一种干细胞上清液提取方法与流程

1.本发明属于上清液提取技术领域，具体涉及一种干细胞上清液提取方法。


背景技术：

2.脂肪干细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，在一定的诱导环境下可以向骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、神经元细胞等分化。脂肪干细胞具有取材方便、分布广泛等优点，在组织工程学及再生医学领域可以作为细胞移植的种子细胞，有非常重要的研究和应用价值。
3.目前现有的干细胞上清液提取方法还存在一些问题：不方便对肪间充质干细胞进行获取，提取效率降低，不利于干细胞分泌多种细胞因子，为此我们提出一种干细胞上清液提取方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种干细胞上清液提取方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种干细胞上清液提取方法，包括以下步骤：
6.s1.获取间充质干细胞：从脂肪组织中获取间充质干细胞；
7.s2.无血清培养：采用无血清培养基对间充质干细胞进行培养；
8.s3.提取初始上清液：待细胞长满平底，收集培养基，离心，去除细胞碎片，得到初始上清液；
9.s4.离心：取所述初始上清液在进一步梯度离心1800-2400g离心8-12min，除去死细胞和大的碎片，得到离心后的第一上清液；
10.s5.细胞提取：将细胞碎片、死细胞和大的碎片用消化液消化后，再超声破碎，然后进一步梯度离心1800-2400g离心8-12min，得到第二上清液；
11.s6.混合、过滤浓缩：将s4所得的第一上清液与s5中得到第二上清液混合，过滤，收集滤液并浓缩，得间充质干细胞提取物。
12.优选的，所述s1中获取间充质干细胞的方法包括以下步骤：
13.s101.采集并清洗脂肪组织；
14.s102.将清洗后的脂肪组织绞碎，加入消化液，在梯度振荡条件下进行消化，控制振荡转速从低到高，振荡一定时间后终止消化；
15.s103.离心，去除上清液，将得到的沉淀重悬、筛网过滤后，再次离心，去除上清液，收集细胞；
16.s104.将获得的细胞1-3
×
104/cm2接种密度进行接种，加入培养液培养，待细胞生长达到80-90％融合时进行消化，按1:3-1:4的比例传代，获得脂肪间充质干细胞。
17.优选的，所述s102中消化的具体步骤如下：先在50-100rpm转速下振荡1-3min，再
将转速升至120-160rpm，振荡3-5min，再将转速升至180-220rpm，振荡6-10min，最后将转速升至300-360rpm，振荡8-12min，即可。
18.优选的，所述s102中的消化液为i型胶原蛋白酶的d-hank’平衡盐溶液。
19.优选的，所述s2中的无血清培养基包括基础培养基和添加成分，所述添加成分脂类混合物1-5vol％、谷氨酰胺1-4mm、氢化可的松1-100μg/l、硫酸锌0.2-2mg/l、丁酸钠1-4mm、柠檬酸铁100-400μm、维生素c100-400μm、重组人表皮生长因子1-50μg/l、重组人碱性成纤维细胞生长因子1-50μg/l、rgd短肽1-50μg/l、棕榈酰三肽-5 10-100μg/l、棕榈酰四肽-7 10-100μg/l、氯化锂1-10mm、l-谷胱甘肽1-10mg/l、大豆胰酶抑制剂20-200mg/l、β-巯基乙醇1-5mg/l、乙醇胺0.01-0.4g/l、亚硒酸钠0.0001-0.001mg/l、丙酮酸钠0.02-0.2mm、hepes 0.005-0.02m、nahco3 1-6mm。
20.优选的，所述基础培养基包括dmem/f12、a-mem、dmem或imdm中的一种。
