人源化转基因动物的制作方法

人源化转基因动物
1.本技术是申请日为2020年01月17日，申请号为202010052686.4，发明名称为“人源化转基因动物”的中国发明专利申请的分案申请。
2.本技术要求于2019年01月17日递交的申请号为cn 201910044180.6，发明名称为“人源化转基因动物”的中国专利申请的优先权，以及2019年07月09日递交的申请号为cn 201910616231.8，发明名称为“人源化转基因动物”的中国专利申请的优先权，在此全文引用上述中国专利申请公开的内容以作为本技术的一部分。
技术领域：
3.本发明涉及基因工程领域，具体人源化改造的转基因非人动物，尤其是啮齿类动物，例如转基因小鼠。具体而言，本发明涉及包含人白介素17a(il-17a)基因、人基因17ra(il-17ra)和/或人tnf-α基因的序列的转基因小鼠，其制备方法和用途。
技术背景：
4.白细胞介素(interleukin,il)17细胞因子(简称“il-17”或“il-17”)家族是一类特征性细胞因子，主要由活化的t细胞分泌。il-17家族目前已经发现了6个成员，分别是il-17a、il-17b、il-17c、il-17d、il-17e(又称il-25)和il-17f。il-17受体(简称“il-17r”或“il-17r”)也形成了一个独特的家族，目前发现了5个同源亚基，分别是il-17ra、il-17rb、il-17rc、il-17rd、il-17re。il-17通过与受体结合，启动其下游信号通路(包括map激酶途径、nf-kb途径、mrna稳定信号途径、erk信号途径以及jak/stat信号途径等)，刺激多种细胞产生炎症介质，已成为免疫和炎性疾病的关键参与因子，并可导致器官特异性或全身性自身免疫疾病。
5.大量的研究已经证实多种自身免疫性疾病有着高水平的il-17表达(如多发性硬化、哮喘、炎症性肠病、银屑病、和类风湿性关节炎等)。此外，il-17还与多种自身免疫性疾病的发生发展密切相关，包括克罗恩病，白塞病、系统性红斑狼疮、原发性干燥综合征、多发性硬化、心肌炎、i型糖尿病、甲状腺炎、特异性皮炎、超敏反应、类风湿性关节炎、移植物抗宿主病、银屑病等。此外，il-17还在多种肿瘤组织中表达。il-17具有与tnf-α、ltα、ifnγ和il-1β等细胞因子协同扩大炎症的生物学效应。il-17和il-17r缺乏导致过敏原特异性免疫反应和自身免疫性炎症反应减少。通过特异性抗体阻断il-17的体内生物学活性，在临床中已经表现出显著的效果。目前美国fda已经批准三款靶向人il-17/il-17r相关抗体，包括il-17a单抗secukinumab、ixekizumab和il-17ra单抗brodalumab，适应症主要是中重度斑块状银屑病。然而，这些药物存在明显的副作用，比如感染、腹泻等，以及brodalumab与患者自杀倾向相关。更多靶向该信号通路的新型药物正在或已经进入临床研究。考虑到现有治疗自身免疫性疾病的药物大多只能改善疾病症状，远不能充分满足临床需求，仍需要开发更多靶向il-17/il-17r的药物。
6.实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和药物是不可缺少的研究工具。由于人il-17及其受体家族的氨基酸序列与啮齿类动物中的对
应蛋白存在显著差异，如人il-17a和小鼠il-17a蛋白序列的一致性仅为60％，因此，识别人il-17a蛋白的抗体通常无法识别小鼠il-17a，即无法用普通小鼠来筛选和评价靶向il-17/il-17r信号通路药物的药效。鉴于il-17/il-17r在疾病发生过程中的广泛参与性和靶向该信号通路的巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域仍急需开发人源化il-17/il-17r信号通路相关的非人动物模型。


技术实现要素：

7.除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、重组dna和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：molecular cloning a laboratory manual,2nded.,ed.by sambrook，fritschand maniatis(cold spring harbor laboratory press:1989)；dna cloning,volumes i and ii(d.n.glovered.,1985)；oligonucleotide synthesis(m.j.gaited.,1984)；mullisetal.u.s.pat.no.4,683,195；nucleic acid hybridization(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；transcription and translation(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；culture of animal cells(r.i.freshney，alanr.liss,inc.,1987)；immobilized cells and enzymes(irl press,1986)；b.perbal,apractical guide to molecular cloning(1984)；the series,methods in enzymology(j.abelson and m.simon，eds.
–
in-chief,academic press,inc.,new york),vols.154and 155(wuetal.eds.)and vol.185,
″
gene expression technology
″
(d.goeddel,ed.)；gene transfer vectors for mammalian cells(j.h.miller and m.p.caloseds.,1987,cold spring harbor laboratory)；immunochemical methods in cell and molecular biology(mayer and walker,eds.,academic press,london,1987)；handbook of experimental immunology,volumes v(d.m.weir and c.c.blackwell,eds.,1986)；和manipulating the mouse embryo,(cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.,1986)。
8.il-17a/ir-17ra
9.白细胞介素17细胞因子(简称“il-17”或“il-17”)家族是一类特征性细胞因子，主要由活化的t细胞分泌。il-17家族目前已经发现了6个成员，分别是il-17a、il-17b、il-17c、il-17d、il-17e(又称il-25)和il-17f。il-17家族的成员与任何其它已知的细胞因子序列相似性很差，而且家族成员之间的序列相似性也比较低：il-17f与il-17a具有最高的同源性(55％)，并且通常与il-17a共表达；il-17b，il-17d和il-17c的序列与il-17a重叠29％至23％，而il-17e似乎是该家族中最不同的成员，仅具有16％的序列同源性(gaffen sl,nat.rev.immunol.2009aug；9(8):556-67)。il-17受体(简称“il-17r”或“il17r”)也形成了一个独特的家族，目前发现了5个同源亚基，分别是il-17ra、il-17rb、il-17rc、il-17rd、il-17re，其中il-17rb、rc、rd、re与最早发现的il-17ra具有同源性。il17通过与受体结合，启动其下游信号通路(包括map激酶途径、nf-kb途径、mrna稳定信号途径、erk信号途径以及jak/stat信号途径等)刺激多种细胞产生炎症介质，已成为免疫和炎性疾病的关键参与成分，并可导致器官特异性或全身性自身免疫疾病。
10.il17受体属于i型跨膜蛋白，其中il-17ra为普遍表达；il-17rb优势表达在一类介
导气道过敏反应的nkt细胞表面；il-17rc的表达仅限于细胞基质细胞和非造血细胞，在胸腺和白细胞中不表达；il-17rd主要表达在内皮细胞、上皮细胞和平滑肌细胞；表达il-17re的细胞尚不明确，有研究表明小鼠结肠、肾脏等可表达。il-17家族成员都含有4个半胱氨酸和2个丝氨酸残基形成的半胱氨酸结节，除了il-17b外，il-17家族成员都形成二聚体。il-17a和il-17f可以同源二聚体或者互相形成异源二聚体的形式存在，与il-17ra和il-17rc形成的异源二聚受体复合物结合启动下游的信号转导信号通路，其中il-17a或者il-17f的二聚体先与il17-ra或者il17-rc中的一种受体结合，一旦结合一种受体，则二聚体中没有结合的单体会对前面结合的同种受体的亲和力下降，导致剩余单体只结合另外一种类型的受体。但是在小鼠体内，有一定的区别，虽然鼠il-17ra可以结合鼠il-17a 和il17-f，但是鼠il-17rc只能结合il-17f。目前对于每个il-17r与哪个配体结合还没有完全弄清楚(见表1)，但已有研究提示显示普遍表达的il-17ra可能是所有il-17家族成员共用的信号传导亚基。根据激活细胞的不同，il-17ra信号可诱导多种分子的合成，如细胞因子、趋化因子、抗菌肽、粘液素等。il-17ra缺陷小鼠对多种炎性疾病，如风湿性关节炎、多发性硬化症(ms)、哮喘具有抵抗能力，但同时易发生多种病原体，如弓形虫和白色念珠菌感染。另外，人il-17a和人il-17f都能在鼠源细胞中引起趋化因子配体(cxcl)1的产生，提示不存在种属特异性。但是hil-17ar单独却不能在il-17ra-/-的小鼠成纤维细胞中启动信号通路，提示hil-17ar和hil-17rc具有种属特异性。
11.表1 il17/il-17r家族
12.受体(复合物)配体il-17ra/rcil-17a,il-17f,il-17a/f,vil-17
*
il-17ra/rbil-17e(il-25)il-17rd(sef)未知il-17ra/rd未知il-17reil-17c未知il-17d
13.*表示病毒il-17，见gaffen sl.current opinion in immunology.2011；23(5):613-619。
14.由于人il-17及其受体家族的氨基酸序列与啮齿类动物中的对应蛋白存在显著差异，如人il-17a和小鼠il-17a蛋白序列的一致性仅为60％，因此，识别人il-17a蛋白的抗体通常无法识别小鼠il-17a，即无法用普通小鼠来筛选和评价靶向il-17/il-17r信号通路药物的药效。
15.转基因非人动物
16.本发明通过构建在基因组中包含人il-17a基因和/或il-17ra基因的序列的转基因非人动物，例如转基因小鼠，解决了上述技术问题。
17.相应地，在一个方面，本发明涉及一种转基因非人动物，所述动物的基因组中包含可表达形式的人il-17a基因的序列。
18.如本文所用，“可表达形式”的基因是指基因在启动子的控制下在动物或动物细胞中表达，所述启动子在所述动物或动物细胞中能够发挥功能。启动子没有特别限制，只要其在引入了所述基因的动物或动物细胞中发挥功能。启动子可以是源自所述动物或动物细胞
no:35具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述人il-17ra基因的序列包含seq id no:31或seq id no:35，或由seq id no:31或seq id no:35组成。
30.在一些实施方案中，所述人tnf-α基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
31.在一些实施方案中，所述人tnf-α基因的序列包含人tnf-α基因的编码序列。在一些实施方案中，所述人tnf-α基因的序列包含人tnf-α基因自起始密码子至终止密码子的序列。
32.在一些实施方案中，所述人tnf-α基因的序列包含与seq id no:57或seq id no:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述人tnf-α基因的序列包含seq id no:57或seq id no:61，或由seq id no:57或seq id no:61组成。
33.在另一个方面，本发明涉及一种转基因非人动物，所述动物的基因组中包含可表达形式的人il-17ra基因的序列。
34.在一些实施方案中，所述人il-17ra基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
35.在一些实施方案中，所述动物表达人il-17ra蛋白。在另一些实施方案中，所述，所述动物表达嵌合il-17ra蛋白。
36.在一些实施方案中，所述人il-17ra基因的序列包含人il-17ra基因的编码序列。在另一些实施方案中，所述人il-17ra的序列包含人il-17ra基因自2号外显子至11号外显子的序列。
37.在一些实施方案中，所述人il-17ra基因的序列包含与seq id no:31或seq id no:35具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述人il-17ra基因的序列包含seq id no:31或seq id no:35，或由seq id no:31或seq id no:35组成。
38.在一些实施方案中，所述动物对于所述人il-17ra基因的序列是纯合的。在另一些实施方案中，所述动物对于所述人il-17ra基因的序列是杂合的。
39.在一些实施方案中，除包含可表达形式的人il-17ra基因的序列外，所述转基因动物的基因组中还可以包含可表达形式的人tnf-α基因的序列。所述动物对于所述人tnf-α基因的序列可以是纯合的，或者是杂合的。
40.在一些实施方案中，所述人tnf-α基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
41.在一些实施方案中，所述人tnf-α基因的序列包含人tnf-α基因的编码序列。在一些实施方案中，所述人tnf-α基因的序列包含人tnf-α基因自起始密码子至终止密码子的序列。
42.在一些实施方案中，所述人tnf-α基因的序列包含与seq id no:57或seq id no:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述人tnf-α基因的序列包含seq id no:57或seq id no:61，或由seq id no:57或seq id no:61组成。
43.在上述转基因非人动物的任何实施方案中，所述动物可以选自哺乳动物，例如非灵长类动物，例如，家畜、猪、牛、绵羊、山羊、鸡、兔、鱼、斑马鱼、狗、小鼠、猫、大鼠，以及实验室动物。
44.在一些实施方案中，所述其中所述动物是啮齿类动物，例如小鼠和大鼠。在优选的实施方案中，所述动物是小鼠。
45.本领域已知各种品系的小鼠和大鼠，并可以用于制备如本技术所述的转基因非人动物。例如，所述小鼠可以选自以下品系：
