一株耐铅铜微星藻属微藻的分离和应用

1.本发明涉及环境微生物技术领域，尤其涉及一株耐铅铜微星藻属微藻的分离和应用。


背景技术：

2.可饮用水资源是人类生存的基本需求。随着工业化进程和人类城市废水的排放，淡水水体和海洋环境承受的净化压力越来越大。许多的人类生产活动都会造成水体中重金属的累积。自然环境的变化，如阳光、温度和水体酸化，进一步提高了水体中重金属的溶解度进而提升了水体毒性。铜和铅是水体中最常见的重金属污染。浮游植物，如微藻，通过调节其生理状态和遗传结构以适应污染水体。
3.重金属污染对生物体构成严重的健康风险，并且由于重金属(hms)的高毒性以及它们的不可生物降解性以及在食物链和生物体中的累积性，对环境和人类健康造成严重威胁。因此，环境重金属污染成为公众日益关注的问题。考虑到这一点，世界卫生组织(who)和美国环境保护署(usepa)对允许向环境中排放的重金属水平制定了严格的标准。在所有重金属中，铜(cu)和铅(pb)因其高致毒性，被列为优先环境污染物。除了常规使用的物理化学技术外，研究人员尝试了各种去除重金属(hms)的技术，最近生物学方法，如基于微藻的重金属治理方法因其温和、高效、无二次污染等优点成为业界研究热点。
4.由于工业化进程和全球气候变化，重金属(hms)污染不断升高。城市工业废水的大量排放导致水体ph值的大幅变化。在低ph值和高温下，重金属(hms)在水中的溶解度增加，pb
2+
和cu
2+
的毒性会对水生和陆生动植物群落产生巨大影响。高温伴随着的重金属(hms)污染可能会对水中的生命造成毁灭性的影响。
5.目前，已报道的用于去除重金属的微藻菌株多具有较低的重金属耐受力、较窄的温度、ph和光照强度耐受范围。此外，对特定重金属具有良好去除能力的微藻藻株，常常无法在不同重金属污染的环境中生存。因此，迫切需要发现一种能够在一种或多种重金属污染环境中和不良环境条件下可茁壮成长、高效去除重金属污染的新型微藻。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一株耐铅铜微星藻属微藻的分离和应用。
7.本发明提供了保藏编号为cctcc no:m20211082的微星藻。
8.本发明提供了保藏编号为cctcc no:m20211082的微星藻在去除水体和/或土壤中重金属的应用。
9.在本发明中，所述重金属包括pb
2+
或cu
2+
中至少一种。
10.所述水体和/或土壤中，pb
2+
浓度为1ppm～200ppm，cu
2+
浓度为1ppm～200ppm。
11.所述pb
2+
来自氧化铅、氯化铅、碘化铅、溴化铅、氮化铅、氰化铅、氢氧化铅、硝酸铅、亚硝酸铅、硫酸铅、碳酸铅、醋酸铅、磷酸铅、铬酸铅、四乙基铅、四氧化三铅、二氧化铅、三氧
化二铅、硫化铅、硅酸铅、碱式碳酸铅、二盐基磷酸铅、三盐基硫酸铅等含铅化合物。
12.所述cu
2+
来自氧化铜、氧化亚铜、氯化铜、氯化亚铜、氢氧化铜、硫化铜、硫化亚铜、硝酸铜、碘化亚铜、溴化铜、亚硝酸铜、碳酸铜、硫酸铜、亚硫酸铜、亚硫酸亚铜、五水硫酸铜、醋酸铜、磷酸铜、焦磷酸铜、氰化亚铜、碱式碳酸铜、碱式硫酸铜、硫氰酸亚铜、脂肪酸铜、环烷酸铜等含铜化合物。
13.本发明提供了去除水体和/或土壤中重金属的产品，其包括保藏编号为cctcc no:m20211082的微星藻。
14.本发明提供了去除水体和/或土壤中重金属的产品的制备方法，其为培养保藏编号为cctcc no:m20211082的微星藻，收集藻体。
15.本发明所述的制备方法，所述收集藻体后，还包括重悬藻体制备藻悬液的步骤；或者还包括将藻体与冻干保护剂混合，经冻干制得冻干粉的步骤。
16.本发明还提供了去除水体和/或土壤中重金属的方法，使用所述的产品，对水体和/或土壤进行处理。
17.一些实施例中，所述重金属包括pb
2+
或cu
2+
中至少一种。
18.本发明所述处理温度为10℃～45℃
±
5℃，适宜的ph值范围为2.5～11。
19.一些实施例中，所述处理的温度为5℃～40℃，ph值为3.5～10光照强度为50μmol
