一种快速鉴定和纯化甜瓜亲本P149的分子标记的制作方法

一种快速鉴定和纯化甜瓜亲本p149的分子标记
技术领域
1.本发明涉及作物遗传育种技术领域，更具体的说是涉及一种快速鉴定和纯化甜瓜亲本p149的分子标记。


背景技术：

2.本发明涉及作物遗传育种分析过程中，亲本的纯度鉴定和纯化环节。甜瓜经济效益高，爬地栽培每亩收益5000-6000元，是重要的经济作物。培育耐低温弱光性能强、适宜早春栽培的甜瓜新品种，是确保甜瓜提早上市、周年供应、增加农民收益的重要举措。
3.利用分子标记辅助选育甜瓜新品种，能够缩短育种周期，提高选育效率，但是连锁标记的开发，有赖于利用纯合的、具极端性状的甜瓜亲本构建遗传群体。前期研究(甜瓜耐低温弱光生理指标数据处理及极端材料筛选，华北农学报，2020183-188，宋慧等)发现p149对低温弱光环境(光照4000lux，温度15/8℃，光周期12/12h)表现敏感，是筛选甜瓜耐低温弱光特性紧密连锁分子标记的极端亲本之一。
4.极端亲本的纯度，会直接影响标记开发的准确性和效率。亲本纯度越高，亲本的极端表型越稳定，双亲之间筛选到的多态性标记也越稳定；构建的遗传群体重组交换明显，表型分离更加符合正态分布。如果亲本不纯，亲本的极端表型不稳定，双亲之间筛选到的多态性标记会随着亲本单株变化而变化；通过杂交获得的遗传群体表型偏分离。因此，注意和保持甜瓜极端亲本的纯度，是开发甜瓜紧密连锁分子标记环节必须认真解决的重要问题。
5.在利用p149筛选双亲多态性分子标记的过程中，我们发现，筛选结果会随着p149单株dna的更换而出现多态性消失的问题。p149群体单株果实表型差异不显著，通过表型观察难以去杂。一旦选择杂合p149单株进行标记筛选，或者进行后续的杂交或者自交，都会因为杂合体分离产生混杂。
6.因此，p149纯度不高，提纯困难，严重影响利用p149开发甜瓜耐低温弱光分子标记的进程，亟需建立一种快速鉴定和纯化甜瓜亲本p149的方法。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明提供了一种快速鉴定和纯化甜瓜亲本p149的分子标记。在短时间内可以纯化甜瓜亲本p149。
8.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.一种快速鉴定和纯化甜瓜亲本p149的分子标记，包括以下分子标记的组合：ssr1/2、ssr3/4、ssr5/6、ssr7/8、ssr9/10、ssr11/12、ssr13/14、ssr15/16、ssr17/18、ssr19/20和ssr21/22；扩增所述分子标记德引物核苷酸序列如下：
10.ssr1/2上游引物序列为5
’‑
gaaagaatgggggaaaagag-3’，如seq id no.1所示；
11.ssr1/2下游引物序列为5
’‑
accaatccatcactctcact-3’，如seq id no.2所示；
12.ssr3/4上游引物序列为5
’‑
cgatcttctttattcttcgcc-3’，如seq id no.3所示；
13.ssr3/4下游引物序列为5
’‑
gctgtaaaacgaaacggaga-3’，如seq id no.4所示；
14.ssr5/6上游引物序列为5
’‑
ccatctcttaactttctctc-3’，如seq id no.5所示；
15.ssr5/6下游引物序列为5
’‑
tacattatgggtaaggtaag-3’，如seq id no.6所示；
16.ssr7/8上游引物序列为5
’‑
tctcttaactttctctctcc-3’，如seq id no.7所示；
17.ssr7/8下游引物序列为5
’‑
gggccattttctttttacat-3’，如seq id no.8所示；
18.ssr9/10上游引物序列为5
’‑
ggacaatttagggaggatc-3’，如seq id no.9所示；
19.ssr9/10下游引物序列为5
’‑
cactaccttaaaacagaattg-3’，如seq id no.10所示；
20.ssr11/12上游引物序列为5
’‑
attcgtagttcatactctctttctc-3’，如seq id no.11所示；
21.ssr11/12下游引物序列为5
’‑
cggagaagaaggaagggttttaag a-3’，如seq id no.12所示；
22.ssr13/14上游引物序列为5
’‑
ctccccagtgtatcagccaaatctc-3’，如seq id no.13所示；
23.ssr13/14下游引物序列为5
’‑