21.优选的，所述添加成分脂类混合物2vol％、谷氨酰胺2mm、氢化可的松50μg/l、硫酸锌1.2mg/l、丁酸钠3mm、柠檬酸铁300μm、维生素c300μm、重组人表皮生长因子25μg/l、重组人碱性成纤维细胞生长因子25μg/l、rgd短肽25μg/l、棕榈酰三肽-5 50μg/l、棕榈酰四肽-7 50μg/l、氯化锂5mm、l-谷胱甘肽5mg/l、大豆胰酶抑制剂120mg/l、β-巯基乙醇3mg/l、乙醇胺0.24g/l、亚硒酸钠0.0005mg/l、丙酮酸钠0.12mm、hepes 0.016m、nahco3 4mm。
22.优选的，所述s3中的离心条件为600-800g离心8-12min。
23.优选的，所述s5中的消化液包括魔芋葡甘聚糖、抗坏血酸和黄芪多糖中的任意一种，所述超声破碎采用超声波细胞破碎仪。
24.优选的，所述s6中混合时的转速为300-360rpm，混合时间为8-12min，所述过滤采用过滤膜进行过滤，所述过滤膜的孔径为0.08-0.12um。
25.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
26.(1)本发明中获取间充质干细胞的过程能缩短脂肪间充质干细胞的提取时间，有效提高脂肪间充质干细胞的提取效率，同时保持传代稳定性。
27.(2)本发明中通过无血清培养，加快了细胞的繁殖速率，有利于间充质干细胞分泌多种细胞因子，为间充质干细胞应用提供高效、快捷、方便的途径。
28.(3)本发明中的方法具有消化速度快，不溶性组织块大幅减少，而且不影响干细胞活性等优点。
附图说明
29.图1为本发明的流程图。
具体实施方式
30.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.实施例1
32.请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种干细胞上清液提取方法，包括以下步
骤：
33.s1.获取间充质干细胞：从脂肪组织中获取间充质干细胞；
34.s2.无血清培养：采用无血清培养基对间充质干细胞进行培养；
35.s3.提取初始上清液：待细胞长满平底，收集培养基，离心，去除细胞碎片，得到初始上清液；
36.s4.离心：取所述初始上清液在进一步梯度离心1800g离心8min，除去死细胞和大的碎片，得到离心后的第一上清液；
37.s5.细胞提取：将细胞碎片、死细胞和大的碎片用消化液消化后，再超声破碎，然后进一步梯度离心1800g离心8min，得到第二上清液；
38.s6.混合、过滤浓缩：将s4所得的第一上清液与s5中得到第二上清液混合，过滤，收集滤液并浓缩，得间充质干细胞提取物。
39.本实施例中，优选的，所述s1中获取间充质干细胞的方法包括以下步骤：
40.s101.采集并清洗脂肪组织；
41.s102.将清洗后的脂肪组织绞碎，加入消化液，在梯度振荡条件下进行消化，控制振荡转速从低到高，振荡一定时间后终止消化；
42.s103.离心，去除上清液，将得到的沉淀重悬、筛网过滤后，再次离心，去除上清液，收集细胞；
43.s104.将获得的细胞1
×
104/cm2接种密度进行接种，加入培养液培养，待细胞生长达到80％融合时进行消化，按1:3的比例传代，获得脂肪间充质干细胞。
44.本实施例中，优选的，所述s102中消化的具体步骤如下：先在50rpm转速下振荡1min，再将转速升至120rpm，振荡3min，再将转速升至180rpm，振荡6min，最后将转速升至300rpm，振荡8min，即可。
45.本实施例中，优选的，所述s102中的消化液为i型胶原蛋白酶的d-hank’平衡盐溶液。