46.c57bl株的小鼠，例如选自c57bl/a，c57bl/an，c57bl/grfa，c57bl/kalwn，c57bl/6，c57bl/6j，c57bl/6byj，c57bl/6nj，c57bl/10，c57bl/10scsn，c57bl/10cr，c57bl/ola；
47.129株的小鼠，例如选自129p1，129p2，129p3，129x1，129s1(如，129s1/sv，129s1/svim)，129s2，129s4，129s5，129s9/svevh，129s6(129/svevtac)，129s7，129s8，129t1，129t2；
48.balb株，例如balb/c；和
49.上述品系的杂交体，例如50％balb/c-50％12954/sv；或50％c57bl/6-50％129。
50.所述大鼠可以选自以下品系：wistar大鼠、lea株、sprague dawley株、fischer株、f344、f6和dark agouti，以及两个或更多个上述品系的的杂交体。
51.在另一个方面，本发明涉及从上述转基因非人动物获得的细胞。在一些实施方案中，所述细胞可以选自体细胞、干细胞例如胚胎干细胞、生殖细胞和受精卵。
52.动物细胞
53.在一个方面，本发明涉及一种非人动物细胞，所述细胞的基因组中包含可表达形式的人il-17a基因的序列。
54.在一些实施方案中，所述人il-17a基因的序列替换所述细胞的基因组中对应的内源性序列。
55.在一些实施方案中，所述人il-17a基因的序列包含人il-17a基因的编码序列。在一些实施方案中，所述人il-17a基因的序列包含人il-17a基因自起始密码子至终止密码子的序列。
56.在一些实施方案中，所述人il-17a基因的序列包含与seq id no:3或seq id no:7具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述人il-17a基因的序列包含seq id no:3或seq id no:7，或由seq id no:3或seq id no:7组成。
57.在一些实施方案中，所述细胞对于所述人il-17a基因序列或其片段是纯合的。在另一些实施方案中，所述细胞对于所述人il-17a基因序列或其片段是杂合的。
58.在一些实施方案中，所述细胞的基因组中还包含可表达形式的人il-17ra基因的序列和/或人tnf-α基因的序列。
59.在一些实施方案中，所述人il-17ra基因的序列包含人il-17ra基因的编码序列。在另一些实施方案中，所述人il-17ra的序列包含人il-17ra基因自2号外显子至11号外显子的序列。
60.在一些实施方案中，所述人il-17ra基因的序列替换所述细胞的基因组中对应的内源性序列。
61.在一些实施方案中，所述人il-17ra基因的序列包含与seq id no:31或seq id no:35具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述人il-17ra基因的序列包含seq id no:31或seq id no:35，或由seq id no:31或seq id no:35组成。
62.在一些实施方案中，所述人tnf-α基因的序列替换所述细胞的基因组中对应的内源性序列。
63.在一些实施方案中，所述人tnf-α基因的序列包含人tnf-α基因的编码序列。在一些实施方案中，所述人tnf-α基因的序列包含人tnf-α基因自起始密码子至终止密码子的序列。
64.在一些实施方案中，所述人tnf-α基因的序列包含与seq id no:57或seq id no:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述人tnf-α基因的序列包含seq id no:57或seq id no:61，或由seq id no:57或seq id no:61组成。
65.在另一个方面，本发明涉及一种非人动物细胞，所述细胞的基因组中包含人il-17ra基因的序列。
66.在一些实施方案中，所述人il-17ra基因的序列替换所述细胞的基因组中对应的内源性序列。
67.在一些实施方案中，所述细胞表达人il-17ra蛋白。在另一些实施方案中，所述，所述细胞表达嵌合il-17ra蛋白。
68.在一些实施方案中，所述人il-17ra基因的序列包含人il-17ra基因的编码序列。在另一些实施方案中，所述人il-17ra的序列包含人il-17ra基因自2号外显子至11号外显子的序列。
69.在一些实施方案中，所述人il-17ra基因的序列包含与seq id no:31或seq id no:35具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述人il-17ra基因的序列包含seq id no:31或seq id no:35，或由seq id no:31或seq id no:35组成。
70.在一些实施方案中，所述细胞对于所述人il-17ra基因的序列是纯合的。在另一些实施方案中，所述细胞对于所述人il-17ra基因的序列是杂合的。
71.在一些实施方案中，除包含可表达形式的人il-17ra基因的序列外，所述细胞的基因组中还可以包含可表达形式的人tnf-α基因的序列。所述细胞对于所述人tnf-α基因的序列可以是纯合的，或者是杂合的。
72.在一些实施方案中，所述人tnf-α基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
73.在一些实施方案中，所述人tnf-α基因的序列包含人tnf-α基因的编码序列。在一些实施方案中，所述人tnf-α基因的序列包含人tnf-α基因自起始密码子至终止密码子的序列。
74.在一些实施方案中，所述人tnf-α基因的序列包含与seq id no:57或seq id no:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述人tnf-α基因的序列包含seq id no:57
或seq id no:61，或由seq id no:57或seq id no:61组成。
75.在上述关于非人动物细胞的任何实施方案中，所述细胞可以是啮齿类动物细胞，例如小鼠或大鼠细胞。所述小鼠和大鼠可以是本领域已知的任何品系的小鼠和大鼠，例如上文所述的任何品系的小鼠和大鼠。
76.在上述关于非人动物细胞的任何实施方案中，所述细胞可以选自体细胞、干细胞例如胚胎干细胞、生殖细胞和受精卵。
77.在一个方面，本发明涉及本发明的非人动物细胞在制备转基因非人动物中的用途。
78.在另一个方面，本发明涉及本发明的转基因非人动物和非人动物细胞在筛选调节il-17a/il-17-ra信号通路的试剂中的用途。
79.在一些实施方案中，所述试剂可以选自抗体、抗体片段、对应受体或配体或其片段、融合蛋白和小分子化合物。
80.在再一个方面，本发明涉及本发明的转基因非人动物在构建与il-17a/il-17ra信号通路异常相关的疾病模型中的用途。
81.在一些实施方案中，所述疾病选自自身免疫病和肿瘤。在一些实施方案中，所述疾病可以选自多发性硬化症、哮喘、炎症性肠病、银屑病、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、白塞病、系统性红斑狼疮、原发性干燥综合征、心肌炎、i型糖尿病、甲状腺炎、特异性皮炎、超敏反应、移植物抗宿主病。
82.在一个方面，本发明涉及本发明的il-17a人源化动物在测试针对人il-17a的试剂的体内药效中的用途。
83.在一些实施方案中，所述试剂选自针对人il-17a的抗体或抗体片段，或小分子拮抗剂。
84.在一些实施方案中，所述转基因非人动物用于构建与il-17a信号通路异常相关的疾病模型，并在所述疾病模型中测试所述试剂的体内药效。
85.在一些实施方案中，所述疾病模型是自身免疫病模型，例如选自实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)和银屑病模型。在一些实施方案中，所述银屑病模型是咪喹莫特诱导的银屑病模型。
86.在另一个方面，本发明涉及一种测试针对人il-17a的试剂的体内药效的方法，所述方法包括：
87.a.使用本发明的il-17a人源化动物构建与il-17a信号通路异常相关的疾病模型；
88.b.对所述疾病模型动物施用所述针对人il-17a的试剂；和
89.c.评估所述针对il-17a的试剂的体内药效。
90.在一些实施方案中，所述试剂选自针对人il-17a的抗体或抗体片段，或小分子拮抗剂。
91.在一些实施方案中，所述疾病模型是自身免疫病模型，例如选自实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)和银屑病模型。在一些实施方案中，所述银屑病模型是咪喹莫特诱导的银屑病模型。
92.重组载体
93.在一个方面，本发明涉及一种重组载体，所述载体包含人il-17a基因的编码序列
或自起始密码子至终止密码子的序列和小鼠il-17a基因上游和下游同源臂序列。
94.如本文所用，术语“重组载体”是指可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制的载体。通常，在重组dna技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。然而，本发明旨在包括其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们发挥等同的功能。
95.在一些实施方案中，所述人il-17a基因的序列包含与seq id no:3或seq id no:7具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述人il-17a基因的序列包含seq id no:3或seq id no:7，或由seq id no:3或seq id no:7组成。
96.在一些实施方案中，所述小鼠il-17a基因上游和下游同源臂序列各自包含至少100个核苷酸，例如至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少500个核苷酸，至少1000个核苷酸，至少2000个核苷酸，或至少3000个核苷酸，例如100-500个核苷酸，500-1000个核苷酸，1000-2000个核苷酸，2000-3000个核苷酸，3000-5000个核苷酸或者5000-10000个核苷酸。优选所述小鼠il-17a基因上游和下游同源臂序列各自包含3000至5000个核苷酸。
97.在优选的实施方案中，所述重组载体中小鼠il-17a基因上游同源臂序列包含seq id no:5，且所述下游同源臂序列包含seq id no:6。
98.在另一个方面，本发明涉及一种重组载体，所述重组载体包含人il-17ra基因的编码序列或自2号外显子至11号外显子的序列和小鼠il-17ra基因上游和下游同源臂序列。
99.在一些实施方案中，所述人il-17ra基因的序列包含与seq id no:31或seq id no:35具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述人il-17ra基因的序列包含seq id no:31或seq id no:35或由seq id no:31或seq id no:35组成。
100.在一些实施方案中，所述小鼠il-17ra基因上游和下游同源臂序列各自包含至少100个核苷酸，例如至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少500个核苷酸，至少1000个核苷酸，至少2000个核苷酸，或至少3000个核苷酸，例如100-500个核苷酸，500-1000个核苷酸，1000-2000个核苷酸，2000-3000个核苷酸，3000-5000个核苷酸或者5000-10000个核苷酸。优选所述小鼠il-17ra基因上游和下游同源臂序列各自包含3000至5000个核苷酸。
101.在优选的实施方案中，所述重组载体中小鼠il-17ra基因上游同源臂序列包含seq id no:33，且所述下游同源臂序列包含seq id no:34。
102.在再一个方面，本发明涉及一种重组载体，所述重组载体包含人tnf-α基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列和小鼠tnf-α基因上游和下游同源臂序列。
103.在一些实施方案中，所述重组载体包含人tnf-α基因自起始密码子至终止密码子的序列和小鼠tnf-α基因上游和下游同源臂序列。
104.在一些实施方案中，所述人tnf-α基因的序列包含与seq id no:57或seq id no:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述人tnf-α基因的序列包含seq id no:57或seq id no:61，或由seq id no:57或seq id no:61组成。
105.在一些实施方案中，所述小鼠tnf-α基因上游和下游同源臂序列各自包含至少100个核苷酸，例如至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少500个核苷酸，至少1000个核苷
酸，至少2000个核苷酸，或至少3000个核苷酸，例如100-500个核苷酸，500-1000个核苷酸，1000-2000个核苷酸，2000-3000个核苷酸，3000-7000个核苷酸或者7000-10000个核苷酸。优选所述小鼠tnf-α基因上游和下游同源臂序列各自包含3000至7000个核苷酸。
106.在优选的实施方案中，所述小鼠tnf-α基因上游同源臂序列包含seq id no:59，且所述下游同源臂序列包含seq id no:60。
107.在关于重组载体的任何实施方案中，所述重组载体还可以包含用于阳性筛选的抗性基因。在一些实施方案中，所述抗性基因是新霉素磷酸转移酶的编码序列。
108.避免报告基因通常是有益的，因为不需要之后将其移除。但是在胚胎/细胞水平修饰阶段报告基因的表达允许对不表达所述报告基因的细胞的排除。或者，其允许挑选表达所述报告基因的细胞，通过克隆或其它转基因动物技术用于动物中，或者转移到第二个培养物中，用于进一步培养和/或数量扩增和/或增加其它载体和/或核酸和/或其它遗传修饰。基于其报告基因的表达来选择细胞是一种共选择方法，所述报告基因不依赖于感兴趣的基因。术语报告基因，如本文所使用的，包括报告基因和选择标记。术语选择标记，如本文所使用的，指代遗传表达的生物分子，其赋予通过阳性或阴性生存选择标准来允许分离的性状。所述报告基因可以是，例如荧光标记物，例如绿色荧光蛋白和黄色荧光蛋白。所述报告基因可以是选择标记物，例如嘌呤霉素、更昔洛韦、腺苷脱氨酶(ada)、氨基糖苷磷酸转移酶(neo、g418、aph)、二氢叶酸还原酶(dhfr)、潮霉素-b-磷酸转移酶、胸苷激酶(tk)，或黄嘌呤-鸟嘌林转磷酸核糖基酶(xgprt)。例如，可以从细胞培养物移出细胞并用于克隆。或者，可以从培养物中移出细胞并置于第二个培养物中，来建立克隆系或用于进一步的方法。或者，表达所述报告基因的胚胎或受精卵可以用于植入代孕动物或者用于克隆，而其它不表达所述报告基因的胚胎或受精卵不用于克隆。在一些实施方案中，所述报告基因是选择标记物，其用于选择表达所述标记物的细胞或胚胎。
109.在一些实施方案中，所述重组载体还包含用于负筛选的标记基因。在一些实施方案中，所述标记基因是白喉毒素a亚基的编码序列。
