一种针对表位点为FLYALALLL的TCR所设计的引物及其应用的制作方法

no.18所示；所述l2-13位点的引物对的序列如seq id no.19和seq id no.20所示；所述l2-16位点的引物对的序列如seq id no.21和seq id no.22所示；所述l2-19位点的引物对的序列如seq id no.23和seq id no.24所示；所述l2-23位点的引物对的序列如seq id no.25和seq id no.26所示；所述l2-24位点的引物对的序列如seq id no.27和seq id no.28所示；所述l2-25位点的引物对的序列如seq id no.29和seq id no.30所示。作为优选，所述l2-1位点的引物对的序列如seq id no.32和seq id no.33所示；所述l2-2位点的引物对的序列如seq id no.34和seq id no.35所示；所述l2-3位点的引物对的序列如seq id no.36和seq id no.37所示；所述l2-5位点的引物对的序列如seq id no.38和seq id no.39所示；所述l2-6位点的引物对的序列如seq id no.40和seq id no.41所示；所述l2-9位点的引物对的序列如seq id no.42和seq id no.43所示；所述l2-10位点的引物对的序列如seq id no.44和seq id no.45所示；所述l2-11位点的引物对的序列如seq id no.46和seq id no.47所示；所述l2-12位点的引物对的序列如seq id no.48和seq id no.49所示；所述l2-13位点的引物对的序列如seq id no.50和seq id no.51所示；所述l2-16位点的引物对的序列如seq id no.52和seq id no.53所示；所述l2-19位点的引物对的序列如seq id no.54和seq id no.55所示；所述l2-23位点的引物对的序列如seq id no.56和seq id no.57所示；所述l2-24位点的引物对的序列如seq id no.58和seq id no.59所示；所述l2-25位点的引物对的序列如seq id no.60和seq id no.61所示。
9.本发明还提供了所述的引物对在质粒克隆中的应用。
10.本发明提供了一种针对表位点为flyalalll的tcr所设计的引物及其应用，所述引物对包括l2-1位点的引物对、l2-2位点的引物对、l2-3位点的引物对、l2-5位点的引物对、l2-6位点的引物对、l2-9位点的引物对、l2-10位点的引物对、l2-11位点的引物对、l2-12位点的引物对、l2-13位点的引物对、l2-16位点的引物对、l2-19位点的引物对、l2-23位点的引物对、l2-24位点的引物对和l2-25位点的引物对中的一种或多种。本发明的引物对针对分型为hla a02、表位点为flyalalll的患者体内ebv病毒抗原肽段的tcr所设计，能够实现特定质粒的克隆。
附图说明
11.图1为tcrpcr扩增后胶回收电泳结果；
12.图2为骨架载体质粒图谱；
13.图3为tcr与载体重组质粒酶切电泳结果；
14.图4为tcr与载体重组质粒测序峰图；
15.图5为tcr转染jurkat细胞，流式检测转染效率；
16.图6为tcr转染jurkat细胞，流式检测转染效率；
17.图7为tcr转染jurkat细胞，流式检测转染效率；
18.图8为tcr转染jurkat细胞，流式检测转染效率；
19.图9为tcr转染jurkat细胞，流式检测转染效率；
20.图10为tcr转染jurkat细胞，流式检测转染效率；
21.图11为tcr转染jurkat细胞，流式检测转染效率；
22.图12为tcr转染jurkat细胞，流式检测转染效率；
23.图13为tcr转染jurkat细胞，流式检测转染效率；
24.图14为tcr转染jurkat细胞，流式检测转染效率；
25.图15为tcr转染jurkat细胞，流式检测转染效率；
26.图16为tcr转染jurkat细胞，流式检测转染效率；
27.图17为tcr转染jurkat细胞，流式检测转染效率；
28.图18为tcr转染jurkat细胞，流式检测转染效率；
29.图19为tcr转染jurkat细胞，流式检测转染效率；
30.图20为tcr转染jurkat细胞后，功能验证流式检测ifn-γ；
31.图21为tcr转染jurkat细胞后，功能验证流式检测ifn-γ；
32.图22为tcr转染jurkat细胞后，功能验证流式检测cd69；
33.图23为tcr转染jurkat细胞后，功能验证流式检测cd69；
34.图24为tcr转染jurkat细胞后，功能验证流式检测cd69；
35.图25为tcr转染jurkat细胞后，功能验证流式检测cd69；
36.图26为tcr转染jurkat细胞后，功能验证流式检测cd69；
37.图27为tcr转染jurkat细胞后，功能验证流式检测cd69；
38.图28为tcr转染jurkat细胞后，功能验证流式检测cd69；
39.图29为tcr转染jurkat细胞后，功能验证流式检测ifn-γ；
40.图30为tcr转染jurkat细胞后，功能验证流式检测cd69；
