一种齐墩果烷型三萜酸与其组合物及其制备方法和应用

1.本发明涉及医药化学领域，具体是涉及一种齐墩果烷型三帖酸与其组合物，以及从篦齿虎耳草中提取分离制备上述齐墩果烷型三帖酸与其组合物的制备方法，以及其在预防/治疗消化系统中胆汁酸代谢紊乱相关疾病中的应用，如胆汁淤积性肝炎、原发性胆汁性胆管炎、非酒精性脂肪性肝病以及相关的癌症如肝癌、胆管癌、肝胆管癌、结肠癌及胃腺癌等。


背景技术：

2.我国是一个“肝病大国”，如病毒性肝病、酒精性肝病、药物性肝病、自身免疫性肝病包括原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎等，各种肝胆疾病可进一步恶化导致纤维化、肝胆硬化甚至癌症，如肝癌、胆管癌、胃腺癌和结肠癌等。流行病学显示，我国由于肝炎和肝硬化的患者众多，致使肝癌在我国的发病率和病死率均高于世界平均水平，全世界50%以上的原发性肝癌发生在我国，每年约23万人死于肝癌，位列我国癌症病死率第二位。治疗上述疾病的保肝利胆药物很多，如基础代谢类药物、肝细胞膜保护剂、解毒护肝药、降酶药、利胆退黄药、非特异性抗炎药等，但依然缺乏特效药物。肝胆炎症及诱发疾病的发病机制十分复杂，其发生、发展、转移和复是多基因参与、多因素影响。多阶段发展的复杂网络调控，与多种基因的突变、多个细胞信号传导通路的异常密切相关。核受体尤其是异二聚体型核受体是调控复杂基因网络的细胞转录因子。目前在肝胆炎症及消化系统癌症尤其是肝癌治疗药物研究方面已成为重要的靶标研究热点。fxr作为胆汁酸的异二聚体型核受体，在胆固醇代谢、胆酸代谢、脂代谢、糖代谢、肝脏的正常生理功能和肝脏保护中发挥着重要的作用。fxr在肝脏或肠中被激活或抑制后后，可激活或抑制体内fxr信号通路中相关受体，从而影响体内胆汁酸的合成，分泌，摄入，排泄等环节，从而调节胆汁酸的代谢，维持体内胆汁酸稳态，对肝脏起到保护作用。大量的药理学研究表明fxr激动剂对于肝脏相关疾病有着很好的治疗作用，如胆汁淤积、胆石症、肝脏损伤和手术切除后的再生、非酒精性脂肪肝（nafld)和肝硬化。fxr激动剂奥贝胆酸（ocaliva，oca）已于2016年通过fda认证用于治疗原发性胆汁性肝硬化，而且已继续进行开展用于治疗非酒精性脂肪肝的临床试验。有报道称慢性炎症和胆汁淤积可能是肝癌、胆管癌等恶性肿瘤形成的两大环节。fxr在肿瘤细胞中表达程度的差异可能是影响血清总胆汁酸浓度的重要原因，进而在不同侵袭性肝癌中调节胆汁酸代谢而发挥作用。激活fxr可抑制白细胞介素-6（il-6）、诱导型一氧化氮合成酶（inos）、核因子-κb（nf-κb）、环氧化酶-2（cox-2）等多种炎症因子的表达，而这些都是促癌生长的重要因素。在肝癌中，活化fxr可降低nf-κb 的活性，调控相关抑癌基因的表达，抑制肝癌细胞增殖，促进肝癌细胞凋亡; 结肠癌中，缺失fxr提高慢性结肠炎小鼠模型的癌变率，激活fxr 还可降低该模型小鼠肠道上皮的增生及炎症，fxr的缺失会增加肠异型增生的发生率并起到促癌作用，活化fxr 对结肠肿瘤细胞的生长有抑制作用。新近发现，喂食了牛黄胆酸钠的小鼠表现出回肠shp的高表达，以及fgf15和ibabp等其他fxr依赖基因；胆管上皮癌的发生与胆管慢性炎症和胆汁淤积这两大危险因子密切相关，胆管上皮癌的易感性可