110.在关于重组载体的任何实施方案中，所述载体可以用于替换小鼠基因组中对应的内源性基因序列。
111.在再一个方面，本发明涉及本发明的重组载体在替换小鼠基因组中对应的内源性基因序列中的用途。
112.在另一个方面，本发明涉及本发明的重组载体在构建转基因小鼠或转基因小鼠细胞中的用途。
113.动物制备方法
114.在一个方面，本发明涉及一种制备包含人il-17a基因的序列的转基因非人动物的方法，所述方法包括在所述动物的基因组中插入人il-17a基因的序列。
115.在一些实施方案中，所述人il-17a基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
116.在一些时实施方案中，所述动物是啮齿类动物，例如小鼠。
117.在一些实施方案中，所述方法包括以下：
118.a.提供本发明的包含人il-17a基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列和小鼠il-17a基因上游和下游同源臂序列；
119.b1.将所述重组载体注射到小鼠的受精卵中；
120.c1.通过将所述受精卵移植到代孕母鼠中并繁殖从而获得所述转基因小鼠；或者
121.b2.将所述重组载体注射到小鼠的胚胎干细胞中；
122.c2.通过所述胚胎干细胞的克隆获得所述转基因小鼠。
123.从培养的细胞制造克隆细胞的集落的方法是已知的。一种此类方法涉及将来自第一个培养物的细胞分散到第二个培养物中，其中各个细胞不互相接触，例如，通过将细胞稀释到多孔板中，或稀释到对于铺到其中的细胞数，具有相对大表面积的板中。培养所述细胞一段时间，允许其增殖。增殖的细胞在它们不太可能移动到离它们原来的位置很远的条件下培养。作为结果，一段时间后使用者可以观察到细胞并看到由单个细胞及其后代建立的各个集落。可以对集落中细胞的子集取样，而不破坏所述集落中的其它细胞。
124.在一些实施方案中，步骤c2包括将所述胚胎干细胞导入分离的囊胚中，并将获得的嵌合囊胚移植到代孕母鼠中，通过繁殖获得所述转基因小鼠。
125.在一些实施方案中，所述方法还包括对所述代孕母鼠繁殖的后代进行检测以筛选其基因组中包含人il-17a基因序列的转基因小鼠的步骤。
126.在一些实施方案中，所述方法还包括通过所述转基因小鼠的杂交以获得对所述人il-17a基因的序列纯合的小鼠的步骤。
127.在另一个方面，本发明涉及一种制备包含人il-17ra基因的序列的转基因动物的方法，所述方法包括在所述动物的基因组中插入人il-17ra基因的序列。
128.在一些实施方案中，所述人il-17ra基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
129.在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
130.a.提供包含人il-17ra基因的编码序列或自2号外显子至11号外显子的序列和小鼠il-17ra基因上游和下游同源臂序列的重组载体；
131.b1.将所述重组载体注射到小鼠的受精卵中；
132.c1.通过将所述受精卵移植到代孕母鼠中并繁殖从而获得所述转基因小鼠；或者
133.b2.将所述重组载体注射到小鼠的胚胎干细胞中；
134.c2.通过所述胚胎干细胞的克隆获得所述转基因小鼠。
135.在一些实施方案中，步骤c2包括将所述胚胎干细胞导入分离的囊胚中，并将获得的嵌合囊胚移植到代孕母鼠中，通过繁殖获得所述转基因小鼠。
136.在一些实施方案中，所述方法还包括对所述代孕母鼠繁殖的后代进行检测以筛选其基因组中包含人il-17ra基因的序列的转基因小鼠的步骤。
137.在一些实施方案中，所述方法还包括通过所述转基因小鼠的杂交以获得对所述人il-17ra基因的序列纯合的小鼠的步骤。
138.在另一个方面，本发明涉及一种制备包含人tnf-α基因的序列的转基因非人动物的方法，所述方法包括在所述动物的基因组中插入人tnf-α基因的序列。
139.在一些实施方案中，所述人tnf-α基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
140.在一些实施方案中，所述方法包括一些步骤：
141.a.提供包含人tnf-α基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列和小鼠
tnf-α基因上游和下游同源臂序列的重组载体；
142.b1.将所述重组载体注射到小鼠的受精卵中；
143.c1.通过将所述受精卵移植到代孕母鼠中并繁殖从而获得所述转基因小鼠；或者
144.b2.将所述重组载体注射到小鼠的胚胎干细胞中；
145.c2.通过所述胚胎干细胞的克隆获得所述转基因小鼠。
146.在一些实施方案中，步骤c2包括将所述胚胎干细胞导入分离的囊胚中，并将获得的嵌合囊胚移植到代孕母鼠中，通过繁殖获得所述转基因小鼠。
147.在一些实施方案中，所述方法还包括对所述代孕母鼠繁殖的后代进行检测以筛选其基因组中包含人tnf-α基因的序列的转基因小鼠的步骤。
148.在一些实施方案中，所述方法还包括通过所述转基因小鼠的杂交以获得对所述人tnf-α基因的序列纯合的小鼠的步骤。
149.在上述方法的任何实施方案中，所述动物可以是啮齿类动物，例如大鼠或小鼠。在优选的实施方案中，所述动物是小鼠。
150.本发明还包括通过本发明的方法制备的备包含人il-17a基因的序列、人il-17ra基因的序列或人tnf-α基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠。
151.在另一个方面，本发明涉及制备包含人il-17a基因的序列和人il-17ra基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠的方法，所述方法包括将本发明的包含人il-17a基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠与包含人il-17ra基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠进行杂交的步骤。
152.在一个方面，本发明涉及制备包含il-17a基因的序列和人tnf-α基因序列的转基因非人动物例如转基因小鼠的方法，所述方法包括将本发明的包含人il-17a基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠与包含人tnf-α基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠进行杂交的步骤。
153.在另一个方面，本发明涉及制备包含il-17ra基因的序列和人tnf-α基因序列的转基因非人动物例如转基因小鼠的方法，所述方法包括将本发明的包含人il-17ra基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠与包含人tnf-α基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠进行杂交的步骤。
154.在再一个方面，本发明涉及制备包含人il-17a基因的序列、人il-17ra基因的序列和人tnf-α基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠的方法，所述方法包括将本发明的包含人il-17a基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠、本发明的包含人il-17ra基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠和包含人tnf-α基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠进行杂交的步骤。
155.在一个方面，本发明涉及一种制备包含人il-17a基因的序列和人il-17ra基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠的方法，所述方法包括：
156.a1.提供从本发明的包含人il-17a基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠获得的受精卵或胚胎干细胞；
157.b1.使用所述受精卵或胚胎干细胞，通过本发明的方法在所述转基因非人动物例如转基因小鼠的基因组中插入人il-17ra基因的序列，从而制备包含人il-17a基因的序列和人il-17ra基因的序列的转基因小鼠；或者
158.a2.提供从本发明的包含人il-17ra基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠获得的受精卵或胚胎干细胞；
159.b2.使用所述受精卵或胚胎干细胞，通过本发明的方法在所述转基因非人动物例如转基因小鼠的基因组中插入人il-17a基因的序列，从而制备包含人il-17a基因的序列和人il-17ra基因的序列的转基因小鼠。
160.在另一个方面，本发明涉及一种制备包含人il-17a基因的序列和人tnf-α基因的序列的转基因小鼠的方法，所述方法包括：
161.a1.提供从本发明的包含人il-17a基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠获得的受精卵或胚胎干细胞；
162.b1.使用所述受精卵或胚胎干细胞，通过本发明的方法在所述转基因非人动物例如转基因小鼠的基因组中插入人tnf-α基因的序列，从而制备包含人il-17a基因的序列和人人tnf-α基因的序列的转基因小鼠；或者
163.a2.提供从本发明的包含人tnf-α基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠获得的受精卵或胚胎干细胞；
164.b2.使用所述受精卵或胚胎干细胞，通过本发明的方法在所述转基因非人动物例如转基因小鼠的基因组中插入人il-17a基因的序列，从而制备包含人il-17a基因的序列和人tnf-α基因的序列的转基因小鼠。
165.在再一个方面，本发明涉及一种制备包含人il-17ra基因的序列和人tnf-α基因的序列的转基因小鼠的方法，所述方法包括：
166.a1.提供从本发明的包含人il-17ra基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠获得的受精卵或胚胎干细胞；
167.b1.使用所述受精卵或胚胎干细胞，通过本发明的方法在所述转基因非人动物例如转基因小鼠的基因组中插入人tnf-α基因的序列，从而制备包含人il-17ra基因的序列和人人tnf-α基因的序列的转基因小鼠；或者
168.a2.提供从本发明的包含人tnf-α基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠获得的受精卵或胚胎干细胞；
169.b2.使用所述受精卵或胚胎干细胞，通过本发明的方法在所述转基因非人动物例如转基因小鼠的基因组中插入人il-17ra基因的序列，从而制备包含人il-17ra基因的序列和人tnf-α基因的序列的转基因小鼠。
170.多肽和编码其的多核苷酸
171.在一个方面，本发明涉及一种多肽，所述多肽包含与seq id no:39所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含seq id no:39，或由seq id no:39组成。
172.在另一个方面，本发明涉及编码本发明的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含seq id no:38。
173.在再一个方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸的载体。
174.本发明包括以下实施方案：
175.实施方案1.一种转基因非人动物细胞，所述细胞的基因组中包含可表达形式的人
il-17a基因的序列，任选其中所述人il-17a基因的序列替换所述细胞的基因组中对应的内源性序列。
176.实施方案2.如实施方案1所述的细胞，其中所述细胞表达人il-17a蛋白，任选所述蛋白包含与seq id no:4具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含seq id no:4或由seq id no:4组成。
177.实施方案3.如实施方案1所述的细胞，其中所述人il-17a基因的序列包含人il-17a基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列。
178.实施方案4.如实施方案1所述的细胞，其中所述人il-17a基因的序列包含与seq id no:7具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含seq id no:7或由seq id no:7组成。
179.实施方案5.如实施方案1至3中任一项所述的细胞，其中所述细胞的基因组中还包含可表达形式的人il-17ra基因的序列和/或人tnf-α基因的序列，任选其中所述人il-17ra基因的序列和/或人tnf-α基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
180.实施方案6.如实施方案5所述的细胞，其中所述细胞表达人il-17ra蛋白或人源化il-17ra蛋白，和/或人tnf-α蛋白，任选其中所述人il-17ra包含与seq id no:32具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含seq id no:32或由seq id no:32组成；
181.所述人源化il-17ra蛋白包含与seq id no:32第49-341位所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含seq id no:32第49-341位所示的氨基酸序列；或
182.所述人源化il-17ra蛋白包含与seq id no:39具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含seq id no:39或由seq id no:39组成；和
183.和/或所述人tnf-α蛋白包含与seq id no:58具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含seq id no:58或由seq id no:58组成。
184.实施方案7.如实施方案5所述的细胞，其中所述人il-17ra基因的序列包含人il-17ra基因自2号外显子至11号外显子的序列。
185.实施方案8.如实施方案5所述的细胞，其中所述人il-17ra基因的序列包含与seq id no:35具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或所述人il-17ra基因的序列包含seq id no:35或由seq id no:35组成。
186.实施方案9.如实施方案5所述的细胞，其中所述人tnf-α基因的序列包含人tnf-α基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列。