41.图31为tcr转染jurkat细胞后，功能验证流式检测cd69；
42.图32为tcr转染jurkat细胞后，功能验证流式检测cd69；
43.图33为tcr转染jurkat细胞后，功能验证流式检测cd69；
44.图34为tcr转染jurkat细胞后，功能验证流式检测cd69；
具体实施方式
45.本发明提供了一种引物对，所述引物对包括l2-1位点的引物对、l2-2位点的引物对、l2-3位点的引物对、l2-5位点的引物对、l2-6位点的引物对、l2-9位点的引物对、l2-10位点的引物对、l2-11位点的引物对、l2-12位点的引物对、l2-13位点的引物对、l2-16位点的引物对、l2-19位点的引物对、l2-23位点的引物对、l2-24位点的引物对和l2-25位点的引物对中的一种或多种。
46.在本发明中，所述l2-1位点的引物对的模板序列如seq id no.62所示。
47.在本发明中，所述l2-2位点的引物对的模板序列如seq id no.63所示。
48.在本发明中，所述l2-3位点的引物对的模板序列如seq id no.64所示。
49.在本发明中，所述l2-5位点的引物对的模板序列如seq id no.65所示。
50.在本发明中，所述l2-6位点的引物对的模板序列如seq id no.66所示。
51.在本发明中，所述l2-9位点的引物对的模板序列如seq id no.67所示。
52.在本发明中，所述l2-10位点的引物对的模板序列如seq id no.68所示。
53.在本发明中，所述l2-11位点的引物对的模板序列如seq id no.69所示。
54.在本发明中，所述l2-12位点的引物对的模板序列如seq id no.70所示。
55.在本发明中，所述l2-13位点的引物对的模板序列如seq id no.71所示。
56.在本发明中，所述l2-16位点的引物对的模板序列如seq id no.72所示。
57.在本发明中，所述l2-19位点的引物对的模板序列如seq id no.73所示。
58.在本发明中，所述l2-23位点的引物对的模板序列如seq id no.74所示。
59.在本发明中，所述l2-24位点的引物对的模板序列如seq id no.75所示。
60.在本发明中，所述l2-25位点的引物对的模板序列如seq id no.76所示。
61.在本发明中，所述质粒优选为mp71。
62.在本发明中，所述质粒骨架为public available information。
63.在本发明中，所述mp71的序列如seq id no.31所示。
64.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明。
65.实施例1
66.引物对设计实例：以seq id no.1和seq id no.2为例。
67.forwardprimer(seq id no.1):ggccgcgccaccatggccaca；
68.reverse primer(seq id no.2):ttacgtaggtcctccagcacggtcag。
69.实施例2载体构建载体构建的方法包括如下步骤：
70.1、如seq id no.62所示的tcr基因合成后进行pcr扩增以合成的tcr基因为模板，运用seq id no.1和seq id no.2进行pcr扩增；pcr反应体系如下：pcr预混液25μl，正向引物5μl，引物浓度：10μm/μl，反向引物5μl，引物浓度：10μm/μl，合成的tcr基因序列1μl，浓度：10ng/μl，nuclease-free water 14μl，总反应体系共50μl；pcr反应程序：98℃，2min；(98℃，15s；64℃，15s；72℃，20s)30循环；72℃，2min。
71.2、pcr产物胶回收：对步骤1中的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后胶回收，具体步骤参照试剂盒takara minibest agarose gel dna extraction kit ver.4.0说明书，制备琼脂糖凝胶，对回收产物片段运行电泳，其结果如图1示。
72.3、线性化载体与胶回收片段进行同源重组：步骤2中的胶回收pcr产物片段与线性化的载体重组摩尔比为1:1，然后加入10μl的2x seamless cloning mix，并用水补至20μl，50℃反应30min，载体骨架核酸序列如seq id no.31所示，重组质粒图谱信息如图2所示。
73.4、重组质粒载体转化dh5α感受态细菌：取5μl步骤4的反应样品加入到50μl dh5α等感受态细胞中，轻轻混匀，将该混合物置于冰上30min；42℃水浴中90秒进行热激，然后迅速放回冰浴中，静置3～5min；加入300μl不含抗生素的lb培养液，轻轻混匀，37℃震荡培养1h；然后全部均匀涂布到含适当抗生素的lb平板上，37℃培养箱中培养过夜。