部分归结于单元型atp8b1( fic1)，而在患癌病人中，v444a的表达有着相同的趋势，有可能在基因层面上，fxr可通过影响abcb11 ( bsep ) 和atp8b1 ( fic1) 而参与肿瘤的发生与发展；胃十二指肠之间的胆汁反流不仅造成炎症，还是胃食管癌的危险因子。fxr可增加胃上皮细胞对炎症介导损害的抵抗力，并且也由此对胃癌起到一定抑制作用，核受体在肿瘤不同阶段表达不同，fxr 可以将barret's 食管癌中没有恶性增生的情况从腺癌和恶性增生中区分出来，在pxr 的配合下，还可将高度恶化增生从低度恶化增生和没有恶化增生这两种情况中区分出来。
3.篦齿虎耳草saxifraga. umbellulata var. pectinata为藏药“蒂达”的主要基原植物之一，主要分布在西藏地区。“蒂达”是藏医药中治疗肝胆类疾病的一类药物的总称。据藏医药经典著作《晶珠本草》记载：“蒂达可清热，治胆病、血病等赤巴病症状”。“赤巴”系藏医学理论中与消化系统密切相关的维持人体正常生命活动的三大因素之一，现代各种肝胆类疾病症状与藏医临床上的“赤巴病”症状相似。篦齿虎耳草的现代研究报道较少，只有少量的化学成分研究报道，主要为黄酮类、姜黄素类和酚酸类成分，而与其临床应用相关的保肝利胆的活性研究几乎没有。笔者在前期活性筛选中，篦齿虎耳草的乙醇总提取物对anit诱导的小鼠急性肝内胆汁淤积型肝损伤以及四氯化碳诱导的小鼠急性化学性肝损伤都具有很好的抵抗作用。因此，本发明从该活性提取物中分离制备获得齐墩果烷型三帖酸类化合物，经ca数据库网络版scifinder数据库检索，其中的虎耳草酸saxifragic acid为新化合物，在现有技术中都没有涉及从篦齿虎耳草中分离得到的具有预防/治疗肝胆炎症疾病及相关癌症作用的该类化合物的化学结构、药理学数据及其制备方法。


技术实现要素：

4.针对上述现有背景技术中存在的缺陷，本发明的有如下几个目的。
5.目的1：在于提供一种从篦齿虎耳草中提取分离的预防/治疗肝胆炎症疾病及相关癌症的齐墩果烷型三帖酸类化合物。
6.目的2：是提供一种含有治疗有效量的上述齐墩果烷型三帖酸类化合物的药物组合物。
7.目的3：是提供一种从篦齿虎耳草中提取和分离上述齐墩果烷型三帖酸类化合物与其药物组合物的制备方法。
8.目的4：是提供上述齐墩果烷型三帖酸类化合物与其组合物在制备预防/治疗肝胆炎症疾病及相关癌症中的应用。
9.上述的齐墩果烷型三帖酸类化合物在制备预防/治疗肝胆炎症疾病及相关癌症中的应用为胆汁酸核受体-法尼醇x受体（fxr）信号通路相关受体的激动剂或抑制剂以及肝癌、胆管癌、结肠癌和胃腺癌等癌细胞增殖的抑制剂。
10.实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明的化合物为从篦齿虎耳草中分离制备的一类齐墩果烷型三帖酸类化合物，其具有如下结构式ⅰ（虎耳草酸：saxifragic acid）和式ⅱ（去乙酰基虎耳草酸）所示的结构：
。
11.本发明提供了上述预防 / 治疗肝胆炎症疾病及相关癌症的药物的单一或组合物来源的篦齿虎耳草活性部位提取物，该活性部位提取物通过如下步骤制得， (a) 用醇、水或其混合物浸泡、渗漉或者回流提取篦齿虎耳草样品，过滤后得到提取液；其中所述的醇为甲醇或乙醇；(b) 将得到的提取液中的溶剂蒸发形成流浸膏；(c) 将水加入到该流浸膏中，得到总提取物的水混悬液；(d) 用石油醚、类石油醚小极性溶剂或其混合物对上述混悬液进行液液萃取，得到石油醚、类石油醚的小极性溶剂或其混合物的萃取物，萃取物蒸干即得活性部位提取物su-pe。