46.本实施例中，优选的，所述s2中的无血清培养基包括基础培养基和添加成分，所述添加成分脂类混合物1vol％、谷氨酰胺1mm、氢化可的松1μg/l、硫酸锌0.2mg/l、丁酸钠1mm、柠檬酸铁100μm、维生素c100μm、重组人表皮生长因子1μg/l、重组人碱性成纤维细胞生长因子1μg/l、rgd短肽1μg/l、棕榈酰三肽-5 10μg/l、棕榈酰四肽-7 10μg/l、氯化锂1mm、l-谷胱甘肽1mg/l、大豆胰酶抑制剂20mg/l、β-巯基乙醇1mg/l、乙醇胺0.01g/l、亚硒酸钠0.0001mg/l、丙酮酸钠0.02mm、hepes 0.005m、nahco3 1mm。
47.本实施例中，优选的，所述基础培养基包括dmem/f12。
48.本实施例中，优选的，所述s3中的离心条件为600g离心8min。
49.本实施例中，优选的，所述s5中的消化液包括魔芋葡甘聚糖，所述超声破碎采用超声波细胞破碎仪。
50.本实施例中，优选的，所述s6中混合时的转速为300rpm，混合时间为8min，所述过滤采用过滤膜进行过滤，所述过滤膜的孔径为0.08um。
51.实施例2
52.请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种干细胞上清液提取方法，包括以下步骤：
53.s1.获取间充质干细胞：从脂肪组织中获取间充质干细胞；
54.s2.无血清培养：采用无血清培养基对间充质干细胞进行培养；
55.s3.提取初始上清液：待细胞长满平底，收集培养基，离心，去除细胞碎片，得到初始上清液；
56.s4.离心：取所述初始上清液在进一步梯度离心2400g离心12min，除去死细胞和大的碎片，得到离心后的第一上清液；
57.s5.细胞提取：将细胞碎片、死细胞和大的碎片用消化液消化后，再超声破碎，然后进一步梯度离心2400g离心12min，得到第二上清液；
58.s6.混合、过滤浓缩：将s4所得的第一上清液与s5中得到第二上清液混合，过滤，收集滤液并浓缩，得间充质干细胞提取物。
59.本实施例中，优选的，所述s1中获取间充质干细胞的方法包括以下步骤：
60.s101.采集并清洗脂肪组织；
61.s102.将清洗后的脂肪组织绞碎，加入消化液，在梯度振荡条件下进行消化，控制振荡转速从低到高，振荡一定时间后终止消化；
62.s103.离心，去除上清液，将得到的沉淀重悬、筛网过滤后，再次离心，去除上清液，收集细胞；
63.s104.将获得的细胞3
×
104/cm2接种密度进行接种，加入培养液培养，待细胞生长达到90％融合时进行消化，按1:4的比例传代，获得脂肪间充质干细胞。
64.本实施例中，优选的，所述s102中消化的具体步骤如下：先在100rpm转速下振荡3min，再将转速升至160rpm，振荡5min，再将转速升至220rpm，振荡10min，最后将转速升至360rpm，振荡12min，即可。
65.本实施例中，优选的，所述s102中的消化液为i型胶原蛋白酶的d-hank’平衡盐溶液。
66.本实施例中，优选的，所述s2中的无血清培养基包括基础培养基和添加成分，所述添加成分脂类混合物5vol％、谷氨酰胺4mm、氢化可的松100μg/l、硫酸锌2mg/l、丁酸钠4mm、柠檬酸铁400μm、维生素c400μm、重组人表皮生长因子50μg/l、重组人碱性成纤维细胞生长因子50μg/l、rgd短肽50μg/l、棕榈酰三肽-5 100μg/l、棕榈酰四肽-7 100μg/l、氯化锂10mm、l-谷胱甘肽10mg/l、大豆胰酶抑制剂200mg/l、β-巯基乙醇5mg/l、乙醇胺0.4g/l、亚硒酸钠0.001mg/l、丙酮酸钠0.2mm、hepes 0.02m、nahco3 6mm。
67.本实施例中，优选的，所述基础培养基包括a-mem。
68.本实施例中，优选的，所述s3中的离心条件为800g离心12min。
69.本实施例中，优选的，所述s5中的消化液包括抗坏血酸，所述超声破碎采用超声波细胞破碎仪。
