一株降解氯苯类化合物和/或二噁英的铜绿假单胞菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及环境微生物处理技术领域，尤其涉及一株降解氯苯类化合物和/或二噁英的铜绿假单胞菌及其应用。


背景技术：

2.氯苯作为一种重要的化工原料，广泛存在于有机合成、医药、农药、染料等生产废水中，给环境造成了不同程度的污染。氯苯作为一种典型的氯代化合物，其化学性质相当稳定，与其他的非氯代化合物相比，具有更高的持久性、更强的毒性和生物积累性，对人体具有致癌作用，被美国环保局(epa)列入优先控制污染物名单。因此氯苯对人体和环境的危害十分严重。目前有许多化学和物理方法可以处理氯苯，虽然其处理工艺简单，处理效率高，但处理成本也高，存在二次污染和反应条件比较苛刻等问题，因此难以在实际应用中取得满意的效果。
3.二噁英(dioxin)是多氯二苯并二噁英(pcdds)和多氯代二苯并呋喃(pcdfs)两类物质的合称，为强致癌、致突变性物质,可严重干扰有机体的内分泌系统，对人类及各类生物均存在严重的健康威胁，是迄今为止毒性最大的化合物之一。环境中绝大部分二噁英存在于大气、土壤和水体之中，性质十分稳定，物理、化学处理方法去除难度较大。而二苯并呋喃往往作为二噁英菌种筛选时的特征模拟物。
4.生物净化法由于其高效、低耗、反应条件温和、二次污染小等优点受到广泛关注。利用微生物来降解有机污染物在国内外已有很多报道，这些报道还筛选出了大量对有机污染物有很好降解作用的微生物。这些微生物主要包括假单胞菌、黄杆菌、芽孢杆菌等。但目前尚未发现能够同时降解氯苯类化合物和/或二噁英的微生物。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一株降解氯苯类化合物和/或二噁英的铜绿假单胞菌及其应用。
6.本发明提供了保藏编号为cgmcc no.22762的铜绿假单胞菌。
7.本发明提供了保藏编号为cgmcc no.22762的铜绿假单胞菌在降解有机污染物中的应用。
8.本发明所述有机污染物为氯苯、邻二氯苯、对二氯苯、二苯并呋喃或二噁英中至少一种。
9.本发明还提供了降解有机污染物的产品，其包括保藏编号为cgmcc no.22762的铜绿假单胞菌。
10.本发明所述的降解有机污染物的产品为菌悬液或冻干粉。
11.本发明还提供了降解有机污染物的产品的制备方法，其包括培养保藏编号为cgmcc no.22762的铜绿假单胞菌，收集菌体。
12.本发明所述的制备方法中，所述收集菌体后，还包括重悬菌体制备菌悬液的步骤；或者还包括将菌体与冻干保护剂混合，经冻干制得冻干粉的步骤。
13.本发明还提供了所述的菌悬液的制备方法，将菌液离心取菌体，用灭菌的无机盐培养基冲洗并悬浮菌体获得菌悬液。
14.本发明中所述培养的无机盐培养基包括水和0.3g/l～0.7g/l kh2po4，0.3g/l～0.7g/l k2hpo4，0.1g/l～0.3g/l mgso4，0.01g/l～0.3g/l cacl2，0.1g/l～0.3g/l nacl，0.01g/l～0.1g/l mnso4，0.01g/l～0.1g/l fecl2，ph 6～8。
15.本发明还提供了一种降解有机污染物的方法，以所述的降解有机污染物的产品，对有机污染物进行处理。
16.本发明中所述方法降解的有机污染物为氯苯类化合物、邻二氯苯、对二氯苯、二苯并呋喃或二噁英中至少一种。
17.本发明所述降解有机污染物的方法中，所述处理的条件的温度为35℃、ph值为7。所述处理的条件还包括160rpm振荡。
18.本发明筛选得到的保藏编号为cgmcc no.22762的铜绿假单胞菌，该菌种可以在包括水和0.3g/l～0.7g/l kh2po4，0.3g/l～0.7g/l k2hpo4，0.1g/l～0.3g/l mgso4，0.01g/l～0.3g/l cacl2，0.1g/l～0.3g/l nacl，0.01g/l～0.1g/l mnso4，0.01g/l～0.1g/l fecl2，ph 6～8的培养基中生长。
19.本发明所述的保藏编号为cgmcc no.22762的铜绿假单胞菌菌株为驯化培养获得。所述驯化培养，采用逐步提高有机污染物浓度的方法进行。
