一种预测癫痫患儿对丙戊酸耐药性的生物标记物及其应用

1.本发明属于疾病诊断及预测的生物标志物领域，更具体地，涉及一种预测癫痫患儿对丙戊酸耐药性的生物标记物及其应用。


背景技术：

2.癫痫是一种由大脑神经元异常放电引起的慢性疾病，为全球重点防治的五大神经、精神疾病之一。全球约有7000万患者，其中我国患病人数约有1000万，且每年新增人数高达40万。癫痫的反复发作直接损害患者大脑、影响智力，进而导致意识障碍及性格异常，对患者家庭和社会造成严重的精神和经济负担。
3.药物是治疗癫痫的主要方法，但近40-50％的癫痫患者对第一次抗癫痫药物单药治疗无效，30％的患者正确使用2种以上抗癫痫药物治疗后仍无法控制癫痫的发作，称为药物难治性癫痫。药物难治性癫痫是目前抗癫痫治疗急需解决的难点，主要体现在：1)虽然近来不断有新的抗癫痫药物应用于临床，但难治性癫痫的患病率并无变化；2)难治性癫痫的最终诊断通常需要2年以上，在此期间癫痫的反复发作加重患者的脑功能损伤，并延误综合治疗(如手术)的最佳治疗时机。因此，引入药物治疗评估方面的生物标志物以早期预测难治性癫痫具有重要的临床意义。
4.丙戊酸是传统的抗癫痫药物，在临床上应用超过50年，因其具有广泛的抗癫痫作用，目前仍是多种类型癫痫的一线用药。目前，丙戊酸耐药是目前临床上抗癫痫治疗的难点，难治性癫痫患者大多服用2种以上的抗癫痫药物，而丙戊酸往往应用于联合用药的治疗中。研究发现丙戊酸存在明显的个体差异，部分患者对丙戊酸治疗抵抗，而对丙戊酸治疗不敏感的特发性全身性癫痫患者100％后期被诊断为药物难治性癫痫，说明丙戊酸不敏感是预后不良的重要因素。因此，寻找丙戊酸疗效差异的生物标记物对预测药物难治性癫痫具有重要意义。


技术实现要素：

5.针对现有技术的至少一个缺陷或改进需求，本发明提供了一种预测癫痫患儿对丙戊酸耐药性的生物标记物及其应用，其目的在于预测了一种癫痫患儿对丙戊酸耐药性的潜在生物标记物，该生物标记物对于研究丙戊酸耐药的发生机制具有指导意义。
6.为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种预测癫痫患儿对丙戊酸耐药性的生物标记物，其特征在于，所述标记物为p21的mrna表达水平。
7.优选的，所述生物标记物在丙戊酸耐药癫痫患儿中的水平明显高于丙戊酸敏感癫痫患儿中的水平。
8.按照本发明的另一个方面，还提供了一种上述生物标记物在作为预测癫痫患儿对丙戊酸耐药性的标记物中的应用。
9.总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
10.本发明通过应用丙戊酸敏感和丙戊酸耐药的癫痫患儿全血转录组结合癫痫大鼠的转录组进行整合分析，探索能够预测癫痫患儿对丙戊酸反应性的生物标记物，对于研究癫痫患者对丙戊酸耐药的发生机制，以及预测药物难治性癫痫具有重要意义。
附图说明
11.图1是本发明实施例提供的丙戊酸敏感组(n＝3)和耐药组(n＝3)转录组学分析；其中a)全血转录组学-热图；b)全血转录组学-信号通路富集分析；c)海马组织转录组学-热图；d)海马组织转录组学-信号通路富集分析图；
12.图2是本发明实施例提供的丙戊酸敏感组(n＝3)和耐药组(n＝3)大鼠全血和海马组织的共同差异基因；其中a)韦恩图；b)全血和海马组织中12个共同差异基因的表达情况(p《0.05)；
13.图3是本发明实施例提供的p21和plek2基因在丙戊酸敏感和耐药大鼠全血、海马组织和患儿全血中的表达情况；其中a)p21；b)plek2；
14.图4是本发明实施例提供的p21和plek2基因在戊四唑致痫大鼠、丙戊酸敏感和耐药大鼠海马组织中的表达情况(n＝6)；其中a)p21；b)plek2图；
15.图5是本发明实施例提供的p21在戊四唑致痫大鼠、丙戊酸敏感和耐药大鼠海马组织中的表达情况(n＝5)；其中a)尼氏染色(海马dg区)；b)western blot曝光图；c)蛋白表达统计分析图。
具体实施方式
16.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
17.实施例1：预测癫痫患儿对丙戊酸耐药性的生物标记物的筛选
18.本发明第一实施例提供一种预测癫痫患儿对丙戊酸耐药性的生物标记物，该生物标记物的筛选方法如下：
19.本实施例用到的主要试剂如下表所示：
[0020][0021][0022]
本实施例用到的主要仪器如下表所示：
[0023][0024]
本实施例用到的测序接头引物如下表所示：
[0025][0026]
(一)样本采集
[0027]