74.5、质粒提取：挑取步骤4中的单克隆菌落，摇菌过夜；取5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，12,000rpm离心1min，吸除上清；向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液p1，吹散沉淀；向离心管中加入250μl溶液p2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解；向离心管中加入350μl溶液p3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12,000rpm离心10min；将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱中，12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；向吸附柱中加入600μl漂洗液pw，12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱入收集管中；重复上一步骤；将吸附柱c放入收集管中，12,000rpm离心2min；将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μl洗脱缓冲液，室温放置2min，12,000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
75.6、重组质粒的鉴定：对步骤5中提取的质粒做双酶切、测序鉴定，酶切电泳结果及测序峰图见图3、图4。
76.实施例3载体的使用
77.本过程包括病毒液的制备及细胞的转染，详细过程如下所述：
78.1、制备病毒液：lipo3000转染293ft细胞，转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔板培养板中，lipo3000试剂转染操作流程详细步骤参见试剂invitrogen
tm
lipofectamine
tm
3000transfection reagent；37℃、5％co2培养培养48小时，吸除培养基上清，细胞用于转染；
79.2、病毒转染jurkat细胞：293t细胞转染后第二天，用retronectin包被24孔培养板，4℃过夜备用；将病毒液加入retronectin包被过的24孔培养板中，32℃，2000g，离心2h，弃去上清液；取适量转染的jurkat细胞加入24孔培养板中，30℃，600g，离心30min，使细胞贴于底壁；离心完毕后，将培养板置于37℃，5％co2培养箱中培养。48h后，取适量细胞，500g离心5min，去培养基上清；pbs重悬，hcd3(pe)/mtcrbeta(pb)流式染料各1ul，室温避光染色15min，加入1ml pbs，500g离心5min，去上清；适量pbs或fasc buffer重悬后做流式细胞检测，其结果流式图如图5～19所示。
80.实施例4：结果验证
81.结果验证详细过程如下所述：收集k562细胞，重悬并计数，在24孔板中进行刺激共培养，每孔4e5个k562细胞，加相应的抗原肽至终浓度10μg/ml；培养箱中孵育1.5h，将24孔板离心去培养基上清；补新鲜培养基及每孔2e5个转染的jurkat细胞，孵育过夜；hcd3(pe)，mtcrbeta(pb)，hcd69(apc)，室温避光染色15min；加pbs清洗后做流式细胞检测，其结果流式图如图20～34所示。
82.实施例5
83.按照seq id no.77所示的质粒载体设置l2-1、l2-2、l2-3、l2-5、l2-6、l2-9、l2-10、l2-11、l2-12、l2-13、l2-16、l2-19、l2-23、l2-24和l2-25位点对应的tcr基因片段，得到seq id no.78～92所示的基因片段，所述l2-1位点对应seq id no.78，所述l2-2位点对应seq id no.79，所述l2-3位点对应seq id no.80，所述l2-5位点对应seq id no.81，所述l2-6位点对应seq id no.82，所述l2-9位点对应seq id no.83，所述l2-10位点对应seq id no.84，所述l2-11位点对应seq id no.85，所述l2-12位点对应seq id no.86，所述l2-13位点对应seq id no.87，所述l2-16位点对应seq id no.88，所述l2-19位点对应seq id no.89，所述l2-23位点对应seq id no.90，所述l2-24位点对应seq id no.91，所述l2-25位点对应seq id no.92。利用这十五个位点设计的引物，同样能实现实施例1～4所述效果。
84.由以上实施例可知，本发明提供了一种针对表位点为flyalalll的tcr所设计的引物及其应用，所述引物对包括l2-1位点的引物对、l2-2位点的引物对、l2-3位点的引物对、l2-5位点的引物对、l2-6位点的引物对、l2-9位点的引物对、l2-10位点的引物对、l2-11位点的引物对、l2-12位点的引物对、l2-13位点的引物对、l2-16位点的引物对、l2-19位点的引物对、l2-23位点的引物对、l2-24位点的引物对和l2-25位点的引物对中的一种或多种。本发明的引物对针对分型为hla a02、表位点为flyalalll的患者体内ebv病毒抗原肽段的tcr所设计，能够实现特定质粒的克隆。