20.本发明所述的驯化培养方法包括，将石化和/或农化活性污泥水样品依次经含有50mg/l、100mg/l、300mg/l、600mg/l、800mg/l、1000mg/l有机污染物的液体无机盐培养基培养，筛选获得能够降解有机污染物的菌株。
21.所述培养的条件包括37℃，170rpm摇床振荡培养5天。
22.本发明中，将筛选获得的菌株经鉴定为铜绿假单胞菌，将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.22762。
23.作为可对环境污染物进行降解的重要菌株，本发明所述的铜绿假单胞菌具有较强的降解能力，降解物质种类广泛，并且具有极强的环境适应能力。相对于现有技术而言，本发明所述铜绿假单胞菌降解能力更快更强，对600mg/l氯苯的降解率48h即可达到96.47％，且本发明所述铜绿假单胞菌耐受性强，对1000mg/l氯苯仍有降解效果。除氯苯外，本发明所述铜绿假单胞菌对二氯苯和二苯并呋喃(二噁英模拟物)也有很好的降解效果，对300mg/l二氯苯降解率可达到82.63％，对1500mg/l二苯并呋喃的降解效果在50％以上，对二氯苯和二苯并呋喃的耐受浓度分别高达500mg/l和2500mg/l。此外，本发明所述铜绿假单胞菌在应用中，菌株发酵培养时使用相应有机污染物进行驯化，降解效果更佳。综上，本发明获得的铜绿假单胞菌具有降解效率高、耐受性强且具有极强的环境适应能力等优点，可广泛用于氯苯类及二噁英等其他有机污染物的降解，具有良好的应用前景。
24.生物保藏说明
25.生物材料：yjy21-07，分类命名：铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosa，于2021年6月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.22762。
附图说明
26.图1示铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosa菌种分离纯化菌落；
27.图2示铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosa在1000mg/l氯苯降解体系中菌液浓度变化；
28.图3示铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosa在降解含氯苯农化废水小试应用。
具体实施方式
29.本发明提供了一株降解氯苯类化合物和/或二噁英的铜绿假单胞菌及其应用，下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
30.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
31.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
32.实施例1：本发明所述铜绿假单胞菌的筛选、分离与鉴定
33.a、菌株的富集与驯化培养
34.无机盐培养基组成：0.5g/l kh2po4，0.5g/l k2hpo4，0.2g/l mgso4，0.1g/l cacl2，0.2g/l nacl，0.02g/l mnso4，0.05g/l fecl2，添加氯苯(按实验要求配置不同质量浓度，包括以50mg/l、100mg/l、300mg/l、600mg/l、800mg/l、1000mg/l)后蒸馏水定容至1000ml，ph为7。
35.采用逐步提高氯苯浓度的方法进行驯化培养。具体的操作方法：取石化、农化活性污泥样品10ml，接种于100ml含氯苯的无机盐培养液(氯苯初始浓度为50mg/l)中，37℃170rpm摇床振荡培养5天。取出10ml菌液接种到新鲜含氯苯的无机盐培养基中(氯苯浓度为100mg/l)。重复上述步骤，以50mg/l、100mg/l、300mg/l、600mg/l、800mg/l、1000mg/l为梯度，逐步提高培养基中氯苯的浓度，直到氯苯浓度为1000mg/l为止。
36.b、菌种的分离筛选