对大鼠腹腔注射戊四唑28天，建立慢性癫痫大鼠模型，随后给予连续口服丙戊酸14天，分别筛分出丙戊酸敏感和丙戊酸耐药两组大鼠作为样本采集对象，每一组各大鼠3只，样本量n＝3。收集口服丙戊酸第14天的两组大鼠的全血和海马组织样本，-80℃保存。
[0028]
(二)抽提样本中总rna及其质量检测
[0029]
本实施例中采用trizol(invitrogen公司)法提取全血/组织中的总rna，提取步骤如下：
[0030]
(1)提取海马组织rna时，研钵高温高压灭菌，每50-100mg组织液氮研磨后，将粉末用液氮遇冷的药匙转移至预先装有1ml trizol的ep管中，充分混匀(粉末总体积不能超过trizol体积的10％)用1ml trizol试剂裂解；
[0031]
提取全血rna时，在0.5ml小鼠全血中加入3ml的trizol，震荡摇匀，
[0032]
(2)将上述裂解液，室温15-30℃静置5min；
[0033]
(3)加入0.2ml氯仿，震荡摇均匀，室温静置5min后，12000rpm 4℃离心15min；
[0034]
(4)将上清液移至新的1.5ml离心管中，加入等体积-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，冰上静置10min；然后12000rpm 4℃离心10min，弃上清；
[0035]
(5)向沉淀中加入1ml 70％depc-etoh清洗沉淀，12000rpm 4℃离心15min，弃上清保留沉淀，室温干燥10min；
[0036]
(6)加入30μl rnase-free水溶解rna沉淀。
[0037]
基因组dna的去除：本实施例使用dnase i(takara)去除总rna基因组dna，具体操作步骤参考takara反转录试剂盒的操作说明书，本实施例不做累述。
[0038]
rna质量检测：本实施例中分别采用2100bioanalyser(agilent)、nd-2000(nanodrop technologies)方法检测rna样品的od值，以保证使用合格的样品(od260/280＝1.8～2.2,od260/230≥2.0,rin≥6.5,28s:18s≥1.0,》2μg)。质量检测合格的rna样品-80℃保存。
[0039]
(三)总rna检测测序
[0040]
用带有oligo(dt)的磁珠富集rna，向得到的rna中加入fragmentation buffer使其片断成为200bp的短片段，再以片断后的rna为模板，用随机六碱基随机引物(random hexamers)和逆转录酶合成cdna第一链，并加入缓冲液、dntps、rnase h和dna polymerase i合成cdna第二链，经过qiaquick pcr试剂盒纯化并加eb缓冲液洗脱经末端修复、加碱基a，加测序接头，再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，并进行pcr扩增，从而完成整个文库制备工作，构建好的文库用illumina hiseq xten/novaseq 6000测序平台进行进行solexa测序，测序读长为pe 150。
[0041]
(四)原始数据的处理
[0042]
鉴于solexa测序技术所得数据错误率对结果的影响，本实施例使用seqprep和sickle软件对原始数据进行质量预处理和质量评估，划窗去除低质量片段，得到clean的序列数据，并对clean序列进行长度分布统计。
[0043]
数据质量预处理步骤：
[0044]
1)去除低质量read：质量阈值20(错误率＝1％)，比例阈值40％；
[0045]
2)去除reads中含n部分比例较大序列：比例阈值4％；
[0046]
3)去除接头序列(illumina universal adapter agatcggaagagc)。
[0047]
(五)显著差异基因的筛选
[0048]
(1)差异基因分析
[0049]
使用cuffdiff命令做差异分析，首先挑选两个样本中比对reads总和大于或等于10的基因(no test阈值为10)；其次，进行fold change检验；再进行t检验；然后对p值进行fdr校正得到q值；最后，通过t检验的显著差异表达基因(满足校正值q《0.05的基因)
[0050]
(2)差异基因go富集分析
[0051]
采用david在线网站(https://david-d.ncifcrf.gov)，分别对上调和下调差异基因(p《0.05且fold change》2且q《0.05)的生物过程(biological process,bp)、分子功能(molecular function,mf)和细胞组分(cellular component,cc)进行显著性富集的go term，p《0.05的go term定义为差异基因能够显著富集的go term。