187.实施方案10.如实施方案5所述的细胞，其中所述人tnf-α基因的序列包含与seq id no:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含seq id no:61，或由seq id no:61组成。
188.实施方案11.一种转基因非人动物细胞，所述细胞的基因组中包含可表达形式的人il-17ra基因的序列，任选其中所述人il-17ra基因的序列替换所述动物的基因组中对应
的内源性序列。
189.实施方案12.如实施方案11所述的细胞，其中所述人il-17ra基因的序列包含与seq id no:35具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含seq id no:35或由seq id no:35组成。
190.实施方案13.如实施方案11或12所述的细胞，其中所述细胞的基因组中还包含可表达形式的人tnf-α基因的序列，其中所述人tnf-α基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
191.实施方案14.如实施方案13所述的细胞，其中所述人tnf-α基因的序列包含人tnf-α基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列。
192.实施方案15.如实施方案13所述的细胞，其中所述人tnf-α基因的序列包含与seq id no:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含seq id no:61，或由seq id no:61组成。
193.实施方案16.如实施方案1至15中任一项所述的细胞，其中所述转基因非人动物细胞是转基因啮齿类动物细胞或转基因小鼠细胞。
194.实施方案17.如实施方案1至16中任一项所述的细胞，其中所述细胞选自体细胞和干细胞例如胚胎干细胞。
195.实施方案18.如或实施方案1至17中任一项所述的细胞在筛选调节il-17a/il-17-ra信号通路的试剂中的用途，任选地所述试剂选自抗体、抗体片段、对应受体或配体或其片段、融合蛋白和小分子化合物。
196.实施方案19.转基因非人动物在构建与il-17a/il-17ra信号通路异常相关的疾病模型中的用途，其中转基因非人动物的基因组中包含可表达形式的人il-17a基因的序列，任选其中所述人il-17a基因的序列替换所述细胞的基因组中对应的内源性序列，优选所述转基因非人动物是转基因啮齿类动物，例如转基因小鼠。
197.实施方案20.如实施方案19所述的用途，其中所述疾病选自自身免疫病和肿瘤，任选所述自身免疫病选自多发性硬化症、哮喘、炎症性肠病、银屑病、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、白塞病、系统性红斑狼疮、原发性干燥综合征、心肌炎、i型糖尿病、甲状腺炎、特异性皮炎、超敏反应、移植物抗宿主病。
198.实施方案21.转基因非人动物在测试针对人il-17a的试剂的体内药效中的用途，其中所述转基因非人动物的基因组中包含可表达形式的人il-17a基因的序列，任选其中所述人il-17a基因的序列替换所述细胞的基因组中对应的内源性序列，优选所述转基因非人动物是转基因啮齿类动物，例如转基因小鼠。
199.实施方案22.如实施方案21所述的用途，其中所述试剂选自针对人il-17a的抗体或抗体片段，或小分子拮抗剂。
200.实施方案23.如实施方案21或22所述的用途，其中所述转基因非人动物用于构建与il-17a信号通路异常相关的疾病模型，并在所述疾病模型中测试所述试剂的体内药效。
201.实施方案24.如实施方案23所述的用途，其中所述疾病模型是自身免疫病模型，例如选自自身免疫病模型选自实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)和银屑病模型，例如所述银屑病模型是咪喹莫特诱导的银屑病模型。
202.实施方案25.一种测试针对人il-17a的试剂的体内药效的方法，所述方法包括：
203.a.使用转基因非人动物构建与il-17a信号通路异常相关的疾病模型，其中所述转基因非人动物的基因组中包含可表达形式的人il-17a基因的序列，任选其中所述人il-17a基因的序列替换所述细胞的基因组中对应的内源性序列；
204.b.对所述疾病模型动物施用所述针对人il-17a的试剂；和
205.c.评估所述针对il-17a的试剂的体内药效，
206.优选所述转基因非人动物是转基因啮齿类动物，例如转基因小鼠。
207.实施方案26.如实施方案25所述的方法，其中所述试剂选自针对人il-17a的抗体或抗体片段，或小分子拮抗剂。
208.实施方案27.如实施方案25或26所述的方法，其中所述疾病模型是自身免疫病模型，例如选自实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)和银屑病模型，例如所述银屑病模型是咪喹莫特诱导的银屑病模型。
209.实施方案28.如实施方案19-24中任一项所述的用途，或如实施方案25-27中任一项所述的方法，其中所述转基因非人动物表达人il-17a蛋白，任选所述蛋白包含与seq id no:4具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含seq id no:4或由seq id no:4组成。
210.实施方案29.如实施方案19-24中任一项所述的用途，或如实施方案25-27中任一项所述的方法，其中所述人il-17a基因的序列包含人il-17a基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列。
211.实施方案30.如实施方案19-24中任一项所述的用途，或如实施方案25-27中任一项所述的方法，其中所述人il-17a基因的序列包含与seq id no:7具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含seq id no:7或由seq id no:7组成。
212.实施方案31.如实施方案29或30所述的方法或用途，其中所述转基因非人动物的基因组中还包含可表达形式的人il-17ra基因的序列和/或人tnf-α基因的序列，任选其中所述人il-17ra基因的序列和/或人tnf-α基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
213.实施方案32.如实施方案31所述的方法或用途，其中所述转基因非人动物表达人il-17ra蛋白或人源化il-17ra蛋白，和/或人tnf-α蛋白，任选其中所述人il-17ra包含与seq id no:32具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含seq id no:32或由seq id no:32组成；
214.所述人源化il-17ra蛋白包含与seq id no:32第49-341位所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含seq id no:32第49-341位所示的氨基酸序列；或
215.所述人源化il-17ra蛋白包含与seq id no:39具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含seq id no:39或由seq id no:39组成；和
216.和/或所述人tnf-α蛋白包含与seq id no:58具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含seq id no:58或由seq id no:58组成。
217.实施方案33.如实施方案31所述的方法或用途，其中所述人il-17ra基因的序列包含人il-17ra基因自2号外显子至11号外显子的全部或部分序列。
218.实施方案34.如实施方案31所述的方法或用途，其中所述人il-17ra基因的序列包含与seq id no:35具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或所述人il-17ra基因的序列包含seq id no:35或由seq id no:35组成。
219.实施方案35.如实施方案31所述的方法或用途，其中所述人tnf-α基因的序列包含人tnf-α基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列。
220.实施方案36.如实施方案31所述的方法或用途，其中所述人tnf-α基因的序列包含与seq id no:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含seq id no:61，或由seq id no:61组成
221.实施方案37.一种重组载体，所述载体包含人il-17a基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列和小鼠il-17a基因上游和下游同源臂序列。
222.实施方案38.如实施方案37所述的重组载体，其中所述人il-17a基因的序列包含与seq id no:7具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含seq id no:7或由seq id no:7组成。
223.实施方案39.如实施方案37或38所述的重组载体，其中所述小鼠il-17a基因上游和下游同源臂序列各自包含至少100个核苷酸，例如至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少500个核苷酸，至少1000个核苷酸，至少2000个核苷酸，或至少3000个核苷酸，例如100-500个核苷酸，500-1000个核苷酸，1000-2000个核苷酸，2000-3000个核苷酸，3000-5000个核苷酸或者5000-10000个核苷酸，优选所述小鼠il-17a基因上游和下游同源臂序列各自包含3000-5000个核苷酸。
224.实施方案40.如实施方案37或38所述的重组载体，其中所述小鼠il-17a基因上游同源臂序列包含seq id no:5，且所述下游同源臂序列包含seq id no:6。
225.实施方案41.一种重组载体，所述重组载体包含人il-17ra基因的编码序列或自2号外显子至11号外显子的序列和小鼠il-17ra基因上游和下游同源臂序列。
226.实施方案42.如实施方案41所述的重组载体，其中所述人il-17ra基因的序列包含与seq id no:35具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含seq id no:35或由seq id no:35组成。
227.实施方案43.如实施方案41或42所述的重组载体，其中所述小鼠il-17ra基因上游和下游同源臂序列各自包含至少100个核苷酸，例如至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少500个核苷酸，至少1000个核苷酸，至少2000个核苷酸，或至少3000个核苷酸，例如100-500个核苷酸，500-1000个核苷酸，1000-2000个核苷酸，2000-3000个核苷酸，3000-5000个核苷酸或者5000-10000个核苷酸，优选所述小鼠il-17ra基因上游和下游同源臂序列各自包含3000-5000个核苷酸。
228.实施方案44.如实施方案41或42所述的重组载体，其中所述小鼠il-17ra基因上游同源臂序列包含seq id no:33，且所述下游同源臂序列包含seq id no:34。
229.实施方案45.一种重组载体，所述重组载体包含人tnf-α基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列和小鼠tnf-α基因上游和下游同源臂序列。
230.实施方案46.如实施方案45所述的重组载体，其中所述人tnf-α基因的序列包含与seq id no:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含seq id no:61，或由seq id no:61组成。
231.实施方案47.如实施方案45或46所述的重组载体，其中所述小鼠tnf-α基因上游和下游同源臂序列各自包含至少100个核苷酸，例如至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少500个核苷酸，至少1000个核苷酸，至少2000个核苷酸，或至少3000个核苷酸，例如100-500个核苷酸，500-1000个核苷酸，1000-2000个核苷酸，2000-3000个核苷酸，3000-7000个核苷酸或者7000-10000个核苷酸，优选所述小鼠tnf-α基因上游和下游同源臂序列各自包含3000-7000个核苷酸。
232.实施方案48.如实施方案45或46所述的重组载体，其中所述小鼠tnf-α基因上游同源臂序列包含seq id no:59，且所述下游同源臂序列包含seq id no:60。
233.实施方案49.如实施方案37至48中任一项所述的重组载体，其中所述重组载体还包含用于阳性筛选的抗性基因，例如所述抗性基因是新霉素磷酸转移酶的编码序列。
234.实施方案50.如实施方案37至49中任一项所述的重组载体，其中所述重组载体还包含用于负筛选的标记基因，其中所述标记基因是白喉毒素a亚基的编码序列。
235.实施方案51.如实施方案37至50中任一项所述的重组载体，所述载体用于替换小鼠基因组中对应的内源性基因序列。
236.实施方案52.如实施方案37至50中任一项所述的重组载体在替换小鼠基因组中对应的内源性基因序列中的用途。
237.实施方案53.如实施方案37至50中任一项所述的重组载体在构建转基因小鼠或转基因小鼠细胞中的用途。
238.实施方案54.一种制备包含人il-17a基因的序列的转基因非人动物的方法，所述方法包括在所述动物的基因组中插入人il-17a基因的序列，任选其中所述人il-17a基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
239.实施方案55.如实施方案54所述的方法，其中所述动物是啮齿类动物，例如小鼠。
240.实施方案56.如实施方案55所述的方法，其中所述方法包括：
241.a.提供如实施方案37至40中任一项所述的重组载体；
242.b1.将所述重组载体注射到小鼠的受精卵中；
243.c1.通过将所述受精卵移植到代孕母鼠中并繁殖从而获得所述转基因小鼠；或者
244.b2.将所述重组载体注射到小鼠的胚胎干细胞中；
245.c2.通过所述胚胎干细胞的克隆获得所述转基因小鼠，任选其中将所述胚胎干细胞导入分离的囊胚中，并将获得的嵌合囊胚移植到代孕母鼠中，通过繁殖获得所述转基因小鼠。
246.实施方案57.如实施方案56所述的方法，其中所述方法还包括对所述代孕母鼠繁殖的后代进行检测以筛选其基因组中包含人il-17a基因序列的转基因小鼠的步骤。
247.实施方案58.如实施方案56或57所述的方法，其中所述方法还包括通过所述转基因小鼠的杂交以获得对所述人il-17a基因的序列纯合的小鼠的步骤。
248.实施方案59.一种制备包含人il-17ra基因的序列的转基因动物的方法，所述方法包括在所述动物的基因组中插入人il-17ra基因的序列，任选其中所述人il-17ra基因的序