37.分别在含氯苯浓度为50mg/l、100mg/l、300mg/l、600mg/l的无机盐固体培养基上，采用稀释涂布平板法进行分离纯化，将获得的8株菌接种至以氯苯为唯一碳源和能源的无机盐固体培养基中进行效果验证，最终获得一株具有高效氯苯降解活性的菌株yjy21-07，该菌分离纯化菌种(见图1)。
38.c、菌种保藏与鉴定
39.将最终获得的菌株yjy21-07进行甘油管与斜面保藏，委托济南博尚生物工程有限公司进行pcr扩增以及测序，获得16s rdna序列如下，经鉴定为铜绿假单胞菌。
40.实施例2：本发明所述铜绿假单胞菌yjy21-07的效果验证
41.将实施例1中分离纯化获得的8株菌接种至以氯苯为唯一碳源和能源的所述液体无机盐培养基中进行效果验证，氯苯浓度为600mg/l左右，采用顶空气相色谱法检测氯苯含量，结果表明菌株yjy21-07对氯苯的降解效果最好，600mg/l氯苯48h降解率达到85.26％，菌株yjy21-07即为本发明所述铜绿假单胞菌。
42.表1本发明所述实施例1中8种菌株对600mg/l氯苯48h降解情况
43.菌株剩余氯苯浓度mg/l氯苯降解率％空白529/146911.34233436.86324952.93420361.63529144.99626150.6677885.26826250.47
44.注：降解率＝(1-实验组氯苯浓度/空白氯苯浓度)
×
100％。
45.实施例3：本发明所述铜绿假单胞菌yjy21-07对氯苯的降解特性
46.将本发明所述铜绿假单胞菌yjy21-07菌悬液接种至所述液体无机盐培养基中，加入氯苯，在25℃～35℃、160rpm、ph6～8条件下进行降解反应。所述无机培养基为0.5g/l kh2po4，0.5g/l k2hpo4，0.2g/l mgso4，0.1g/l cacl2，0.2g/l nacl，0.02g/l mnso4，0.05g/l fecl2，蒸馏水定容至1l，ph 7。菌悬液的制备方式为将菌液离心取菌体，用灭菌的无机盐培养基冲洗并悬浮菌体获得菌悬液。
47.a、最适作用温度与ph值
48.设定摸索条件(温度30℃、35℃；ph6、7、8)，测定本发明所述铜绿假单胞菌对600mg/l氯苯48h降解率来获得最适作用条件，结果表明温度、ph值对降解率有一定影响，最适作用条件为35℃、ph7，此时48h降解率为92.25％。
49.表2本发明所述铜绿假单胞菌最适作用温度与ph
50.组别参数氯苯浓度mg/l降解率％空白35℃ ph7542/130℃ ph79083.39235℃ ph74292.25335℃ ph68484.50435℃ ph87685.98
51.注：降解率＝(1-实验组氯苯浓度/空白氯苯浓度)
×
100％。
52.b、菌株的培养
53.菌株的培养方式为两种：
54.方法1为将本发明所述铜绿假单胞菌接入普通lb液体培养基中培养24h。
55.方法2为将本发明所述铜绿假单胞菌接种至所述无机盐液体培养基中。
56.加入100mg/l氯苯优先进行驯化培养24h。分别将上述两种方法培养的菌液离心取菌体，用灭菌的无机盐培养基冲洗并悬浮菌体，在相同条件下验证不同培养方式(方法1和方法2)对氯苯降解率的影响，结果表明，使用氯苯对菌株进行驯化培养，降解效果明显优于直接培养，本发明所述铜绿假单胞菌对600mg/l氯苯48h降解率最终达到96.47％。
57.表3本发明所述铜绿假单胞菌培养方式的影响
58.组别氯苯浓度mg/l降解率％空白539/方法112377.18方法21996.47
59.注：降解率＝(1-实验组氯苯浓度/空白氯苯浓度)
×
100％。
60.c、耐受性
61.将本发明所述铜绿假单胞菌分别于800mg/l、1000mg/l的无机盐平板划线培养，37℃培养24h后菌落长出，但长势变慢，菌落形态发生变化，将氯苯降解菌培养并转接至含800mg/l、1000mg/l氯苯的降解体系，菌液变混浊(见图2)，72h降解率分别为24.65％和11.24％。结果表明氯苯降解菌虽可耐受800mg/l、1000mg/l氯苯，但降解作用变弱。
62.表4本发明所述铜绿假单胞菌耐受性
[0063][0064]
注：降解率＝(1-实验组氯苯浓度/空白氯苯浓度)
×
100％。
[0065]
实施例4：本发明所述铜绿假单胞菌yjy21-07对二氯苯的降解特性
[0066]
