一株圆红球菌噬菌体P19及其应用

一株圆红球菌噬菌体p19及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一株圆红球菌噬菌体p19及其应用。


背景技术：

2.活性污泥法是污水处理常用的好氧生物处理方法，利用微生物活性以及絮凝作用来去除水中的可生化有机物与悬浮固体物质。因微生物聚集成团，呈泥花状，故称之为活性污泥法。
3.污泥发泡与污泥膨胀是影响其稳定运行的主要问题。泡沫污泥会降低曝气池的溶解氧量、影响出水水质、泡沫腐败将散发难闻气体等。污泥发泡是一种浮选过程，需要气泡、表面活性剂和疏水颗粒——通常情况下是细菌细胞。丝状菌作为活性污泥絮体的骨架，附着了大量能够形成菌胶团的功能微生物。多种丝状细菌的不正常增殖均可造成污泥发泡或膨胀。生物泡沫问题基本上由2种丝状细菌类型造成，分别是诺卡氏型丝状细菌(nocardioform filamentous bacteria)和微丝菌(candidatus microthirx parvicella)。任何控制策略都应该要针对这些细菌成分，因为气泡和洗涤剂在污水处理中并不能完全消除。尽管已经有一些解决策略出现(如调控污泥龄、人工或机械消泡等等)，但大多针对性太强且无法彻底根治发泡事件，并没有一种通用的方法来控制废水处理厂中的泡沫，这种情况可能反映了我们目前对所涉及的细菌缺乏了解。
4.噬菌体是一种特异性较强的细菌病毒，能够侵入并裂解他们的宿主。利用这一特点，早期的研究已经成功地分离出了感染许多能够引起污泥发泡的细菌的噬菌体。但目前还没有圆红球菌噬菌体的分离报道。圆红球菌属于诺卡菌科放线菌目，是一类表面疏水的革兰氏阳性好氧菌。属于上述的诺卡氏型丝状细菌，其细胞疏水性可达31％～60％。在实验室发泡能力测试中，对圆红球菌进行曝气，2分钟内泡沫高度稳定在5～10cm之间，停止曝气后泡沫能够稳定存在。
5.因此，提供一株圆红球菌噬菌体p19及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一株圆红球菌噬菌体p19及其应用。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一株圆红球菌噬菌体p19，其保藏编号为cgmcc no.23087，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年9月7日，分类命名为噬菌体，具体为圆红球菌肌尾噬菌体。
9.进一步，所述的一株圆红球菌噬菌体p19在裂解圆红球菌中的应用。
10.进一步，所述的一株圆红球菌噬菌体p19在污水处理系统中防治和去除圆红球菌中的应用。
11.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株圆红球菌噬
菌体p19及其应用，为污泥发泡与病原菌的防控提供一种可选择的基础材料，丰富噬菌体种库；通过对圆红球菌噬菌体p19的分离鉴定和全基因组测序，进一步深入挖掘其功能基因和蛋白，为噬菌体治疗和生物防治提供一种或多种对红球菌具有裂解作用的酶类等，以此扩大宿主谱，提高噬菌体应用的广泛性和有效性；圆红球菌噬菌体p19可快速高效裂解圆红球菌，可用于污水处理系统中圆红球菌的污染防治。
附图说明
12.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
13.图1附图为本发明圆红球菌噬菌体p19的双层平板噬菌斑形态；
14.图2附图为本发明圆红球菌噬菌体p19透射电镜形态；比例尺为200nm；
15.图3附图为本发明圆红球菌噬菌体p19基因组圈图；
16.图4附图为本发明圆红球菌噬菌体p19基因组系统进化树。
具体实施方式
17.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
18.噬菌体宿主菌圆红球菌4.1819由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供，并由本实验室保存。
19.胰蛋白胨、酵母提取物购自oxoid公司；葡萄糖、无水氯化钙购自麦克林公司；peg8000购自amresco公司；dnase、rnasea购自sigma公司；蛋白酶k购自amresco公司；0.22μm微孔滤膜购自上海市新亚净化器件厂；氯仿、平衡饱和酚购自北京鼎国生物技术有限公司。