·
m-2
·
s-1
。
20.本发明从土壤和水中分离、纯化和表征了一种新型的微星藻属微藻micractinium belenophorum，其编码为mem-a-402，可以有效减少环境中铅离子和铜离子含量，并且能够在不良的环境条件下生长。本发明提供了新的藻类分离物在不良环境条件下成长的条件，包括(1)温度范围在10℃～45℃
±
5℃之间，(2)ph范围从2.5～11，(3)铅离子浓度(pb
2+
)和铜离子(cu
2+
)在海水中高达150ppm～200ppm。以上工作为重金属污染水体的修复提供物理和技术支持。
21.本发明从铜矿土样和水样中分离了一株能耐受pb
2+
和cu
2+
重金属污染的微藻，经鉴定为微星藻(micractinium belenophorum)，编号为mem-a-402，并在一定的培养温度、ph值和重金属浓度下测试了其去除并代谢海水中pb
2+
和cu
2+
离子的能力。结果表明微星藻mem-a-402在不同实验条件下均能去除海水中pb
2+
和cu
2+
离子。这些特性使得该藻株非常适合于从污染水体中去除和回收pb
2+
和cu
2+
。
22.从铅采矿场收集土壤和水样，以分离可以存活并从污染水中去除不同重金属的微藻。成功分离出一种生长速度较快的绿藻，经鉴定为微星藻属micractinium belenophorum，编号为mem-a-402。测试了该分离物在不同温度、ph值和初始金属浓度下从水体中去除铅(pb
2+
)和铜(cu
2+
)离子的潜力。结果表明，新型分离株mem-a-402可以在多种条件下存活，因此非常适合用于重金属修复。
23.生物保藏说明
24.微星藻属微藻mem-a-402，分类命名为：micractinium belenophorum mem-a-402，于2021年08月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为:中国，武汉，武汉大学，保藏编号为cctcc no:m20211082。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图：
26.图1示微藻生长的视觉指示器；
27.图2示微藻菌株的纯化和重复平板划线法；
28.图3示mem-a-402在液体培养基中的生长情况；
29.图4示为新分离株micractinium belenophorum的18s rrna基因的pcr扩增子检测，lane-m是dna marker，lane-1是18s rrna基因扩增子；
30.图5示micractinium belenophorum的系统发育树分析；
31.图6示mem-a-402在10ppm、20ppm和40ppm铅离子和铜离子浓度下的生长模式，(a)示铅离子，(b)示铜离子；
32.图7示mem-a-402在80ppm、120ppm和160ppm铅离子和铜离子浓度下的生长模式，(a)示铅离子，(b)示铜离子；
33.图8示响应面方法二次模型的优化斜坡，用于确定mem-a-402增强去除铅离子的条件；
34.图9示光镜下micractinium belenophorum的形态，显微镜的放大倍数为100
×
。
具体实施方式
35.本发明提供了一株耐重金属微星藻属微藻及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
36.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
37.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
38.本发明的目的是从重金属污染场地收集土壤和水样，以分离得到耐铅铜的微星藻属微藻。本发明分离出一株被鉴定为micractinium belenophorum，编号为mem-a-402。本发明测试了其在不同温度、ph值和铜离子或铅离子浓度下的生长，评价了其重金属耐受能力。