[0052]
(3)差异基因pathway显著性富集分析
[0053]
david在线网站(https://david-d.ncifcrf.gov)，同时对上调和下调差异基因(p《0.05且fold change》2且q《0.05)进行kegg通路分析，将p《0.05的通路定义为差异基因中能够显著富集的通路。
[0054]
(五)原始数据的处理数据结果分析
[0055]
通过建立慢性癫痫大鼠模型，筛分出丙戊酸敏感和丙戊酸耐药两组大鼠，对两组大鼠的全血和海马组织进行转录组测序，差异基因go富集分析和pathway显著性富集分析，筛选出显著差异表达基因。
[0056]
(1)丙戊酸敏感和耐药大鼠全血和海马组织的共同差异基因
[0057]
结果表明，如图1所示，在丙戊酸敏感和耐药大鼠全血中共有434个基因的mrna含量存在显著差异(p《0.05)，且差异倍数》1.5倍，其中288个基因(fam131a、f3和p21等)上调，146个基因(ctrb1、fbl和asic4等)下调，差异基因主要富集于28条信号通路(p《0.05)(图1a和b)。
[0058]
两组大鼠海马组织中共有264个差异表达基因(p《0.05)，且差异倍数》1.5倍，其中125个基因(tprkb、krt16和p21等)上调，139个基因(aldh18a1、spatc1l和kdm4d等)下调，差异基因主要富集于13条信号通路(图1c和d)
[0059]
如图2a的韦恩图所示，丙戊酸敏感和耐药大鼠血液和海马组织共有12个共同差异表达基因，分别为p21、aabr070596323、tor3a、sema3g、cdkl1、cpne8、dusp1、chid1、plek2、cdc20、mybl2和kif4a，如图2b所示是全血和海马组织中这12个差异基因的表达情况，其中p21、aabr070596323、tor3a、sema3g、dusp1和plek2基因在丙戊酸耐药大鼠全血和海马组织中的mrna表达均显著高于丙戊酸敏感大鼠，而cpne8基因的表达则相反。
[0060]
(2)丙戊酸敏感和耐药大鼠全血和海马组织中的共同差异基因与丙戊酸患儿全血的差异基因进行对比
[0061]
将上述在全血和海马组织中表达一致的7个显著差异基因(p21、aabr070596323、tor3a、sema3g、dusp1、plek2、cpne8)与丙戊酸患儿全血的差异基因进行对比，丙戊酸患儿全血的差异基因参见本技术发明人发表的文章rna-seq analysis of blood of valproic acid-responsive and non-responsive pediatric patients with epilepsy.(wang yan，zhiping li-exp ther med 2019,18(1):373-383)，结果如图3所述，仅有p21和plek2在丙戊酸耐药患儿全血中的表达明显高于敏感患儿，与大鼠的结果一致。
[0062]
实施例2：从mrna水平和蛋白水平验证两个显著差异基因p21和plek2的表达
[0063]
(一)扩大样本量验证丙戊酸敏感和耐药大鼠海马组织中的p21和plek2的mrna表达
[0064]
采集戊四唑致痫大鼠、丙戊酸敏感大鼠和丙戊酸耐药大鼠的海马组织样本，扩大样本量，构建戊四唑致痫组(pzt)、丙戊酸敏感组(response)和丙戊酸耐药组(nonesponse)作为实验对象，本实施例采用荧光定量pcr方法对戊四唑致痫组、丙戊酸敏感组和丙戊酸耐药组海马组织中p21和plek2的mrna表达进行测定。具体操作步如下：
[0065]
对每份样本的mrna反转录，反应体系包括总rna5ul(约200ng)、dntpmix(100mm)0.15ul、multiscribertenzyme(50u/ul)1.00ul、10
×
rtbuffer 1.5ul、rnase inhibitor 0.19ul、nucleasefreewater 4.16ul、taqmanmicrornaassays 3ul，总体积为15ul。
[0066]
反转录条件：16℃反应30分钟、42℃30分钟、85℃5分钟，然后于4℃保存。
[0067]
每份mrna实时荧光定量pcr检测扩增体系包括taq man universal master mix ii(appliedbiosystems,ca)5ul、taq man microrna assays(appliedbiosystems,ca)0.5ul、ddh2o2.5ul、反转录产物2ul，总体积为10ul。mirna实时荧光定量pcr反应过程为：95℃预变性10分钟、95℃变性15秒及60℃延伸1分钟共40个循环。每个样本进行六次反应，取其平均值。
