OsSGD1蛋白在提高水稻纹枯病抗病性中的应用

ossgd1蛋白在提高水稻纹枯病抗病性中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及ossgd1蛋白在提高水稻纹枯病抗性中的应用。


背景技术：

2.纹枯病是我国水稻生成的三大病害之一，也是水稻生产的全球性重要病害。水稻纹枯病在我国各个水稻生产区域都有发生，水稻生产威胁极大，流行年份，一般减产10-20%。在纹枯病重发区，其导致的水稻减产可达40-50%，甚至绝收，严重危害我国的水稻生产。我国常年纹枯病发病面积300万公顷以上，纹枯病发病率之高，范围之广，损失程度之大，对国家粮食生产造成重大损失。近几年我国南方稻区纹枯病危害越来越严重。如，近几年江苏约95% 的稻田受到不同程度的纹枯病危害，受害田块一般减产10-20%，严重田块减产超过50%。在东北地区，辽宁省纹枯病发生较重，已成为当地水稻的主要病害之一。在纹枯病较为严重的2014年，我国纹枯病危害面积超过为500万公顷，损失稻谷300多万吨，经济损失上百亿元。所以水稻纹枯病防治对国家水稻生产稳产有重要影响，抗病品种选育责任重大，具有广大应用前景。水稻纹枯病是水稻病害中流行情况最复杂、潜在威协最大的病害之一。因此通过利用抗性基因的方法，培育抗纹枯病水稻新材料，对提高水稻产量和粮食安全有重要作用。
3.发明人前期研究发现ossgd1蛋白具有核酸结合活性，参与dna复制，在水稻细胞周期调控中重要作用，从而影响水稻籽粒发育（cn 112795588 a）。过表达ossgd1蛋白增加水稻籽粒的长度和宽度，从而提高了水稻籽粒的千粒重，增加水稻产量。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供ossgd1蛋白在提高水稻纹枯病抗性中的应用。
5.ossgd1蛋白具体来源于稻属亚洲栽培稻种02428品种（oryza sativa l. 02428）。
6.ossgd1蛋白在提高植物纹枯病抗病性中的应用。
7.所述ossgd1蛋白为如下（a）或（b）或（c）所示的蛋白质：（a）氨基酸序列是序列表中seq id no：1所示的蛋白质；（b）将seq id no：1所示的蛋白质进行一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；（c）与（a）具有95%以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
8.所述植物为禾本科植物水稻、小麦、燕麦或甘蔗。
9.所述ossgd1蛋白的编码基因为如下（1）或（2）或（3）所述的dna分子：（1）编码区如序列表中seq id no：2所示的dna分子；（2）与（1）具有90%以上同一性且编码与提高纹枯病抗性相关的蛋白的dna分子；（3）在严格条件下与（1）杂交且编码植物与提高纹枯病抗性相关的蛋白的dna分子。
10.一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入ossgd1基因，得到与所述出发植物相比增加了纹枯病抗性的转基因植物；所述ossgd1基因为编码ossgd1蛋白的基因。
11.一种植物育种的方法，包括如下步骤：提高目的植物中所述ossgd1蛋白的活性和/或含量，从而提高植物纹枯病的抗病性。
12.以上任一所述方法中，“在出发植物中导入ossgd1基因”是通过将重组表达载体导入出发植物实现的。所述重组表达载体为将所述ossgd1基因插入植物表达载体得到的可以表达所述ossgd1基因的质粒。所述重组表达载体具体可为：在pcambia1307载体的多克隆位点（例如xba与xho酶切位点之间）插入序列表的序列2第1-3645位核苷酸所示双链dna分子得到的重组质粒pcambia1307-ossgd1。
13.本发明的有益效果：本发明过表达ossgd1基因提高植物纹枯病抗性，理论分析为ossgd1蛋白通过调控植物抗病基因表达，提高植物抗病性。研究结果表明ossgd1蛋白在提高植物纹枯病抗性中具有重要作用。本发明对于培育高纹枯病抗性植物具有重大的应用价值。