aacgggattttggaggcatattcgg-3’，如seq id no.14所示；
24.ssr15/16上游引物序列为5
’‑
tgggaaagaaagagaatcaaaa-3’，如seq id no.15所示；
25.ssr15/16下游引物序列为5
’‑
aaagaaagaaacgcaacttcg-3’，如seq id no.16所示；
26.ssr17/18上游引物序列为5
’‑
aatggaaaagggaagtgcaa-3’，如seq id no.17所示；
27.ssr17/18下游引物序列为5
’‑
tttcactttttcccgccg-3’，如seq id no.18所示；
28.ssr19/20上游引物序列为5
’‑
cgaatgtgaaatctcttctccc-3’，如seq id no.19所示；
29.ssr19/20下游引物序列为5
’‑
tatgaagcgcgcataaacag-3’，如seq id no.20所示；
30.ssr21/22上游引物序列为5
’‑
ggattcctcttctccttttgct-3’，如seq id no.21所示；
31.ssr21/22下游引物序列为5
’‑
tatgaagcgcgcataaacag-3’，如seq id no.22所示。
32.本发明还提供了一种利用上述的分子标记快速鉴定和纯化甜瓜亲本p149的方法，包括以下步骤：
33.(1)利用分子标记ssr1/2、ssr3/4、ssr5/6、ssr7/8、ssr9/10、ssr11/12、ssr13/14、ssr15/16、ssr17/18、ssr19/20和ssr21/22对p149f4代单株进行扩增、筛选纯合单株，自交获得f5代；
34.(2)利用分子标记ssr1/2，ssr9/10、ssr11/12、ssr19/20和ssr21/22对f5代单株进行扩增、筛选纯合单株，自交获得f6代；
35.(3)利用分子标记，ssr1/2，ssr9/10、ssr11/12、ssr19/20和ssr21/22对f6代单株进行扩增、筛选即得纯化单株。
36.有益效果在于：经过对标记筛选出来纯合单株不断自交，p149的群体逐步趋于纯合，原来的杂合位点逐渐减少，转变为纯合位点。原来用以鉴定杂合位点的标记就不能区分纯合单株和杂合单株而被淘汰，最后剩下5对ssr标记，还可以在f5代中检测到杂合单株。
37.优选的：扩增：体系为15μl，包括1.5μl 2.5mm dntp，1.5μl 10
×
buffer，1.8μl 25mm mgcl2，1μl 2.5mm上游引物，1μl 2.5mm下游引物，5μl 10ng/μl dna，0.05μl 1u taq，
3.15μl超纯水；
38.pcr扩增程序为：预变性94℃1min；变性93℃1min，退火50℃1min，延伸72℃2min(40个循环)；延伸72℃1min。
39.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种快速鉴定和纯化甜瓜亲本p149的分子标记，取得的技术效果为能够在苗期从dna层面，短时间对甜瓜p149的分离群体进行分子标记鉴定，有效区分杂合单株和纯合单株，有目的地选择纯合单株，连续自交2代，即可获得纯系，减少杂合单株的误选，提高亲本提纯的效率。该分子标记是通过p149多世代分离群体筛选获得的，检测p149纯杂效率高。相比于利用表型鉴定筛选纯合单株，无需大田定植甜瓜，结果准确。
附图说明
40.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
41.图1附图为本发明提供的11个分子标记在14个p149的f4代单株中扩增的结果图。
42.图2附图为本发明提供的5个分子标记在22个p149的f5代单株中扩增的结果图，
43.图3附图为本发明提供的5个分子标记在93个p149的f6代单株中扩增的结果图。
44.图4附图为本发明提供的不同分型对应的具体单株编号和数目示意图。
45.图5附图为本发明提供的三种类型分别自交混收实物图。
具体实施方式
46.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
47.本发明实施例公开了一种快速鉴定和纯化甜瓜亲本p149的分子标记。
48.前期准备：p149自交一次作为f1代，自交两次作为f2代，自交三次作为f3代，依此类推获得后代种子。
49.实施例中甜瓜p149自交提纯过程：
50.分别播种p149的f4、f5和f6代种子14粒、22粒和93粒。
51.播种f4代14株，通过分子标记扩增，筛选到f4代中的纯合单株，进行自交，得到f5代，种子混收。