12.本发明提供了上述预防 / 治疗肝胆疾病及相关癌症的齐墩果烷型三帖酸类化合物的制备方法，可将上述得到的篦齿虎耳草活性部位提取物su-pe，经过进一步层析分离后，可以制得本发明的齐墩果烷型三萜酸类化合物虎耳草酸（saxifragaic acid）和去乙酰基虎耳草酸：（1）将上述所得活性部位提取物pe部位用硅胶h柱进行柱层析，依次用体积比为50∶1、40∶1、20∶1、10∶ 1、1:1的氯仿∶甲醇混合溶剂体洗脱，通过tlc 板检测，根据tlc板显示，将相似组分合并并浓缩，根据rf 值在0.6 ～ 0.2 之间从大到小获得1～9九个组分；（2）采用uplc-ms导向分离出含514分子量的上述组分，用氯仿∶甲醇（20:1，v:v）混合溶剂溶解，放置进行重结晶操作，将结晶滤出即得虎耳草酸；（3）采用uplc-ms导向分离出含472分子量的上述组分用氯仿∶甲醇（20:1，v:v）混合溶剂溶解，放置进行重结晶操作，将结晶滤出即得去乙酰基虎耳草酸。
13.与现有技术相比，本发明的有益效果是：上述化合物虎耳草酸（saxifragic acid）是未见文献报道的新化合物；以及虎耳草酸、去乙酰基虎耳草酸其来源活性部位的制备方法；以及上述齐墩果烷型三帖酸类化合物在预防/治疗肝胆炎症疾病及相关癌症中的应用未见文献报道。
14.上述齐墩果烷型三帖酸类化合物在体外癌细胞细胞毒实验中，表现出不同程度的对肝癌细胞、肝胆管癌细胞、胆管癌细胞、胃腺癌细胞增殖的抑制作用。
15.上述齐墩果烷型三帖酸类化合物对体外人肝癌细胞hepg2中fxr信号通路的相关蛋白表达具有调控作用。
附图说明
16.图1本发明所述化合物虎耳草酸（saxifragic acid）和去乙酰基虎耳草酸的化学
2.3 hz）为烯氢质子；碳谱（附图6）也显示有六个甲基单峰信号，另有δ137.4 和δ126.5 两个碳原子为双键信号，显示结构中存在一环内双键。另外碳谱数据δ76.5 和δ75.0显示有2个联氧碳原子。其碳谱数据虎耳草酸与已知化合物3α, 29-dihydroxyolean-12-en-27-oic acid较为相似，只是多了一个乙酰基信号[δ
h 2.04 (s, 3h); δ
c 21.2, 172.0 ]，推测该化合物是3α, 29-dihydroxyolean-12-en-27-oic acid的乙酰化产物。通过hmbc谱相关信号h
3-30
ꢀ→ꢀ
c-19 (d
c 38.4), c-20(d
c 35.0)、c-21(d
c 28.9)和c-31(d
c 172.0)，证明乙酰基连接在29位羟甲基上。有幸的是我们获得了该化合物的单晶，通过单晶x射线衍射（cu kα）实验，其结构得以确立（见附图2），单晶数据已上传至剑桥单晶数据库，ccdc号：2119452：经scifinder数据库查询，该化合物为新化合物，命名为虎耳草酸（saxifragic acid）；去乙酰基虎耳草酸：白色粉末，易溶于氯仿。5%硫酸乙醇加热显紫色。其旋光、紫外、红外数据与虎耳草酸非常相似，说明其与虎耳草酸为同类型化合物。高分辨质谱数据（附图4） m/z 471.3459 [m-h]
‑ (calcd. for c
30h47
o4: 471.3469)，计算其分子式c
30h48o4 ，不饱和度为7。氢、碳谱数据（附图7、8）显示其与虎耳草酸相比，少了一组乙酰基信号，推断其为虎耳草酸的脱乙酰基产物，且与文献中一报道数据高度相似；有幸的是我们获得了该化合物的单晶，通过单晶x射线衍射（cu kα）实验，其结构得以确立（见附图2），单晶数据已上传至剑桥单晶数据库，ccdc号：2119454；理化和光谱数据：去乙酰基虎耳草酸：无色针状结晶 (chcl3/meoh); 易溶于氯仿，5%硫酸乙醇加热显紫色；[α]