附图说明
14.图1为重组质粒pcambia1307-ossgd1的元件示意图。
15.图2为转基因株系中ossgd1基因的相对表达水平。
16.图3为水稻纹枯病发病及统计结果。
17.图4 为转基因株系中水稻抗病相关基因的相对表达水平。
具体实施方式
18.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
19.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。将序列表seq id no：1所示的蛋白质命名为ossgd1蛋白。水稻cdna中， ossgd1蛋白的编码区如序列表seq id no：2所示，将其命名为ossgd1基因。
20.pcambia1307载体，全称为pcambia1307-myc植物过表达载体：上海吉然生物科技有限公司，产品目录号为jr13080311。农杆菌lba4404：行知生物科技有限公司，产品目录号为aabv02-03。
21.实施例1转基因植物的获得一、重组质粒的构建1、提取水稻02428的总rna，然后反转录得到cdna。
22.2、以步骤1得到的cdna为模板，采用f1和r1组成的引物对进行pcr扩增，回收pcr扩增产物。
23.f15'-cggtatctagaactagtggaatgtcgacggccgccaaggagg-3'r1：5'
‑ꢀ
gggccccccctcgaggtccactgaggagcgctccaaactgc-3'。
24.3、用限制性内切酶xba与xho双酶切步骤2得到的pcr扩增产物，回收酶切产物。
25.4、用限制性内切酶xba与xho双酶切pcambia1307载体，回收载体骨架。
26.5、将步骤3得到的酶切产物和步骤4得到的载体骨架连接，得到重组质粒pcambia1307-ossgd1。根据测序结果，对重组质粒pcambia1307-ossgd1进行结构描述如下：在pcambia1307载体的xba与xho酶切位点之间插入了序列表的序列1第1-2424位核苷酸所示的双链dna分子。重组质粒pcambia1307-ossgd1的元件示意图见图1。
27.二、转基因ossgd1基因水稻的获得1、将重组质粒pcambia1307-ossgd1导入农杆菌lba4404，得到重组农杆菌。
28.2、将步骤1得到的重组农杆菌悬浮于液体asaa培养基中，得到od
600nm
值=0.3的菌液。
29.液体asaa培养基：含2mg/l 2，4-d和100μm/l as的液体nb培养基。
30.3、取水稻02428的种子，用75%乙醇灭菌，然后置于固体nb培养基平板上，28℃暗培养2周，然后将愈伤组织转移到新的固体nb培养基平板上28℃暗培养2周，然后将愈伤组织转移到新的固体nb培养基平板上28℃暗培养2周。
31.4、完成步骤3后，将愈伤组织中自然分散、颜色淡黄的胚性愈伤颗粒置于继代培养基平板上，28℃暗培养3天。
32.继代培养基：含2mg/l 2，4-d的固体nb培养基。
33.5、完成步骤4后，取愈伤组织，置于步骤2得到的菌液中浸泡10-20分钟，其间轻轻摇动。
34.6、完成步骤5后，取愈伤组织，用滤纸吸干表面菌液，然后置于共培养培养基平板上，21℃-22℃暗培养3天。
35.共培养培养基：含2mg/l 2,4-d和100μmas的固体nb培养基。
36.7、完成步骤6后，取愈伤组织，置于筛选培养基平板上28℃暗培养2周，然后将愈伤组织转移到新的筛选培养基平板上28℃暗培养2周，然后将愈伤组织转移到新的筛选培养基平板上28℃暗培养2周。
37.筛选培养基: 含2mg/l 2,4-d和50mg/l 潮霉素的固体nb培养基。
38.8、完成步骤7后，取生长旺盛，呈乳白色或微黄色的新鲜愈伤组织，置于预分化培养基平板上，先28℃暗培养1周再28℃光照培养2周，然后转移到分化培养基平板上， 28℃光照培养，得到分化苗。
39.预分化培养基：含5mg/l aba和0.5mg/l naa的固体nb培养基。
40.分化培养基：含0.5mg/l naa和3mg/l 6-ba的固体nb培养基。