列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
249.实施方案60.如实施方案59所述的方法，其中所述动物是啮齿类动物，例如小鼠。
250.实施方案61.如实施方案60所述的方法，其中所述方法包括：
251.a.提供如实施方案41至44中任一项所述的重组载体；
252.b1.将所述重组载体注射到小鼠的受精卵中；
253.c1.通过将所述受精卵移植到代孕母鼠中并繁殖从而获得所述转基因小鼠；或者
254.b2.将所述重组载体注射到小鼠的胚胎干细胞中；
255.c2.通过所述胚胎干细胞的克隆获得所述转基因小鼠，任选其中将所述胚胎干细胞导入分离的囊胚中，并将获得的嵌合囊胚移植到代孕母鼠中，通过繁殖获得所述转基因小鼠。
256.实施方案62.如实施方案61所述的方法，其中所述方法还包括对所述代孕母鼠繁殖的后代进行检测以筛选其基因组中包含人il-17ra基因的序列的转基因小鼠的步骤。
257.实施方案63.如实施方案61或62所述的方法，其中所述方法还包括通过所述转基因小鼠的杂交以获得对所述人il-17ra基因的序列纯合的小鼠的步骤。
258.实施方案64.一种制备包含人tnf-α基因的序列的转基因非人动物的方法，所述方法包括在所述动物的基因组中插入人tnf-α基因的序列，任选其中所述人tnf-α基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
259.实施方案65.如实施方案64所述的方法，其中所述动物是啮齿类动物，例如小鼠。
260.实施方案66.如实施方案67所述的方法，其中所述方法包括：
261.a.提供如实施方案45至48中任一项所述的重组载体；
262.b1.将所述重组载体注射到小鼠的受精卵中；
263.c1.通过将所述受精卵移植到代孕母鼠中并繁殖从而获得所述转基因小鼠；或者
264.b2.将所述重组载体注射到小鼠的胚胎干细胞中；
265.c2.通过所述胚胎干细胞的克隆获得所述转基因小鼠，任选其中将所述胚胎干细胞导入分离的囊胚中，并将获得的嵌合囊胚移植到代孕母鼠中，通过繁殖获得所述转基因小鼠。
266.实施方案67.如实施方案66所述的方法，其中所述方法还包括对所述代孕母鼠繁殖的后代进行检测以筛选其基因组中包含人tnf-α基因的序列的转基因小鼠的步骤。
267.实施方案68.如实施方案66或67中所述的方法，其中所述方法还包括通过所述转基因小鼠的杂交以获得对所述人tnf-α基因的序列纯合的小鼠的步骤。
268.实施方案69.一种制备包含人il-17a基因的序列和人il-17ra基因的序列的转基因小鼠的方法，所述方法包括将通过实施方案54-58中任一项所述的方法获得的转基因小鼠与通过实施方案59-63中任一项的方法获得的转基因小鼠进行杂交的步骤。
269.实施方案70.一种制备包含人il-17a基因的序列和人tnf-α基因的序列的转基因小鼠的方法，所述方法包括将通过实施方案54-58中任一项所述的方法获得的转基因小鼠与通过实施方案64-68中任一项的方法获得的转基因小鼠进行杂交的步骤。
270.实施方案71.一种制备包含人il-17ra基因的序列和人tnf-α基因序列的转基因小鼠的方法，所述方法包括将通过实施方案59-63中任一项所述的方法获得的转基因小鼠与通过实施方案64-68中任一项的方法获得的转基因小鼠进行杂交的步骤。
271.实施方案72.一种制备包含人il-17a基因的序列、人il-17ra基因的序列和人tnf-α基因的序列的转基因小鼠的方法，所述方法包括将通过实施方案54-58中任一项所述的方法获得的转基因小鼠、通过实施方案64-68中任一项的方法获得的转基因小鼠和通过实施方案64-68中任一项的方法获得的转基因小鼠进行杂交的步骤。
272.实施方案73.一种多肽，所述多肽包含与seq id no:39所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或所述多肽包含seq id no:39，或由seq id no:39组成；或
273.所述多肽是人源化il-17ra蛋白，所述人源化il-17ra蛋白包含与seq id no:32第49-341位所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含seq id no:32第49-341位所示的氨基酸序列。
274.实施方案74.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码实施方案73所述的多肽。
275.实施方案75.如实施方案74所述的多核苷酸，所述多核苷酸包含seq id no:38。
276.实施方案76.一种载体，所述载体包含实施方案74或75所述的多核苷酸。实施方案77.一种嵌合il17-ra基因，其中所述嵌合il-17ra基因包含部分人il-17ra基因序列和部分非人动物il-17ra基因序列，优选的所述部分人il17ra基因序列的全部或部分与seq id no:35、seq id no:36或seq id no:37具有至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％一致性，更优选的所述部分人il17ra基因序列为seq id no:35。
277.实施方案78.一种嵌合tnf-α基因，其中所述嵌合tnf-α基因包含部分人tnf-α基因序列和部分非人动物tnf-α基因序列，优选的所述部分人tnf-α基因序列与seq id no:61具有至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％一致性，更优选的所述部分人tnf-α基因序列为seq id no:61。
278.实施方案79.一种嵌合il-17a基因，其中所述嵌合il-17a基因包含部分人il-17a基因序列和部分非人动物il-17a基因序列，优选的所述部分人il-17a基因序列的全部或部分与seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9具有至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％一致性，更优选的所述部分人il-17a基因序列为seq id no:7。
附图说明
279.以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
280.图1：小鼠和人il-17a基因对比示意图(非按比例)。
281.图2：人源化小鼠il-17a基因示意图(非按比例)。
282.图3：使用包含人il-17a基因序列的重组载体替换小鼠内源性il-17a基因序列的打靶策略示意图(非按比例)。
283.图4：来自不同阳性克隆细胞的southernblot结果，其中wt为野生型对照。
284.图5：frt重组过程示意图(非按比例)。
285.图6：f1代鼠尾pcr鉴定结果，其中，图(a)使用引物对wt-f和wt-r用于扩增小鼠内源的野生型il-17a基因片段；图(b)使用引物对wt-f和mut-r用于扩增修饰后的il-17a基因片段，用以验证重组载体是否正确插入小鼠基因组位点；图(c)使用引物对frt-f和frt-r用以扩增neo片段以验证抗性基因是否去除；图(d)使用引物对flp-f2和flp-r2用以确认flp
片段的存在；其中，wt为野生型小鼠，m为marker，pc为阳性对照。
286.图7：人il-17a的elisa检测结果。
287.图8：小鼠和人il-17ra基因对比示意图(非按比例)。
288.图9：人源化小鼠il-17ra基因示意图(非按比例)。
289.图10：使用包含人il-17ra基因序列的重组载体替换小鼠内源性il-17ra基因序列的打靶策略示意图(非按比例)。
290.图11：来自不同阳性克隆细胞的southernblot结果，其中wt为野生型对照。
291.图12：f1代鼠尾pcr鉴定结果，其中，图(a)使用引物对wt-f和wt-r用于扩增小鼠内源的野生型il-17ra基因片段；图(b)使用引物对wt-f和mut-r用于扩增修饰后的il-17ra基因片段，用以验证重组载体是否正确插入小鼠基因组位点；图(c)使用引物对frt-f和frt-r用以扩增neo片段以验证抗性片段是否去除；图(d)使用引物对flp-f2和flp-r2用以确认flp片段的存在；其中，wt为野生型，m为marker，pc为阳性对照。
292.图13：流式分析结果，其中，图(a)、(c)为c57bl/6野生型鼠的结果，图(b)、(d)为il-17ra人源化转基因小鼠的结果，分别使用mil-17ra pe(图(a)、(c))或hil-17ra pe(图(b)、(d))和mgr1 percp进行细胞标记。
293.图14：f1代鼠尾pcr鉴定结果，其中，图(a)使用引物对wt-f和wt-r用于扩增小鼠内源的野生型tnf-α基因片段；图(b)使用引物对neo-f和wt-r用于扩增修饰后的tnf-α基因片段，用以验证neo片段是否存在并正确插入基因组位点；其中，wt为野生型，m为marker，+为阳性对照。
294.图15：使用il-17a基因人源化小鼠纯合子，在mog诱导的eae模型和对照组(未诱导)中小鼠的体重随时间变化的曲线图。g1、g3为对照组；g2、g4为eae模型组。
295.图16：使用il-17a基因人源化小鼠纯合子，在mog诱导的eae模型和对照组中小鼠的临床评分随时间变化的曲线图。g1、g3为对照组；g2、g4为eae模型组。
296.图17：使用il-17a基因人源化小鼠纯合子，在mog诱导的eae模型和对照组中在诱导后第45天小鼠脊髓组织切片的he染色结果(100x)。g1为对照组，g2为eae模型组。
297.图18：使用il-17a基因人源化小鼠纯合子，在mog诱导的eae模型和对照组中在诱导后第45天小鼠脊髓组织切片的免疫组化染色结果(100x)。绿色：mbp；蓝色：dapi。g1为对照组，g2为eae模型组。
298.图19：使用il-17a基因人源化小鼠纯合子，在mog诱导的eae模型和对照组中在诱导后第45天取小鼠淋巴结体外诱导，检测il-17和ifnγ的示例性facs结果。图a显示了来自对照组g1的一只小鼠的结果，图b显示了来自模型组g2的一只小鼠的结果。
299.图20：使用il-17a基因人源化小鼠纯合子，在mog诱导的eae模型中评估抗人il-17a抗体的药效的实验流程图。
300.图21：使用il-17a基因人源化小鼠纯合子，在mog诱导的eae模型中抗人il-17抗体给药组和对照组(pbs)小鼠的体重统计图。
301.图22：使用il-17a基因人源化小鼠纯合子，在mog诱导的eae模型中抗人il-17a抗体给药组和对照组小鼠临床评分统计图。
302.图23：使用il-17a基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中评估抗人il-17a抗体的药效的实验流程图。
303.图24：使用il-17a基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中对照组(g1)、模型组(g2)和抗人il-17a抗体给药组(g3)小鼠的体重统计图。
304.图25：使用il-17a基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中对照组(g1)、模型组(g2)和抗人il-17a抗体给药组(g3)小鼠的银屑病样皮损处红斑(erythema)评分统计图。
305.图26：使用il-17a基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中对照组(g1)、模型组(g2)和抗人il-17a抗体给药组(g3)小鼠的银屑病样鳞屑(scales)评分统计图。
306.图27：使用il-17a基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中对照组(g1)、模型组(g2)和抗人il-17a抗体给药组(g3)小鼠的pasi综合评分统计图。
307.图28：使用il-17a基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型对照组(g1)、模型组(g2)和抗人il-17a抗体给药组(g3)小鼠的背部组织切片的he染色结果。
308.图29：使用il-17a基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型对照组(g1)、模型组(g2)和抗人il-17a抗体给药组(g3)小鼠的背部组织表皮厚度统计图。
309.图30：使用il-17a基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型对照组(g1)、模型组(g2)和抗人il-17a抗体给药组(g3)小鼠的背部组织切片的病理学评分统计图。
310.图31：使用il-17a基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中评估不同剂量的抗人il-17a抗体的药效的实验流程图。
311.图32：使用il-17a基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中空白对照组(g1)、nacl对照组(g2)、igg4同型对照组(g3)和不同浓度的抗人il-17a抗体给药组(g4-g6)小鼠的体重统计图。
312.图33：使用il-17a基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中空白对照组(g1)、nacl对照组(g2)、igg4同型对照组(g3)和不同浓度的抗人il-17a抗体给药组(g4-g6)小鼠的银屑病样皮损处红斑评分统计图。
313.图34：使用il-17a基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中空白对照组(g1)、nacl对照组(g2)、igg4同型对照组(g3)和不同浓度的抗人il-17a抗体给药组(g4-g6)小鼠的银屑病样鳞屑评分统计图。
314.图35：使用il-17a基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中空白对照组(g1)、nacl对照组(g2)、igg4同型对照组(g3)和不同浓度的抗人il-17a抗体给药组(g4-g6)小鼠的pasi综合评分统计图。
315.图36：使用il-17a基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中空白对照组(g1)、nacl对照组(g2)、igg4同型对照组(g3)和不同浓度的抗人il-17a抗体给药组(g4-g6)小鼠的背部组织表皮厚度统计图。
316.图37：使用il-17a基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中空白对照组(g1)、nacl对照组(g2)、igg4同型对照组(g3)和不同浓度的抗人il-17a抗体给药组(g4-g6)小鼠的病理学评分统计图。
17a基因座上用人il-17a基因的序列替换特定小鼠il-17a基因序列，如将至少包含小鼠il-17a基因的起始密码子atg至终止密码子taa的约2.9kb(2898bp)的序列用对应的人dna序列替换，得到人源化il-17a基因座(示意图如图2所示)，实现对小鼠il-17a基因的人源化改造。