70.本实施例中，优选的，所述s6中混合时的转速为360rpm，混合时间为12min，所述过滤采用过滤膜进行过滤，所述过滤膜的孔径为0.12um。
71.实施例3
72.请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种干细胞上清液提取方法，包括以下步骤：
73.s1.获取间充质干细胞：从脂肪组织中获取间充质干细胞；
74.s2.无血清培养：采用无血清培养基对间充质干细胞进行培养；
75.s3.提取初始上清液：待细胞长满平底，收集培养基，离心，去除细胞碎片，得到初始上清液；
76.s4.离心：取所述初始上清液在进一步梯度离心2200g离心10min，除去死细胞和大的碎片，得到离心后的第一上清液；
77.s5.细胞提取：将细胞碎片、死细胞和大的碎片用消化液消化后，再超声破碎，然后进一步梯度离心2200g离心10min，得到第二上清液；
78.s6.混合、过滤浓缩：将s4所得的第一上清液与s5中得到第二上清液混合，过滤，收集滤液并浓缩，得间充质干细胞提取物。
79.本实施例中，优选的，所述s1中获取间充质干细胞的方法包括以下步骤：
80.s101.采集并清洗脂肪组织；
81.s102.将清洗后的脂肪组织绞碎，加入消化液，在梯度振荡条件下进行消化，控制振荡转速从低到高，振荡一定时间后终止消化；
82.s103.离心，去除上清液，将得到的沉淀重悬、筛网过滤后，再次离心，去除上清液，收集细胞；
83.s104.将获得的细胞2
×
104/cm2接种密度进行接种，加入培养液培养，待细胞生长达到85％融合时进行消化，按1:3的比例传代，获得脂肪间充质干细胞。
84.本实施例中，优选的，所述s102中消化的具体步骤如下：先在70rpm转速下振荡2min，再将转速升至140rpm，振荡4min，再将转速升至200rpm，振荡8min，最后将转速升至320rpm，振荡10min，即可。
85.本实施例中，优选的，所述s102中的消化液为i型胶原蛋白酶的d-hank’平衡盐溶液。
86.本实施例中，优选的，所述s2中的无血清培养基包括基础培养基和添加成分，所述添加成分脂类混合物2vol％、谷氨酰胺2mm、氢化可的松50μg/l、硫酸锌1.2mg/l、丁酸钠3mm、柠檬酸铁300μm、维生素c300μm、重组人表皮生长因子25μg/l、重组人碱性成纤维细胞生长因子25μg/l、rgd短肽25μg/l、棕榈酰三肽-5 50μg/l、棕榈酰四肽-7 50μg/l、氯化锂5mm、l-谷胱甘肽5mg/l、大豆胰酶抑制剂120mg/l、β-巯基乙醇3mg/l、乙醇胺0.24g/l、亚硒酸钠0.0005mg/l、丙酮酸钠0.12mm、hepes 0.016m、nahco3 4mm。
87.本实施例中，优选的，所述基础培养基包括dmem。
88.本实施例中，优选的，所述s3中的离心条件为700g离心10min。
89.本实施例中，优选的，所述s5中的消化液包括黄芪多糖，所述超声破碎采用超声波细胞破碎仪。
90.本实施例中，优选的，所述s6中混合时的转速为320rpm，混合时间为10min，所述过滤采用过滤膜进行过滤，所述过滤膜的孔径为0.1um。
91.本发明的原理及优点：
92.本发明中获取间充质干细胞的过程能缩短脂肪间充质干细胞的提取时间，有效提高脂肪间充质干细胞的提取效率，同时保持传代稳定性；本发明中通过无血清培养，加快了细胞的繁殖速率，有利于间充质干细胞分泌多种细胞因子，为间充质干细胞应用提供高效、快捷、方便的途径；本发明中的方法具有消化速度快，不溶性组织块大幅减少，而且不影响
干细胞活性等优点。
93.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。