41.9、完成步骤8后，将长势好的分化成苗转移至装有固体ms培养基的三角瓶内，28℃光照培养1-2周后移栽至温室，持续培养至收获种子，即为t1代种子。
42.10、将t1代种子培育为植株，即为t1代植株，t1代植株自交，得到t2代种子。
43.12、将t2代种子培育为植株，即为t2代植株，t2代植株自交，得到t3代种子。
44.13、将t3代种子培育为植株，即为t3代植株。
45.对于某一t1代植株来说，如果满足如下两个条件，该t1代植株即为单拷贝插入的转基因植株：
①
该t1代植株具有潮霉素抗性；
②
该t1代植株自交得到的t2代植株中，潮霉素抗性植株与非潮霉素抗性植株的数量比基本符合3:1。
46.对于某一t2代植株来说，如果满足如下三个条件，该t2代植株及其自交后代为一个纯合的转基因株系：
①
该t2代植株具有潮霉素抗性；
②
其t1代植株为单拷贝插入的转基因植株；
③
其抽样检测的t3代植株均具有潮霉素抗性。
47.三、pcr鉴定随机从步骤三得到的纯合的转基因株系中取2个株系，oe1株系和oe2株系，对t3代植株进行鉴定。将水稻02428作为转基因株系的野生型对照。
48.提取植株幼穗（抽穗前1周）中的总rna，反转录为cdna,将cdna作为模板，通过定量pcr鉴定ossgd1基因的表达水平。
49.pcr鉴定ossgd1基因的引物如下：f2：5'
‑ꢀ
atgtcgacggccgccaaggag-3'；r2：5'
‑ꢀ
ccactgaggagcgctccaaac-3'。
50.将水稻02428植株幼穗中ossgd1基因的表达水平作为1，计算转基因株系的植株幼穗中ossgd1基因的相对表达水平。结果见图2。
51.实施例2 转基因植株中相关基因表达情况的检测供试植株：oe1株系的t3代植株、oe2株系的t3代植株和水稻02428植株（wt）。
52.提取供试幼穗（抽穗前1周）的总rna，反转录为cdna,将cdna作为模板，通过定量pcr鉴定各个相关基因的表达水平。将水稻02428幼穗中基因的表达水平作为1,计算转基因株系的幼穗中该基因的相对表达水平。
53.用于鉴定myc2基因的引物如下：上游引物：5'
‑ꢀ
cggcgccaccaccgtccagga-3'；下游引物：5'
‑ꢀ
gccattagcatggtgatgatga-3'；用于鉴定pr1基因的引物如下：上游引物：5'-gcgctgcaggaggactacgta-3'；下游引物：5'-ccctccggcacaagtataca-3'。
54.用于鉴定ospr4基因的引物如下：上游引物：5'-cttcaagaagatcgacacaga-3'；下游引物：5'-cagagtgccaacctcttcca-3用于鉴定chitinase的引物如下：上游引物：5'-ttggcggcggtgcagtgaaca-3'；下游引物：5'-catgcatatatatcggtttca-3'。
55.将水稻02428植株中的基因表达水平作为1，计算转基因株系中基因的相对表达水平。结果见图4。转基因植株幼穗中的各个细胞壁合成相关基因的相对表达量均高于水稻02428植株中的表达量，表明过表达ossgd1基因可以显著提高pr1等水稻抗病相关基因表达。上述结果显示ossgd1基因对水稻抗病相关基因的表达有重要的影响，过表达ossgd1基
因可以通过增加水稻细胞壁合成及抗病相关基因的表达，进而提高对水稻纹枯病的抗性。
56.实施例3 转基因植株水稻纹枯病抗性分析供试植株：水稻02428植株(wt)、oe1株系的t3代植株和oe2株系的t3代植株。供试植株种植于试验场田间，按生产规范要求种植。
57.图3a是不同材料水稻纹枯病抗性的照片。图3b是不同材料水稻纹枯病抗性的统计分析。与水稻02428相比，转基因植株的发病程度均小于野生型对照，转基因植株发病的严重性也显著低于对照野生型，表明过表达ossgd1基因对提高水稻纹枯病抗病性有重要作用。ossgd1基因可以通过增加水稻抗病相关基因表达，提高水稻纹枯病抗性。
58.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。