341.分别用细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，bac)获得小鼠和人il-17a基因的dna序列。在如图3所示的打靶策略示意图中，显示了重组载体上上游和下游的同源臂序列分别为3708bp和4765bp，以及2861bp人il-17a基因的序列(从外显子1中的atg延伸至外显子3中的终止密码子taa)。其中，上述上游同源臂序列(5’同源臂，seq id no：5)与ncbi登录号为nc_000067.6的第20727254-20730961位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，seq id no：6)与ncbi登录号为nc_000067.6的第20735137-20739901位核苷酸序列相同；人il-17a基因的序列(seq id no：7)与ncbi登录号为nc_000006.12的第52186432-52189292位核苷酸序列相同。其中，人il-17a基因的序列和鼠基因座的上游连接设计为在5
’‑
gcacccagcaccagctgatcaggacgcgcaaacatgactcctgggaagacctcattggtg-3’(seq id no：8)内，其中序列“caaac”的最后一个“c”是小鼠序列的最后一个核苷酸，序列“atgac”的第一个“a”是人序列的第一个核苷酸；人il-17a基因的序列和鼠基因座的下游连接设计为在5
’‑
cgattgtccaccatgtggcctaaacagagacccgcggctgacccctaaga-3’(seq id no：9)内，其中序列“cctaa”的最后一个“a”是人序列的最后一个核苷酸，序列“acaga”的第一个“a”是小鼠序列的第一个核苷酸。改造后的人源化小鼠il-17a的mrna序列及其编码的蛋白序列分别如seq id no：66和seq id no：4所示。
342.此外，打靶载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列neo，并在抗性基因的两侧具有两个同向排列的位点特异性重组系统frt重组位点，组成neo盒。其中neo盒5’端与小鼠基因座的连接设计为5
’‑
ccggtggacacatctggagtacagcgtctgcgtcgacggtatcgataagcttgatatcgaattccgaagttcctattctctag-3’(seq id no：10)内，其中序列“tctgc”的最后一个“c”是小鼠序列的最后一个核苷酸，序列“gtcga”的第一个“g”是neo盒的第一个核苷酸。neo盒3’端与小鼠基因座的接合设计为5
’‑
agtataggaacttcatcagtcaggtacataatggtggatccactagtatctgtagctcggggaacatcatgagagaggagc-3’(seq id no：11)内，其中序列“ctagt”的最后一个“t”是neo盒的最后一个核苷酸，序列“atctg”的“a”是小鼠序列的第一个核苷酸。此外，还在重组载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因，即白喉毒素a亚基的编码基因(dta)。
343.载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的重组载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的重组载体电穿孔转染入c57bl/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用pcr和southern blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞。经pcr鉴定为阳性的克隆(pcr结果未显示)再进行southern blot(分别用ecorv或spei或saci消化细胞dna并使用3个探针进行杂交)检测，结果见如图4所示，检测结果表明8个经pcr验证为阳性的克隆中，有6个克隆(1-a10，1-b7，1-c10，2-g3，2-h5，2-h12)为阳性杂合克隆且无随机插入。
344.pcr测定包括使用下述引物：
345.f1：5
’‑
cttctgatacatatgcatccacgtgc-3’(seq id no：12)
346.r1：5
’‑
atgcccacggtccagaaatactat-3’(seq id no：13)
347.f2：5
’‑
gctcgactagagcttgcgga-3’(seq id no：14)
348.r2：5
’‑
gtgagagcagcaagtgctcttaacc-3’(seq id no：15)
349.southern blot检测包括如下探针引物：
[0350]5’
探针(5’probe)：
[0351]
f：5
’‑
agagcagcataccaattagcaacat-3’(seq id no：16)
[0352]
r：5
’‑
ctaggtgggttcctcactggtct-3’(seq id no：17)
[0353]3’
探针(3’probe)：
[0354]
f：5
’‑
accaaaggaacaagtggaaagaatcgg-3’(seq id no：18)
[0355]
r：5
’‑
atcttcctgcccagcattgcct-3’(seq id no：19)
[0356]
neo探针(neo probe)：
[0357]
f：5
’‑
ggatcggccattgaacaagatgg-3’(seq id no：20)
[0358]
r：5
’‑
cagaagaactcgtcaagaaggcg-3’(seq id no：21)
[0359]
按照本领域已知的技术将筛选出的阳性克隆细胞(黑色鼠)导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产f0代嵌合体鼠(黑白相间)。将f0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得f1代鼠，再将f1代杂合小鼠互相交配即可获得f2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图5)后，再通过互相交配即可得到表达人il-17a蛋白的il-17a基因人源化纯合子小鼠。可通过pcr鉴定子代小鼠体细胞的基因型，示例性的f1代小鼠(已去除neo标记基因)的鉴定结果见图6，其中，编号为f1-2、f1-5、f1-7、f1-21、f1-26的小鼠为阳性杂合小鼠。pcr测定包括下述引物：
[0360]
wt-f：5
’‑
tctctgttcagctcccaagaagtca-3’(seq id no：22)
[0361]
wt-r：5
’‑
ctcattgcatagcgtcatgtgaca-3’(seq id no：23)
[0362]
wt-f：(seq id no：22)
[0363]
mut-r：5
’‑
atgcccacggtccagaaatactat-3’(seq id no：24)
[0364]
frt-f：5
’‑
gaatgtagctagcctgtgcaagga-3’(seq id no：25)
[0365]
frt-r：5
’‑
cagcagacttcctgttgttctgctc-3’(seq id no：26)
[0366]
flp-f2：5
’‑
gacaagcgttagtaggcacatatac-3’(seq id no：27)
[0367]
flp-r2：5
’‑
gctccaatttcccacaacattagt-3’(seq id no：28)
[0368]
通过本方法，能构建了可稳定传代且无随机插入的il-17a基因人源化的转基因小鼠。
[0369]
可通过常规检测方法确认获得的阳性小鼠体内人il-17a蛋白的表达情况，例如使用elisa方法，选取野生型c57bl/6小鼠和il-17a基因人源化小鼠杂合子各1只，先给小鼠腹腔注射7.5μg抗鼠cd3抗体(mcd3)和4μg抗鼠cd28抗体(mcd28)，2h后取血清，稀释2倍后检测人il-17a蛋白水平。检测结果(见图7)显示，在野生型c57bl/6小鼠体内未检测到人或人源化il-17a蛋白的表达，在il-17a基因人源化小鼠杂合子体内可检测到人il-17a蛋白的表达。实施例2il-17ra基因人源化小鼠
[0370]
小鼠il-17ra基因(ncbi gene id：16172，primary source：mgi：107399，uniprot id：q60943，位于6号染色体nc_000072.6的第120463181至120483731位，基于转录本nm_
008359.2(seq id no：29)及其编码蛋白np_032385.1(seq id no：30))和人il-17ra基因(ncbi gene id：23765，primary source：hgnc:5985，uniprot id：q96f46，位于22号染色体nc_000022.11的第17084959至17115694位，基于转录本nm_014339.6(seq id no：31)及其编码蛋白np_055154.3(seq id no：32))对比示意图如图8所示。
[0371]
为了达到本发明的目的，可在小鼠内源il-17ra基因座的胞外区引入编码人il-17ra蛋白的基因序列，使得该小鼠表达人或人源化的il-17ra蛋白。具体而言，用基因编辑技术对小鼠细胞进行修饰，在小鼠内源il-17ra基因座上用人il-17ra基因的序列替换特定小鼠il-17ra基因序列。在小鼠il-17ra基因调节元件的控制下，如将至少包含小鼠il-17ra基因的2号至11号外显子约8.9kb的序列用对应的人基因序列替换，得到小鼠人源化il-17ra基因座，示意图如图9所示。
[0372]
进一步的，设计如图10所示的打靶策略。分别用细菌人工染色体(bac)获得小鼠和人il-17ra基因的dna序列。其中图10所示的打靶载体上含有5’同源臂(seq id no：33)、3’同源臂(seq id no：34)以及人il-17ra基因片段(seq id no：35)，其中5’同源臂与ncbi登录号与nc_000072.6的第120467551-120472097位核苷酸序列相同；3’同源臂与ncbi登录号与nc_000072.6的第120478869-120482476位核苷酸序列相同；人il-17ra基因片段与ncbi登录号与nc_000022.11的第17097068-17105932位核苷酸序列相同。其中，人il-17ra基因的序列和鼠基因座的上游连接设计为5
’‑
cttcctttcttcccacaggggctgaactgcacggtcaagaatagtaagtc-3’(seq id no：36)内，其中序列“ggctg”的最后一个“g”是小鼠序列的最后一个核苷酸，序列“aactg”的第一个“a”是人序列的第一个核苷酸；人il-17ra基因的序列和鼠基因座的下游连接设计为5
’‑
tggtgggctccgtcatcctgctcatcgtctgtatgacctggaggctttctggtaaggact-3’(seq id no：37)，其中序列“tcgtc”的最后一个“c”是人序列的最后一个核苷酸，序列“tgtat”的第一个“t”是小鼠序列的第一个核苷酸。改造后的人源化小鼠il-17ra的mrna序列及其编码的蛋白序列分别如seq id no：38和seq id no：39所示。
[0373]
打靶载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列neo，并在抗性基因的两侧具有两个同向排列的位点特异性重组系统frt重组位点，组成neo盒(neo cassette)。其中neo盒5’端与小鼠il-17ra基因座的连接设计为5
’‑
aggagcagaccctgaactcacaagggaagaccctcactcgatatcgaattccgaagttcctattctctagaaagtatagg-3’(seq id no：40)内，其中序列“cactc”的最后一个“c”是鼠的最后一个核苷酸，序列“gatat”的“g”是neo盒的第一个核苷酸。neo盒3’端与小鼠il-17ra基因座的连接设计为5
’‑
gtataggaacttcatcagtcaggtacataatggtggatcccaattgtccaccagctttgtagtcacaggagacctaatct-3’(seq id no：41)内，其中序列“aattg”的“g”是neo盒的最后一个核苷酸，序列“tccac”的“t”是小鼠序列的第一个核苷酸。此外，还在重组载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因，即白喉毒素a亚基的编码基因(dta)。
[0374]
打靶载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。构建好的重组载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的重组载体电穿孔转染入c57bl/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用pcr和southern blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞。经pcr鉴定为阳性的克隆再进行southern blot(分别用psti或mfei或sspi消化细胞dna并使用3个探针进行杂交)检测，southern blot结果见如图11所示，检测结果表
明pcr鉴定为阳性的12个克隆(1-a02、1-b07、1-d07、1-e05、1-f05、1-g06、2-a09、2-a10、2-d03、2-e06、2-f07、2-g10)均确定为阳性杂合克隆且无随机插入。
[0375]
pcr测定包括下述引物：
[0376]
f1：5
’‑
gctcgactagagcttgcgga-3’(seq id no：42)
[0377]
r1：5
’‑
tcttaagtagcaggctcaggaggcc-3’(seq id no：43)
[0378]
f2：5
’‑
gttcaccagcgtgaatgctcaca-3’(seq id no：44)
[0379]
r2：5
’‑
ctgtcagaagttggcagcagg-3’(seq id no：45)
[0380]
southern blot检测包括如下探针引物：
[0381]5’
探针(5’probe)：
[0382]
f：5
’‑
ggactggatgagacagctcaaaggg-3’(seq id no：46)
[0383]
r：5
’‑
gctgcttacagggcttcttcctcaa-3’(seq id no：47)
[0384]3’
探针(3’probe)：
[0385]
f：5
’‑
gagacgcaatgggcagttagattcc-3’(seq id no：48)
[0386]
r：5
’‑
aaatgttccagcacttcctgggtgt-3’(seq id no：49)
[0387]
neo探针(neo probe)：
