1
41.噬菌体的分离制备
42.青枯病菌en5-3分离自青枯病发病桑树植株的根部，通过盆栽灌根实验证实en5-3对桑树具有致病性。
43.以en5-3为指示菌株，从桑园采集土壤，进行噬菌体的分离。
44.称取3g新鲜土壤，加入到10ml对数期的en5-3菌液中，28℃、 220rpm条件下摇床培养6h；12000rpm，离心10min，取上清，用 0.22μm的无菌滤膜进行过滤；取3μl滤液点在双层平板上(上层半固体培养基与en5-3菌液的混合物)，将双层平板置于28℃的恒温培养箱中，培养至少12h，待平皿上出现噬菌斑。
45.取可形成噬菌斑的滤液，通过梯度稀释法获得单个噬菌斑，并挑取单斑到新鲜的
en5-3菌液中培养6h，用上述方法离心过滤，获得噬菌体悬液，重复这一步骤一次，即可得到噬菌体的纯培养，标记为 muly4。
46.实施例2
47.噬菌体muly4的宿主谱鉴定
48.选取12株青枯病菌(见表1)为指示菌，采用双层平板点斑法进行噬菌体muly4宿主谱的鉴定。
49.取1ml培养好的青枯病菌菌液与5ml半固体nb培养基混合，倒入已经铺有固体nb培养基的平皿中，待上层冷却后，取3μl制备好的噬菌体muly4悬液点在平皿中央，将平皿置于28℃恒温培养箱中培养12-24h，若点有噬菌体悬液的位置形成噬菌斑，说明噬菌体可侵染该菌株。结果见表1。
50.表明，噬菌体muly4菌株对4株青枯病菌具有侵染活性，占到受试菌株的33.3％。
51.表1噬菌体muly4的宿主谱
[0052][0053][0054]
实施例3
[0055]
噬菌体muly4的一步生长曲线测定
[0056]
参考hyman等报道的方法(hyman，2009)测定噬菌体muly4 的一步生长曲线。
[0057]
取0.13ml噬菌体muly4悬液(大约1.12
×
10
11
pfu)加入到100 ml处于对数生长期的en5-3菌液中(大约1.47
×
109cfu)，使侵染复数(moi)为0.1。将噬菌体和菌液的混合液静置30min，使噬菌体充分吸附到细胞上。之后13000g离心1min，取出上清(其中含有未吸附的噬
菌体，计算其效价；这样被侵染的细菌细胞数量为初始加入噬菌体的总量减去该上清中剩余噬菌体的总量)，用100ml新鲜的nb培养基悬浮吸附噬菌体的细菌细胞，28℃、220rpm摇床培养。之后每隔半小时取2ml菌液，13000g离心1min，用双层平板法检测上清中噬菌体的效价，至噬菌体效价稳定。根据每个时间点噬菌体的效价绘制一步生长曲线。
[0058]
一步生长曲线显示噬菌体muly4侵染细菌后，潜伏期30min，之后进入指数增长期，在侵染后5h达到裂解稳定期，终浓度达10
11 pfu/ml，噬菌体裂解量为189pfu/细胞(图2)，说明muly4对宿主细菌具有很强的裂解活性。
[0059]
实施例4
[0060]
噬菌体muly4的ph稳定性测定
[0061]
取100μl实施例2制备的噬菌体muly4悬液加入到900μl 的ph3、ph5、ph7、ph9的液体nb培养基中，混匀，室温下放置2 h，之后分别测定每种ph条件下的效价。
[0062]
结果显示噬菌体muly4在ph5、ph7、ph9条件下能够稳定存在，但在ph3条件下，已检测不出噬菌体的存在(图3)。所以，在中性环境条件下，噬菌体muly4能够稳定存在。
[0063]
实施例5
[0064]
噬菌体muly4的温度稳定性测定
[0065]
取实施例2制备获得的新鲜噬菌体muly4悬液，测定其初始效价，之后将噬菌体muly4悬液分为4管，分别置于4℃、28℃、37℃、 50℃恒温培养箱中孵育，在1d、2d、4d、30d时，取孵育的噬菌体悬液进行效价测定。
[0066]
结果显示在4℃、28℃、37℃条件下保存2天，噬菌体muly4 的效价无显著变化，第4天时下降一个数量级，在第30天时4℃、 28℃条件下保藏的噬菌体效价与第4天时无显著变化，但是37℃条件比第4天时下降2个数量级。50℃条件下，噬菌体的效价在第1天就下降了2个数量级，第30天时噬菌体已无任何活性(图4)。所以，当保存温度在28℃以下时，噬菌体相对稳定。