将本发明所述铜绿假单胞菌yjy21-07菌悬液接种至无机盐培养液中，加入邻二氯苯/对二氯苯，在35℃、160rpm、ph7条件下进行降解反应。所述无机培养液为0.5g/l kh2po4，0.5g/l k2hpo4，0.2g/l mgso4，0.1g/l cacl2，0.2g/l nacl，0.02g/l mnso4，0.05g/l fecl2，蒸馏水定容至1l，ph 7。
[0067]
菌悬液的制备方式为将本发明所述铜绿假单胞菌接种至所述无机盐培养液中，加入100mg/l邻二氯苯/对二氯苯，优先进行驯化培养24h，将菌液离心取菌体，用灭菌的无机盐培养基冲洗并悬浮菌体获得菌悬液。本发明所述铜绿假单胞菌对300mg/l～500mg/l邻二氯苯和对二氯苯降解效果分别如表5、6所示：
[0068]
表5本发明所述铜绿假单胞菌yjy21-07对300mg/l～500mg/l邻二氯苯降解效果(72h)
[0069][0070]
表6本发明所述铜绿假单胞菌对300mg/l～500mg/l对二氯苯降解效果(72h)
[0071]
序号组别72h对二氯苯含量/mg/l72h降解率/％1300mg/l空白259/2300mg/l菌4582.634400mg/l空白370/
6400mg/l菌17153.787500mg/l空白464/8500mg/l菌32031.03
[0072]
结果表明本发明所述铜绿假单胞菌对对二氯苯的降解效果明显优于对邻二氯苯的降解效果，对二氯苯300mg/l、400mg/l、500mg/l 72h降解率分别为82.63％、53.78％、31.03％；对邻二氯苯300mg/l、400mg/l、500mg/l 72h降解率分别为57.56％、34.97％、1.5％。
[0073]
实施例5：本发明所述铜绿假单胞菌yjy21-07对二苯并呋喃(df)的降解特性
[0074]
在筛选降解二苯并呋喃(df)降解菌时，发现本发明所述铜绿假单胞菌降解效果较好。将本发明所述铜绿假单胞菌yjy21-07菌悬液接种至无机盐培养液中，加入二苯并呋喃(df)，在35℃、160rpm、ph7条件下进行降解反应。所述无机培养液为0.5g/l kh2po4，0.5g/l k2hpo4，0.2g/l mgso4，0.1g/l cacl2，0.2g/l nacl，0.02g/l mnso4，0.05g/l fecl2，蒸馏水定容至1l，ph 7。菌悬液的制备方式为将本发明所述铜绿假单胞菌接种至所述无机盐培养液中，加入100mg/l二苯并呋喃(df)，优先进行驯化培养24h，将菌液离心取菌体，用灭菌的无机盐培养基冲洗并悬浮菌体获得菌悬液。最终采用乙酸乙酯萃取后进行气相色谱的方法进行效果检测。结果如下表7所示：
[0075]
表7本发明所述铜绿假单胞菌对二苯并呋喃(df)降解效果(72h)
[0076] 空白含量mg/l72h df含量mg/l72h降解率％500mg/l4823892.121000mg/l85733760.681500mg/l110849954.96
[0077]
结果表明本发明所述铜绿假单胞菌对500mg/l～1500mg/l二苯并呋喃df，72h降解率均在50％以上，其中1000mg/l、1500mg/l二苯并呋喃df72h降解率分别为60.68％、54.96％。
[0078]
另外本发明所述铜绿假单胞菌对2500mg/l二苯并呋喃df，120h降解率为63.45％，表明本发明所述铜绿假单胞菌对2500mg/l二苯并呋喃仍有降解效果。
[0079]
实施例6：本发明所述铜绿假单胞菌yjy21-07对含氯苯农化废水的小试应用
[0080]
利用a2o生化模拟设备进行小试应用实验(见图3)，验证本发明所述铜绿假单胞菌yjy21-07对含氯苯农化废水的处理效果，进水量25l/天，体系停留时间为3天，向好氧池中加入5
‰
的本发明所述铜绿假单胞菌yjy21-07菌悬液(制备过程同实施例3)，调试运行参数如下：do为2mg/l～4mg/l，污泥浓度为3g/l～5g/l，ph 6～8，温度25℃
±
1℃。进水氯苯含量为380mg/l装置稳定运行后，出水氯苯含量低于3mg/l，氯苯去除效率可达到99％以上。
[0081]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。