52.播种f5代22株，通过分子标记扩增，筛选到f6代中的纯合单株，进行自交，混合收种，即为p149的纯系。
53.实施例1
54.取样
55.对甜瓜p149的每一代分离群体，进行单株取样。植株子叶平展，第一片新叶展开，采集新叶1g，-80℃保存。
56.dna提取：
57.参照ctab法(murray hg,thompson wf.rapid isolation ofhigherweight dna.nucleic acids res,1980,8:4321)，提取新鲜叶片总基因组dna。
58.pcr扩增：
59.混样体系为15μl，包括1.5μl dntp(2.5mm)，1.5μl 10
×
buffer，1.8μlmgcl2(25mm)，2μl引物(5mm；ssr两条引物分别添加1.0μl)，5μl dna(10ng/μl)，0.05μl taq(1u)，3.145μl超纯水。
60.pcr扩增程序为：预变性94℃1min；变性93℃1min，退火50℃1min，延伸72℃2min(40个循环)；延伸72℃1min。
61.pcr产物检测：
62.使用2.5％高分辨率标准凝胶琼脂糖(dna片段分离范围40～1000bp)。添加20μl eb(ethidium bromide，溴化乙锭)显色。在pcr产物中加入2μlloading dye，电泳2～3小时，电压200v。电泳结束后，利用凝胶成像系统观察结果。
63.数据收集与分析：
64.分子标记为共显性的分子标记，能够区分杂合位点和纯合位点。扩增出两个或两个以上多态性位点的，为杂合单株，仅有一个多态性位点扩增出来的，为纯合单株。
65.始终选择仅有一个多态性位点扩增出来的纯合单株，进行后续自交。
66.使用分子标记，检测p149的f4、f5和f6代纯合单株，每个世代检测的株数、检测到的纯合单株数、杂合单株数目，以及分子标记的数目见表1。引物序列见表2。
67.具体如下：
68.(1)分子标记在14个p149的f4代单株中的扩增和筛选结果
69.利用11个ssr分子标记，ssr1/2、ssr3/4、ssr5/6、ssr7/8、ssr9/10、ssr11/12、ssr13/14、ssr15/16、ssr17/18、ssr19/20和ssr21/22，在14个p149的f4代单株中扩增(图1)，赋值结果见表3。筛选到1个纯合单株，编号为2号，自交后留种，得到f5代。
70.(2)分子标记在22个p149的f5代单株中的扩增和筛选结果
71.利用5个ssr分子标记，ssr1/2，ssr9/10、ssr11/12、ssr19/20和ssr21/22，在22个p149的f5代单株中扩增(图2)，赋值结果见表4。筛选到16个纯合单株，自交后留种，得到f6代。
72.(3)分子标记在93个p149的f6代单株中的扩增和筛选结果
73.利用5个ssr分子标记，ssr1/2，ssr9/10、ssr11/12、ssr19/20和ssr21/22，在93个p149的f6代单株中扩增(图3)，赋值结果见表5。筛选到74个纯合单株，19个杂合单株。
74.根据带型差异，利用聚类分析软件ntsys 2.10，对这74纯合单株进行分子聚类图绘制，得到三种类型的纯系(图4～5)，分别自交后混合留种。杜绝了三种类型混收后，在后续系内自交过程中，造成的二次杂合，确保纯系纯度。
75.表1利用分子标记检测p149的各世代纯合单株的结果
76.p149检测株数纯合单株数杂合单株数有效标记数目f4代1411311f5代221665f6代9374195
77.表2
[0078][0079][0080]
表3 11个分子标记在14个p149的f4代单株中扩增的赋值结果
[0081][0082]
其中，编号为2号的单株没有杂合位点，确定为纯合单株。
[0083]
表4 5个分子标记在22个p149的f5代单株中扩增的赋值结果
[0084][0085][0086]
其中编号为2、7、8、9、12和17号的单株存在杂合位点，确定为杂合单株，其余16个单株没有检测达到杂合位点，确定为纯合单株。
[0087]
表5 5个分子标记在22个p149的f5代单株中扩增的赋值结果
[0088]
[0089][0090]
注：编号为2、5、7、8、27、34、35、47、52、56、57、58、64、67、73、76、82、88、和93号的单株存在杂合位点，确定为杂合单株，其余74个单株没有检测达到杂合位点，确定为纯合单株。
[0091]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0092]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。