d25 = +100 (c 0.1, ch3oh); uv (meoh) λmax (log ε) 205 (3.17) nm; ir (ν
max
): 3333, 2924, 2857, 1689, 1543, 1462, 1387, 1265, 1226, 1067, 1026 cm
–1；高分辨质谱 (负离子模式) : m/z 471.3459 [m
ꢀ‑ꢀ
h]
‑ (calcd. for c
30h47
o4: 471.3469); 1
h nmr(600 mhz, cdcl3): δ 5.67(1h, br s), 3.39 (h, br s), 3.21 (2h, brs, ), 2.10-1.19 (21h, m), 1.03 (3h, s), 0.96 (3h, s), 0.93 (3h, s), 0.86 (3h, s), 0.85 (3h, s), 0.83 (3h, s); 13
c nmr (151 mhz, cdcl3): δ 179.5(c-27), 137.7(c-13), 126.5(c-12), 76.3(c-3), 74.3(c-29), 56.2(c-14), 48.9(c-5), 48.4(c-18), 47.3(c-9), 40.1(c-8), 38.6(c-19), 37.5(c-10), 37.3(c-4), 36.5(c-7), 36.3(c-20), 35.9(c-22), 33.3(c-17), 33.2(c-1), 28.5(c-21), 28.4(c-23), 28.3(c-28), 27.7(c-16), 25.2(c-2), 22.9(c-11), 22.5(c-24), 22.4(c-15), 19.3(c-30), 18.3(c-6), 18.2(c-26), 16.3(c-25).虎耳草酸（saxifraga acid）:无色针状结晶 (chcl3/meoh); 易溶于氯仿，5%硫酸乙醇加热显紫色；[α]
d25 = +82 (c 0.1, ch3oh); uv (meoh) λmax (log ε) 205 (3.87) nm; ir (kbr): 3439, 2938, 2876, 1713, 1697，1454, 1381, 1240, 1034, 987 cm
–1； 高分辨质谱 (负离子模式) m/z: 513.3546 [m
ꢀ‑ꢀ
h]
‑ (calcd. for c
32h49
o5: 513.3558); 氢谱和碳谱见下表
ꢀ
。
[0020]
实施例3本发明实施例中，考察篦齿虎耳草醇提取物各萃取部位：石油醚部位，乙酸乙酯部位，正丁醇部位对anit致小鼠胆汁淤积型肝损伤小鼠血清胆汁酸生化指标影响（总胆汁酸：tbil；直接胆红素：dbil；间接胆红素：ibil）；昆明小鼠随机分成空白对照组、模型组、熊去氧胆酸阳性组、篦齿虎耳草乙酸乙酯部位组、篦齿虎耳草正丁醇部位组、篦齿虎耳草石油醚
部位组，每组各10只；适应性饲养4天后开始灌胃；第1天灌胃前称重标记，空白对照组、模型组灌胃0.5%羧甲基纤维素钠溶液，熊去氧胆酸阳性组灌胃30 mg/ml熊去氧胆酸0.5%羧甲基纤维素钠溶液，中药各提取部位组各灌胃对应浓度的0.5%羧甲基纤维素钠混悬液，灌胃量均为0.1 ml/10 g，每日称重并灌胃，共给药7天；第6天给药2小时后除空白对照组外，其余各组灌胃anit橄榄油溶液(90mg/kg)造模，造模46小时后取材检测并检测胆汁酸生化指标（总胆红素：tbil；直接胆红素：dbil；间接胆红素：ibil）；结果见下表；实验结果表明篦齿虎耳草石油醚部位su-pe具有很好的抗胆汁淤积作用; 。