[0067]
实施例6
[0068]
噬菌体muly4对病原菌的抑制效果检测
[0069]
取适量的muly4悬液与100ml对数生长期(od600约0.3-0.5) 的en5-3菌液混合(moi约为1)，置于28℃、220rpm摇床培养，之后每隔半小时检测一次菌液od600，直到菌液od值保持稳定。
[0070]
结果显示在加入噬菌体后，病原宿主菌开始缓慢生长，6小时之后，菌液od值始终维持在较低的水平，而未加入噬菌体的对照组菌液od值持续增长(图5)。这说明噬菌体muly4抑制了青枯病菌的种群增长，具有极大的应用价值。
[0071]
实施例7
[0072]
噬菌体muly4基因组的提取和全基因组测序及分析
[0073]
为了进一步深入探索噬菌体muly4的特性，了解其相关功能基因以及是否含有一些风险基因，我们进一步分析了muly4的遗传背景。
[0074]
本实施例采用氯化锌(zncl2)沉淀法小量提取噬菌体dna(santos, 1991)。取1ml诱导得到的噬菌体悬液，加入dnasei(1mg/ml)20 μl，rnasea(10mg/ml)5μl，37℃温育30～60min；加入20μl 2 mol/l zncl2，混匀后37℃温育5min；10,000
×
g离心1min，弃上清；加入500μl tes buffer，打散沉淀，65℃温浴15min；加入10μl 蛋白酶k(20mg/ml)，50℃温育1h；
温育后冷却，加入60μl预冷的3mol/l醋酸钾(ph5.2),冰上放置10～15min；13,000
×
g 4℃离心 10min；取上清(约500μl)；加入600μl苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1， v:v:v)于上清中，颠倒数次；13,000
×
g常温下离心5～10min；取上层液体，2/3～1倍体积的异丙醇沉淀dna，-20℃放置不少于30min； 13,000
×
g 4℃离心10min，弃上清，70％乙醇洗涤沉淀一次，室温风干，te溶解dna(20-50μl)。
[0075]
噬菌体全基因组测序采用全基因组鸟枪法(whole genomeshotgun，wgs)策略，构建不同插入片段的文库，利用第二代测序技术(next-generation sequencing，ngs)，基于illumina novaseq 测序平台，对这些文库进行双末端(paired-end，pe)测序，测序读长150bp。对测序数据原始数据进行处理，去除接头污染，过滤掉长度低于50bp的reads，去掉平均质量低于20的reads，去除n数量大于3的reads，获得可用于拼接的reads数据。之后利用软件abyss 进行拼接组装，通过分析高通量测序数据中的高频率序列确定噬菌体的末端序列，最终获得完整的噬菌体基因组序列，利用rast (https://rast.nmpdr.org/)进行了全基因组的注释。
[0076]
测序结果显示，muly4基因组全长52699bp，g+c含量为49.4％，其末端为166bp的正向重复序列，属于caudovirales目噬菌体。将 muly4的全基因组与ncbi的nr数据库进行比对，发现其仅与已报道的噬菌体escherichiaphage phb10具有58.49％的核苷酸序列一致性，这说明muly4是一株新型的噬菌体。
[0077]
基因组预测分析显示muly4包含67个编码序列(cdss)，其中32个具有可能的功能，其余的为未知功能蛋白。这些功能蛋白基因成簇排列组成功能模块，包括dna复制与代谢、噬菌体结构蛋白相关模块、dna包装相关基因模块、裂解细胞模块、溶源控制模块，另外muly4还编码一些与宿主功能相关的蛋白。
[0078]
全基因组注释分析显示muly4基因组中没有毒力相关基因，这为该噬菌体的应用提供了安全性基础。
[0079]
上述实施例为本发明最佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。