20.实施例1噬菌体的分离纯化
21.pyca液体培养基的配制：
22.在1l ddh2o中加入1g葡萄糖、1g酵母提取物、15g胰蛋白胨，混匀后121℃高压灭菌20min。冷却后加入4.5ml浓度为1mol/l的氯化钙溶液。
23.pyca固体培养基的配制：
24.在1l ddh2o中加入1g葡萄糖、1g酵母提取物、15g胰蛋白胨，15g琼脂粉，混匀后121℃高压灭菌20min。在未凝固状态下加入4.5ml浓度为1mol/l的氯化钙溶液。
25.pyca半固体培养基的配制：
26.在1l ddh2o中加入1g葡萄糖、1g酵母提取物、15g胰蛋白胨，7.5g琼脂粉，混匀后121℃高压灭菌20min。在未凝固状态下加入4.5ml浓度为1mol/l的氯化钙溶液。
27.本发明试验用污水样品为2020年9月采集于北京市某渔场中，以此作为分离噬菌体的水样。
28.取10ml污水样本，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌；加入20ml pyca液体培养基，再加入对数期宿主菌悬液2.0ml于50ml离心管中，混匀；静置15min后，30℃振荡过夜(10h)。次日，4℃，8000g离心10min；取上清，上清即为含有此宿主菌噬菌体的原液。采用spot-test方法鉴定原液中是否含有噬菌体，取适量上述原液点滴到涂布了宿主菌的pyca固体培养基上，30℃倒置培养48h，观察有无噬菌斑长出。若平板上出现清晰透亮的噬菌斑，则说明原液中存在噬菌体，反之，则表明未分离出噬菌体，需重新采样分离。
29.分离出的噬菌体未必为单一噬菌体，本发明采用双层平板法进一步纯化。挑取平板上的噬菌斑，浸置于含有1ml sm液的无菌管中，室温放置1h后，十倍梯度稀释至10-6
。取0.5ml稀释后的溶液与1ml宿主菌悬液加入5ml管内，紧接着加入3.5ml pyca半固体培养基，而后迅速倒入pyca固体培养基中，使之涂布于整个双层平板。30℃培养48h，观察噬菌斑生长情况。而后挑取单一噬菌斑，重复此步骤5-6次，直至双层平板中各噬菌斑的大小和形态基本一致，见图1。
30.实施例2噬菌体的形态观察
31.取噬菌体悬液20μl滴于铜网上，待其自然沉淀10min后，用干燥滤纸从侧面吸干，晾置约1min后在铜网上加1滴1％醋酸双氧铀，染色2min，然后小心使用干燥滤纸从侧面将多余染剂吸干，避光自然晾置30min后，用透射电子显微镜(jem-1400)观察。
32.透射电镜结果见图2，结果显示，噬菌体p19有球形头部和较短的尾部，且头部外似乎存在一层类似包膜的物质；具体尺寸为：头部直径约55.44nm，尾长约107.94nm，尾部直径约为11.11nm。根据国际病毒分类学组织(ictv)病毒分类第八次报告，可初步将该株噬菌体p19归类为肌尾噬菌体科。
33.实施例3噬菌体基因组分析鉴定
34.噬菌体全基因组测序及分析：采用illuminanextseq500进行pe 2
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150对样品的dna进行测序。随后利用spades v.3.11.1拼接软件对优化序列进行拼接，得到最优的组装结果。利用生物软件phaster对基因组的开放阅读框进行预测分析，并使用ncbi blastp完成功能基因的初步注释，使用trnascan-se(http://lowelab.ucsc.edu//trnascan-se/)在线预测trna，利用cgview server软件(http://cgview.ca/)完成全基因组圈图的绘制(见图3)，基于全基因组数据利用mega x软件构建系统进化树(见图4)。
35.噬菌体p19基因组大小为17065bp。从blast比对结果来看，它似乎是一株高度新颖的噬菌体，与其同源性最高的是噬菌体rhodococcus phage toil(74.46％)，其宿主为rhodococcus opacus。用prokka预测cds区域，发现编码32个cds，无trna序列。从匹配结果来看，该基因组具有典型的噬菌体模块化结构。包括dna复制模块、结构蛋白基因、裂解模块以及dna包装基因组成。
36.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。