[0021]
实施例4本发明实施例中，mtt法检测化合物虎耳草酸和去乙酰基虎耳草素桉对人肝癌细胞（hepg2）、人肝内胆管癌细胞（hccc-9810）、人结肠癌细胞（ht-29）、人胃腺癌细胞（bgc-823）的增殖影响及ic50值；上述两个齐墩果烷型三帖酸类化合物给药浓度设置1，3，10，30，100，200μmol 6个浓度梯度，计算其对上述癌细胞的细胞毒作用的ic50值，结果如下表，。
[0022]
实施例5本发明实施例中，考察虎耳草酸与去乙酰基虎耳草酸对ccl4致人正常肝细胞l-02损伤后细胞存活率的影响。取正常人肝细胞l-02用含有10%的胎牛血清的dmem高糖培养液在37 ℃、5% co2、饱和湿度条件下静置恒温培养，当细胞生长至最佳状态，取对数生长期细胞用于本实验，细胞经0.25%胰蛋白酶消化后以细胞计数板基数，调整细胞密度为5
×
104个/ml，以每孔100μl的细胞悬液加入96孔培养板中，设置空白组，模型组，阳性药组（水飞蓟宾），给药组(0.5μg
·
ml-1
)，培养细胞24h，除空白组外加入60%的四氯化碳的饱和培养基，损伤2h后，加入mtt 继续培养4h，最后在490nm下全波长酶标仪下测定od值，计算存活率，结果见下表，可见虎耳草酸和去乙酰基虎耳草酸对受损伤肝细胞有保护作用；
。
[0023]
实施例6本发明实施例中，考察虎耳草酸与去乙酰基虎耳草酸对ccl4致人正常肝细胞l-02损伤后生化指标的影响；将密度为5
×
104个/ml的l-o2单细胞悬液，接种在12孔细胞培养板上，每孔1 ml静置培养细胞24h。设置空白对照、模型组、阳性对照（水飞蓟宾）、给药组，每组设置5个复孔，在同样条件下继续静置培养，24 h后加60%四氯化碳的培养基损伤2h，收集细胞上清液，备用，然后再向每个孔加入pbs清洗1遍，用ripa细胞裂解液充分裂解，显微镜下观察至全部破碎，最后细胞刮收集细胞，裂解后的细胞在4℃、14000g条件下离心5min，取上清备用；按照试剂盒说明书上的操作表对细胞培养上清液进行alt、ast的活力及mda的含量测定，同样按照试剂盒说明书对细胞裂解后的上清液进行sod的活力测定；生化指标检测结果见附图9；结果表明虎耳草酸与去乙酰基虎耳草酸有能够明显减少受损伤肝细胞的转氨酶泄露和提高肝细胞的抗氧化应激能力。
[0024]
实施例7本发明实施例中，srb法检测虎耳草酸（saxifragic acid）对人肝癌细胞（hepg2）的细胞毒作用，计算细胞存活率，确定最佳给药浓度；最终确定虎耳草酸的给药浓度梯度设置为25，12.5，6.25μg/ml；将各浓度药物作用于hepg2细胞后，通过western blot实验，检测对fxr信号通路相关蛋白表达的影响，结果如附图10；测得虎耳草酸对胆汁酸受体蛋白fxr呈浓度依赖的激活作用，且对胆汁酸转运蛋白多药耐压相关蛋白2(mrp2)呈浓度依赖的激活作用。
[0025]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0026]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。