[0068]
如图4所示是荧光定量pcr验证戊四唑致痫大鼠、丙戊酸敏感大鼠和丙戊酸耐药大鼠的海马组织中p21和plek2的mrna表达情况，结果如图4所示，与戊四唑致痫组(pzt)相比，丙戊酸敏感组(response)和丙戊酸耐药组(nonesponse)p21的mrna表达均降低，且丙戊酸耐药组(nonesponse)p21的mrna表达明显高于丙戊酸敏感组(response)(图4a)，该结果与转录组分析相一致；而丙戊酸敏感组(response)和耐药组(nonesponse)的plek2的mrna表达均升高。上述结果说明，扩大样本量后丙戊酸敏感组(response)和耐药组(nonesponse)大鼠海马组织中p21的mrna表达水平与转录组分析相一致，而plek2则不同。整合转录组分析结果和mrna表达验证结果可以筛选得出p21与丙戊酸的耐药密切相关，p21的mrna表达水平是预测丙戊酸耐药的潜在生物标志物。
[0069]
(二)验证丙戊酸敏感和耐药大鼠海马组织中的p21蛋白表达
[0070]
对戊四唑致痫组(pzt)、丙戊酸敏感组(response)和丙戊酸耐药组(nonesponse)海马组织的石蜡切片进行尼氏染色，尼氏染色步骤如下：
[0071]
1)常规脱蜡至水(二甲苯i、二甲苯ii各15min，然后梯度酒精脱水：100％i、100％ii、95％、90％、80％、70％、50％各5min)
[0072]
2)蒸馏水冲洗3次，每次5min
[0073]
3)然后置于60℃温箱用1％甲苯胺蓝染色40min(或用焦油紫染色30s)
[0074]
4)蒸馏水洗净染料后，于分别置于70％，80％和95％以及100％乙醇中脱水，再用二甲苯透明
[0075]
5)最后用中性树胶封片。
[0076]
在显微镜下观察尼氏染色的结果，结果如图5a所示，与戊四唑致痫组相比，丙戊酸敏感组(response)大鼠dg区的神经元数目明显增加，而丙戊酸耐药组(nosesponse)并无显著变化。
[0077]
用western blot方法验证p21蛋白表达，采用蛋白抽提液和蛋白酶抑制剂提取细
胞总蛋白，bca法测定总蛋白浓度，用western blot方法检测p21的蛋白表达水平。
[0078]
如图5b和c的结果显示，与戊四唑致痫大鼠相比，丙戊酸敏感大鼠海马组织中的p21明显下降，而p21在丙戊酸耐药大鼠海马组织中并无显著变化，且敏感组(response)和耐药组(nosesponse)中p21蛋白的表达存在统计学差异，提示过表达的p21与丙戊酸的耐药密切相关。
[0079]
本技术通过对丙戊酸敏感和耐药大鼠全血和海马组织进行转录组学分析，整合癫痫患儿的全血转录组学结果筛选得到p21在癫痫大鼠和癫痫患儿全血中的高表达与丙戊酸的耐药密切相关，p21的mrna表达水平是预测丙戊酸耐药的潜在生物标志物。
[0080]
本技术实施例中大鼠p21基因的核苷酸序列如序列表id no.1所示；
[0081]
本技术实施例中人p21基因的核苷酸序列如序列表id no.2所示；
[0082]
本技术实施例中大鼠plek2基因的核苷酸序列如序列表id no.3所示；
[0083]
本技术实施例中人plek2基因的核苷酸序列如序列表id no.4所示；
[0084]
本技术实施例中大鼠tor3a基因的核苷酸序列如序列表id no.5所示；
[0085]
本技术实施例中大鼠sema3g基因的核苷酸序列如序列表id no.6所示；
[0086]
本技术实施例中大鼠cdkl1基因的核苷酸序列如序列表id no.7所示；
[0087]
本技术实施例中大鼠cpne8基因的核苷酸序列如序列表id no.8所示；
[0088]
本技术实施例中大鼠dusp1基因的核苷酸序列如序列表id no.9所示；
[0089]
本技术实施例中大鼠chid1基因的核苷酸序列如序列表id no.10所示；
[0090]
本技术实施例中大鼠cdc20基因的核苷酸序列如序列表id no.11所示；
[0091]
本技术实施例中大鼠mybl2基因的核苷酸序列如序列表id no.12所示；
[0092]
本技术实施例中大鼠kif4a基因的核苷酸序列如序列表id no.13所示.
[0093]
本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。
[0094]
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。