[0388]
f：(seq id no：20)
[0389]
r：(seq id no：21)
[0390]
按前述实施例1中所述方法进行囊胚注射和子代繁育，可得到表达人源化il-17ra蛋白的il-17ra基因人源化杂合子和纯合子小鼠。可通过pcr鉴定子代小鼠体细胞的基因型。示例性的f1代小鼠(已去neo)的鉴定结果见图12，其中，编号为r-f1-1、r-f1-2、r-f1-5的小鼠为阳性杂合小鼠。pcr测定包括下述引物：
[0391]
wt-f：5
’‑
accactcacctcctctgctgga-3’(seq id no：50)
[0392]
wt-r：5
’‑
cctcatggagcacagatgcctat-3’(seq id no：51)
[0393]
wt-f：(seq id no：50)
[0394]
mut-r：5
’‑
ctgtcagaagttggcagcagg-3’(seq id no：52)
[0395]
frt-f：5
’‑
caaacagcagcctacacaacttcat-3’(seq id no：53)
[0396]
frt-r：5
’‑
ctaggcaacacaccttctccctgt-3’(seq id no：54)
[0397]
flp-f2：(seq id no：27)
[0398]
flp-r2：(seq id no：28)
[0399]
通过本方法，构建了可稳定传代且无随机插入的il-17ra基因人源化的转基因小鼠。
[0400]
通过常规检测方法可确认小鼠体内人源化il-17ra蛋白的表达情况，例如可用抗鼠il-17ra抗体mil-17ra pe和抗鼠gr-1抗体mgr1percp，或抗人il-17ra抗体hil-17rape和抗鼠gr-1抗体mgr1percp对小鼠的骨髓细胞识别染色后进行流式检测il-17ra蛋白的表达。流式分析结果(见图13)显示。在il-17ra基因人源化的杂合子小鼠脾脏内，检测到表达鼠il-17ra蛋白(图b)和人源化il-17ra蛋白(图d)的细胞；而在野生型c57bl/6小鼠的脾脏内，只能检测到表达鼠il-17ra蛋白(图a)，未检测到表达人或人源化il-17ra蛋白的细胞(图c)。
[0401]
实施例3tnf-α基因人源化小鼠
[0402]
小鼠tnf-α基因(ncbi gene id：21926，primary source：mgi：104798，uniprot id：p06804，位于17号染色体nc_000083.6的第35199367至35202007位，基于转录本nm_013693.3(seq id no：55)及其编码蛋白np_038721.1(seq id no：56))，人tnf-α基因(ncbi gene id：7124，primary source：hgnc:11892，uniprot id：p01375，位于6号染色体nc_000006.12的第31575567至31575567位，基于转录本nm_000594.3(seq id no：57)及其编码蛋白np_000585.2(seq id no：58))。
[0403]
为了达到本发明的目的，可在内源小鼠tnf-α基因座引入编码人tnf-α蛋白的基因序列，使得该小鼠表达人tnf-α蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术在小鼠内源tnf-α基因座上用人tnf-α基因的序列替换特定小鼠tnf-α基因序列。例如，将至少包含小鼠tnf-α基因的起始密码子atg至终止密码子taa的约1.8kb(1796bp)序列用对应的人基因序列替换，实现对小鼠tnf-α基因的人源化改造。
[0404]
构建用于同源重组的打靶载体，所述打靶载体上含有上游和下游的同源臂序列(小鼠内源tnf-α基因座上游6173bp和下游4033bp的dna序列)，并含有人tnf-α基因座序列。其中，上述上游同源臂序列(5’同源臂，seq id no：59)与ncbi登录号为nc_0000083.6的第35209909-35203737位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，seq id no：60)与ncbi登录号为nc_0000083.6的第35197201至35193169位核苷酸序列相同；含有人tnf-α基因序列的dna片段(6287bp，seq id no：61)与ncbi登录号为nc_000006.12的第31573694-31579980位核苷酸序列相同。
[0405]
打靶载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列neo，并在抗性基因的两侧具有两个同向排列的位点特异性重组系统loxp重组位点，组成neo盒(neo cassette)。其中neo盒5’端与含有人tnf-α的dna片段序列(seq id no：61)直接连接，neo盒3’端与小鼠基因座的接合设计为5
’‑
aatgtatgctatacgaagttattaggtccctcgaggggatccgaattcatcggcttcctcctggaactcctcctcctcg-3’(seq id no：62)，其中序列“gaatt”的最后一个“t”是neo盒的最后一个核苷酸，序列“catcg”的第一个“c”是小鼠序列的第一个核苷酸。此外，还在重组载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因，例如白喉毒素a亚基的编码基因(dta)。
[0406]
载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的重组载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的重组载体电穿孔转染入c57bl/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用pcr和southern blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞。按前述实施例1中所述方法进行囊胚注射和子代繁育，可得到表达人tnf-α蛋白的tnf-α基因人源化杂合子和纯合子小鼠。可通过pcr鉴定子代小鼠体细胞的基因型，示例性的f1代小鼠的鉴定结果见图14，其中编号为10的小鼠为阳性杂合小鼠。pcr测定包括下述引物：
[0407]
wt-f：5
’‑
ggtgacctagatagtgcctgg-3’(seq id no：63)
[0408]
wt-r：5
’‑
tcagtcgcaggcacgttaag-3’(seq id no：64)
[0409]
neo-f：5
’‑
tgcatcgcattgtctgagtagg-3’(seq id no：65)
[0410]
wt-r：5
’‑
tcagtcgcaggcacgttaag-3’(seq id no：64)
[0411]
通过本方法，构建了可稳定传代且无随机插入的tnf-α基因人源化的转基因小鼠。
[0412]
实施例4双重人源化或多重人源化小鼠的制备及鉴定
[0413]
利用本方法或制得的il-17a、il-17ra、tnf-α基因人源化的转基因小鼠还可以用于制备双人源化或多人源化小鼠模型。例如，在前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有其它基因修饰的小鼠。或者，也可在il-17a和/或il-17ra和/或tnf-α人源化的转基因小鼠的基础上，利用分离小鼠es胚胎干细胞和基因同源重组打靶技术，获得il-17a和/或il-17ra和/或tnf-α基因与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。
[0414]
还可将本方法得到的il-17a和/或il-17ra和/或tnf-α转基因小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选。根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到il-17a和/或il-17ra和/或tnf-α基因人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合小鼠。利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人il-17a和/或il-17ra和/或tnf-α和其它基因的相关信号通路的调节剂的体内药效验证等。
[0415]
以il-17a/tnf-α基因双重人源化的小鼠为例，由于小鼠il-17a与tnf-α基因分别位于1号和17号染色体上，选择il-17a基因人源化小鼠与tnf-α基因人源化小鼠交配，通过阳性子代小鼠的筛选，最终得到il-17a/tnf-α基因双重人源化的小鼠。
[0416]
以il-17a/il-17ra基因双重人源化的小鼠为例，由于鼠il-17a与il-17ra基因分别位于1号和6号染色体上，选择il-17a基因人源化小鼠与il-17ra基因人源化小鼠交配，通过阳性子代小鼠的筛选，最终il-17a/il-17ra基因双重人源化的小鼠。
[0417]
实施例5使用人源化小鼠建立eae疾病模型
[0418]
利用本发明公开的人源化小鼠可以诱导制备多种人类疾病模型，包括多发性硬化、哮喘、过敏等模型，可以用于测试人特异性抗体的体内药效。例如，il-17a和/或il-17ra基因人源化小鼠可用于评估人特异性il-17信号通路的拮抗剂的药效、药代动力学及在本领域已知的各种疾病模型中的体内治疗功效。
[0419]
以实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，eae)模型的制备为例，可以使用本发明制备的il-17a、il-17a/il-17ra等基因人源化小鼠(约10周龄)，采用mog免疫1次(第0天，皮下注射200μg/只)，并给予腹腔注射百日咳毒素(ptx)两次(第0天和第1天，剂量为400μg/只)。首次免疫后每天对小鼠称重并连续观察，待小鼠发病后分组，通过灌胃、腹腔注射或鼠尾静脉注射等多种途径给药。可通过行为学评分、脑/脊髓ihc病理、he病理学检查、血清/脑匀浆的th17型多细胞因子检测和cns及脾、淋巴结的流式细胞术等多重检测指标评定不同人用药物的体内药效情况。
[0420]
在一项研究中，使用如实施例1所述的il-17a人源化小鼠纯合子建立eae疾病模型，实验分组如表1所示。使用上述方法诱导后，pbs对照组(g1、g3)无一小鼠发病，仅在建模组(g2、g4)发现小鼠患病，临床症状表现为精神萎靡、体重下降、鼠尾张力消失、后肢或四肢麻痹、大小便失禁，个别小鼠表现为共济失调。两个建模组共10只小鼠全部发病，发病时间为首次免疫后第10-12天，并出现体重减轻。随着致敏后天数的增加发病例数逐渐增加，发病后3-5天临床症状达高峰，此后进入缓解期，体重逐渐增加，呈现“发病-缓解”的趋势。
[0421]
比较建模组雌性和雄性小鼠的发病情况，每天测量动物体重并根据4点评分体系(临床评分)评价神经病学指标：0＝正常；1＝尾巴软弱无力；2＝部分后肢麻痹；3＝全部后肢麻痹；4＝四肢麻痹。发现两性小鼠在建模过程中发病率、发病时间、达峰时间及症状严重
程度无明显差别，但雌性小鼠体重和临床症状自行恢复程度较好(见图15、图16)，在实验结束时(第45天)取雌性小鼠的脊髓组织进行多聚甲醛固定、石蜡包埋切片后he和ihc染色观察组织病理学改变。对脊髓腰膨大白质纵切面进行染色，如图17和图18中的结果所示，mog免疫小鼠(建模组)的脊髓中有大量炎症细胞浸润，髓鞘蛋白大大减少，对照组小鼠脊髓未见异常。
[0422]
表1
[0423]
组别免疫周龄小鼠数量性别基因型g1(对照组)pbs104雌性il17a(h/h)g2(建模组)mog105雌性il17a(h/h)g3(对照组)pbs105雄性il17a(h/h)g4(建模组)mog105雄性il17a(h/h)
[0424]
在eae模型中，il-17a主要由疾病发展期间的cd4+th17细胞产生。为了检测小鼠中人il-17的产生，分离mog免疫的il-17a人源化小鼠纯合子(雌性，n＝5)的淋巴结细胞，并在布雷菲德菌素a的存在下用pma和离子霉素刺激6小时。通过facs分析产生il-17和ifnγ的细胞。图19显示了示例性的流式细胞术结果。结果表明，mog免疫后小鼠淋巴结的cd3+cd4+t细胞中hil-17+cd3+cd4+t细胞和ifnγ+t细胞的百分比均增加，从分子层面证明eae模型建造成功。
[0425]
以上结果表明，使用本发明的方法制备的基因人源化小鼠可以用于建立稳定的eae模型。
[0426]
实施例6使用人源化il-17a小鼠eae模型评估体内药效
[0427]
使用雌性il-17a人源化小鼠纯合子根据实施例5中所述的方法建立eae模型。在发病后，将小鼠分组并按照不同给药方案腹腔注射抗人il-17a抗体ixekizumab，对照组注射pbs。实验流程如图20所示，且给药方案如表2所示。具体来说，在mog免疫当天(第0天)开始每天记录小鼠体重并对小鼠发病情况进行临床评分，观察神经功能表现。在第15天对小鼠进行分组。如图21和图22所示，与对照组相比，给药组小鼠体重减轻情况得到显著缓解，临床评分显著下降，且g2组的给药方式与g3、g4组相比对具有更好的改善作用。上述结果表明，使用本发明的il-17a人源化小鼠建立的eae模型能够用于评估靶向人il-17a的药物的体内功效。
[0428]
表2
[0429]
[0430]
biw：两周一次，qw：每周一次
[0431]
实施例7使用人源化il-17a小鼠建立银屑病模型及其用于评估体内药效
[0432]
toll样受体在银屑病发生和发展进程中起重要作用，咪喹莫特是toll样受体激动剂，可用于银屑病造模。在本实施例中，使用如实施例1所述的il-17a人源化小鼠纯合子通过咪喹莫特诱导的方法建立银屑病模型。将雌性il-17a人源化小鼠随机分为对照组(g1；不进行诱导)、模型组(g2)和给药组(g3)，每组5只小鼠。实验开始时(-d3)用剃毛器去除小鼠背部毛发，露出2cm
×
3cm的皮肤区域。3天后(d0)，模型组和给药组小鼠使用5％咪喹莫特(imiquimod，imq)乳膏(局部剂量83mg)每天对背部皮肤区域涂抹，连续涂抹12天；对照组小鼠涂抹凡士林。给药组小鼠在-d3、d0、d4、d7和d11腹腔注射抗人il-17a抗体(ixekizumab，100mg/kg单次剂量)，共给药5次。全部实验周期为17天，具体实验方案如图23所示。
[0433]
从d0开始每天称量小鼠体重，对小鼠进行拍照并观察小鼠背部情况，并对小鼠发病情况进行临床评分。评分项目包括小鼠皮损处红斑(erythema)及鳞屑(scales)。每项根据严重程度分为0-4分，pasi评分标准如下：0-无；1-轻度；2-中度；3-重度；4-极重度。对各组小鼠每项评分和两项总分取平均值后进行比较。实验结束(d14)时，取小鼠背部及右耳皮肤标本切片处理后用苏木精和伊红染色(he)。对各组小鼠背部糜烂、棘突出现、角化不全、混合炎细胞浸润情况按照严重程度进行评分(0.5-2分)：0.5-轻微、1-轻度、1.5-中度、2-重度；对基质细胞增生进行评分(0.5-2分)：0.5为2-4层、1为4-6层、1.5为6-8层、2为8-10层；出现痂皮：0.5分。进行结果统计和组间病理学分析评分，并测量表皮厚度。
[0434]
从小鼠体重随时间的变化情况(图24)可知，对照组整个实验周期内体重平稳；模型组、给药组体重趋势一致，均从d0开始先下降，d2左右降至最低，再缓慢上升，实验过程中两组体重差异不大，实验终点时所有组小鼠体重接近且无明显差异。如图25-27所示的背部皮肤红斑、鳞屑和综合pasi评分结果表明，对照组无一小鼠发病，而模型组和给药组表现出不同程度的疾病。对比模型组和给药组而言，给药组的小鼠皮肤pasi评分明显低于模型组，说明对模型小鼠给予抗人il-17a抗体治疗对银屑病具有治疗作用。小鼠的背部组织切片的he染色结果(图28)、背部组织表皮厚度统计结果(图29)和背部组织切片的病理学评分统计结果(图30)表明，给药组背部皮肤在基质细胞增生、表皮增厚方面的病变程度均低于模型组。另外，模型组中部分小鼠的背部和耳朵皮肤可见痂皮，而给药组中未见此种病变，提示模型组动物皮肤出现过溃破或糜烂，病变严重程度高于给药组。
[0435]
上述结果证明，本发明的人源化小鼠可以用于建立银屑病模型以评估针对人il-17a的药物的体内功效。
[0436]
实施例8使用人源化il-17a小鼠建立的银屑病模型测试体内剂量
[0437]
使用如实施例1所述的il-17a人源化小鼠纯合子通过咪喹莫特诱导的方法建立银屑病模型。取雌性小鼠随机分为空白对照g1组(凡士林；不诱导疾病)和不同处理的模型组(以下剂量均为单次剂量)：对照g2组(0.9％nacl)、同型对照g3组(10mg/kg igg4)，g4组(1mg/kg ixekizumab)、g5组(3mg/kg ixekizumab)、g6组(10mg/kg ixekizumab)，每组5只实验动物。实验开始时(-d3)用剃毛器去除背部毛发，露出2cm
×
3cm的皮肤区域。3天后(d0)给药组使用5％咪喹莫特(imiquimod，imq)乳膏(局部剂量80mg)每天对背部涂抹造模，连续涂抹12天，g1组小鼠涂抹凡士林作为空白对照。给药组实验开始(-d3)起每周腹腔注射抗人il17a抗体(ixekizumab)、0.9％nacl或igg4，共给药5次。全部实验周期为14天，具体实验方
案如图31所示。
[0438]
从小鼠体重随时间的变化情况(图32)可见，对照组整个实验周期内体重平稳，模型组、给药组体重趋势一致，均从d0开始先下降，d2左右降至最低，再缓慢上升。实验过程中两组体重差异不大，所有组小鼠体重接近且无明显差异。如图33-35所示的背部皮肤红斑、鳞屑和综合pasi评分结果表明，空白对照组无一小鼠发病，而不同处理的模型组表现出不同程度的皮肤疾病。使用抗人il-17a抗体药物ixekizumab处理的小鼠(g4-g6)皮肤pasi评分低于nacl及igg4处理的小鼠，说明对模型小鼠给予抗人il-17a抗体治疗缓解了咪喹莫特引起的皮肤炎症的临床体征，其中使用剂量10mg/kg ixekizumab处理的效果最好。
[0439]
对各组小鼠的背部组织表皮厚度统计结果(图36)表明，抗人il-17a抗体给药组小鼠的背部皮肤在基质细胞增生、表皮增厚方面的病变程度均低于nacl及igg4注射组的动物，说明抗人il-17a抗体减轻了疾病模型小鼠的表皮增厚。小鼠的背部组织切片的病理学评分统计结果如图37所示，给药组背部皮肤在基质细胞增生、表皮增厚方面的病变程度均低于模型组。另外，模型组中部分小鼠的背部和耳朵皮肤可见痂皮，而给药组中未见此种病变，提示模型组动物皮肤出现过溃破或糜烂，病变严重程度高于给药组。说明给予小鼠抗人il-17a抗体缓解了咪喹莫特引起的炎症体征。其中使用剂量10mg/kg ixekizumab处理的效果最好。上述结果表明，本发明的人源化小鼠可以用于建立银屑病模型以评估针对人il-17a的药物的体内剂量。
[0440]
本发明提供以下内容：
[0441]
1.一种转基因非人动物细胞，所述细胞的基因组中包含可表达形式的人il-17a基因的序列，任选其中所述人il-17a基因的序列替换所述细胞的基因组中对应的内源性序列。
[0442]
2.如项1所述的细胞，其中所述细胞表达人il-17a蛋白，任选所述蛋白包含与seq id no:4具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含seq id no:4或由seq id no:4组成。
[0443]
3.如项1所述的细胞，其中所述人il-17a基因的序列包含人il-17a基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列。
[0444]
4.如项1所述的细胞，其中所述人il-17a基因的序列包含与seq id no:7具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含seq id no:7或由seq id no:7组成。
[0445]
5.如项1至3中任一项所述的细胞，其中所述细胞的基因组中还包含可表达形式的人il-17ra基因的序列和/或人tnf-α基因的序列，任选其中所述人il-17ra基因的序列和/或人tnf-α基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
[0446]
6.如项5所述的细胞，其中所述细胞表达人il-17ra蛋白或人源化il-17ra蛋白，和/或人tnf-α蛋白，任选其中所述人il-17ra包含与seq id no:32具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含seq id no:32或由seq id no:32组成；
[0447]
所述人源化il-17ra蛋白包含与seq id no:32第49-341位所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含seq id no:32第49-341位所示的氨基酸序列；或
[0448]
所述人源化il-17ra蛋白包含与seq id no:39具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含seq id no:39或由seq id no:39组成；和
[0449]
和/或所述人tnf-α蛋白包含与seq id no:58具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含seq id no:58或由seq id no:58组成。
[0450]
7.如项5所述的细胞，其中所述人il-17ra基因的序列包含人il-17ra基因自2号外显子至11号外显子的序列。
[0451]
8.如项5所述的细胞，其中所述人il-17ra基因的序列包含与seq id no:35具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或所述人il-17ra基因的序列包含seq id no:35或由seq id no:35组成。
[0452]
9.如项5所述的细胞，其中所述人tnf-α基因的序列包含人tnf-α基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列。
[0453]
10.如项5所述的细胞，其中所述人tnf-α基因的序列包含与seq id no:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含seq id no:61，或由seq id no:61组成。
[0454]
11.一种转基因非人动物细胞，所述细胞的基因组中包含可表达形式的人il-17ra基因的序列，任选其中所述人il-17ra基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
[0455]
12.如项11所述的细胞，其中所述人il-17ra基因的序列包含与seq id no:35具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含seq id no:35或由seq id no:35组成。
[0456]
13.如项11或12所述的细胞，其中所述细胞的基因组中还包含可表达形式的人tnf-α基因的序列，其中所述人tnf-α基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
[0457]
14.如项13所述的细胞，其中所述人tnf-α基因的序列包含人tnf-α基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列。
[0458]
15.如项13所述的细胞，其中所述人tnf-α基因的序列包含与seq id no:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含seq id no:61，或由seq id no:61组成。
[0459]
16.如项1至15中任一项所述的细胞，其中所述转基因非人动物细胞是转基因啮齿类动物细胞或转基因小鼠细胞。
[0460]
17.如项1至16中任一项所述的细胞，其中所述细胞选自体细胞和干细胞例如胚胎干细胞。
[0461]
18.如或项1至17中任一项所述的细胞在筛选调节il-17a/il-17-ra信号通路的试剂中的用途，任选地所述试剂选自抗体、抗体片段、对应受体或配体或其片段、融合蛋白和小分子化合物。
[0462]
19.转基因非人动物在构建与il-17a/il-17ra信号通路异常相关的疾病模型中的用途，其中转基因非人动物的基因组中包含可表达形式的人il-17a基因的序列，任选其中
所述人il-17a基因的序列替换所述细胞的基因组中对应的内源性序列，优选所述转基因非人动物是转基因啮齿类动物，例如转基因小鼠。
[0463]
20.如项19所述的用途，其中所述疾病选自自身免疫病和肿瘤，任选所述自身免疫病选自多发性硬化症、哮喘、炎症性肠病、银屑病、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、白塞病、系统性红斑狼疮、原发性干燥综合征、心肌炎、i型糖尿病、甲状腺炎、特异性皮炎、超敏反应、移植物抗宿主病。
[0464]
21.转基因非人动物在测试针对人il-17a的试剂的体内药效中的用途，其中所述转基因非人动物的基因组中包含可表达形式的人il-17a基因的序列，任选其中所述人il-17a基因的序列替换所述细胞的基因组中对应的内源性序列，优选所述转基因非人动物是转基因啮齿类动物，例如转基因小鼠。
[0465]
22.如项21所述的用途，其中所述试剂选自针对人il-17a的抗体或抗体片段，或小分子拮抗剂。
[0466]
23.如项21或22所述的用途，其中所述转基因非人动物用于构建与il-17a信号通路异常相关的疾病模型，并在所述疾病模型中测试所述试剂的体内药效。
[0467]
24.如项23所述的用途，其中所述疾病模型是自身免疫病模型，例如选自自身免疫病模型选自实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)和银屑病模型，例如所述银屑病模型是咪喹莫特诱导的银屑病模型。
[0468]
25.一种测试针对人il-17a的试剂的体内药效的方法，所述方法包括：
[0469]
a.使用转基因非人动物构建与il-17a信号通路异常相关的疾病模型，其中所述转基因非人动物的基因组中包含可表达形式的人il-17a基因的序列，任选其中所述人il-17a基因的序列替换所述细胞的基因组中对应的内源性序列；
[0470]
b.对所述疾病模型动物施用所述针对人il-17a的试剂；和
[0471]
c.评估所述针对il-17a的试剂的体内药效，
[0472]
优选所述转基因非人动物是转基因啮齿类动物，例如转基因小鼠。
[0473]
26.如项25所述的方法，其中所述试剂选自针对人il-17a的抗体或抗体片段，或小分子拮抗剂。
[0474]
27.如项25或26所述的方法，其中所述疾病模型是自身免疫病模型，例如选自实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)和银屑病模型，例如所述银屑病模型是咪喹莫特诱导的银屑病模型。
[0475]
28.如项19-24中任一项所述的用途，或如项25-27中任一项所述的方法，其中所述转基因非人动物表达人il-17a蛋白，任选所述蛋白包含与seq id no:4具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含seq id no:4或由seq id no:4组成。
[0476]
29.如项19-24中任一项所述的用途，或如项25-27中任一项所述的方法，其中所述人il-17a基因的序列包含人il-17a基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列。
[0477]
30.如项19-24中任一项所述的用途，或如项25-27中任一项所述的方法，其中所述人il-17a基因的序列包含与seq id no:7具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含seq id no:7或由seq id no:7组成。
[0478]
31.如项29或30所述的方法或用途，其中所述转基因非人动物的基因组中还包含可表达形式的人il-17ra基因的序列和/或人tnf-α基因的序列，任选其中所述人il-17ra基因的序列和/或人tnf-α基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
[0479]
32.如项31所述的方法或用途，其中所述转基因非人动物表达人il-17ra蛋白或人源化il-17ra蛋白，和/或人tnf-α蛋白，任选其中所述人il-17ra包含与seq id no:32具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含seq id no:32或由seq id no:32组成；
[0480]
所述人源化il-17ra蛋白包含与seq id no:32第49-341位所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含seq id no:32第49-341位所示的氨基酸序列；或
[0481]
所述人源化il-17ra蛋白包含与seq id no:39具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含seq id no:39或由seq id no:39组成；和
[0482]
和/或所述人tnf-α蛋白包含与seq id no:58具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含seq id no:58或由seq id no:58组成。
[0483]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，本领域技术人员将理解，在本发明的技术构思范围内可以对本发明的技术方案进行多种变型，这些变型均属于本发明的保护范围。
[0484]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0485]
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的精神，其同样应当视为本发明所公开的内容。