39.实施例1、藻株的分离鉴定
40.步骤一：
41.1、采集土壤和水样。
42.2、铜矿土样和水样到达实验室后，将石头、鹅卵石和稻草移走清洗样品，样品置于4℃待用。
43.3、将土壤样品彻底混合，将具有代表性的10g～15g土壤和/或10ml均匀混合的水样加入100ml f/2培养基中，并添加20ppm浓度的铅(pb
2+
)和铜(cu
2+
)离子，在250ml锥形瓶中培养。
44.4、藻类分离过程中使用的藻类培养基的组成如下。
[0045][0046]
步骤二：
[0047]
配制母液，121℃加热灭菌15分钟，加入步骤一制备的溶液中。
[0048][0049]
步骤三：微量元素溶液的组成如下
[0050][0051][0052]
5、将烧瓶在25℃和100μmol
·
m-2
·
s-1
的恒定光照强度下培养16小时光照期和8小时黑暗期，直到藻体颜色可见(图1)。
[0053]
6、在平板上散布藻悬液数天后，观察到近似均匀的混合微藻与真菌污染。选取生长速度快的微藻菌株，通过反复扩散和划线板法进行纯化(图2)。
[0054]
7、接种至液体培养基，每隔24小时测定od值(图3)。
[0055]
8、pcr法扩增18s rrna基因：收集1.0ml海藻培养物，提取基因组，扩增18s rrna基因。
[0056]
pcr体系如下：
[0057]
序号原料体积(μl)
1ddh2o13.2210
×
xbuffer23dntp(2.5mm each)1.64forward primer15reverse primer16template17easy-taq polymerase(2.5u/μl)0.2
[0058]
pcr反应条件如下：
[0059][0060]
9.18s rrna基因扩增子(图4)。18s rrna基因的pcr扩增子经sanger双脱氧测序分析确定基因序列见序列表。进一步使用basic alignment search tool(blast)和系统发育分析鉴定藻种。
[0061]
a.简而言之，利用ncbi的blast寻找与新分离株的18s rrna基因序列高度相似的标准核苷酸序列。
[0062]
b.利用mega-x软件对选定的序列进行比对，并采用1000bootstrap方法构建邻接系统进化树。
[0063]
c.新分离株被鉴定为微星藻属micractinium belenophorum。经18s rrna基因测序和系统发育分析(图5)，新分离株被鉴定为micractinium belenophorum。
[0064]
实施例2、藻株在不同铅和铜污染水体中的耐受力分析
[0065]
第一轮筛选：
[0066]
制备含有10ppm、20ppm和40ppm的pb
2+
和cu
2+
的海水培养基，分装至单独的光反应器中。接种mem-a-402，初始od为0.30，25℃下培养，8小时黑暗期和16小时光照，光照强度为100μmol m-2
s-1
一天。每2天测量一次od，共12天。结果表明，在这三种浓度的pb
2+
和cu
2+
下，分离株mem-a-402均可生长(图6)。
[0067]
第二轮筛选:
[0068]
根据第一轮筛选的结果，海水培养基进一步补充了80ppm、120ppm和160ppm浓度的pb
2+
和cu
2+
。其余操作按照第一轮筛选过程进行。结果表明，80ppm和120ppm的浓度对分离株mem-a-402的生长无显著的抑制；而160ppm的浓度下，mem-a-402生长相对缓慢，但仍可生长。
[0069]
实施例3、mem-a-402去除pb
2+
和cu
2+
效率的研究
[0070]
通过正交软件“design expert”进行响应面分析，以确定mem-a-402在不同实验条件下去除pb
2+
离子的能力。选取了5个ph水平，包括2、3、6.5、10和12.5；5种不同的温度，包括5℃、10℃、20℃、35℃和50℃；4种不同浓度的pb
2+
，包括50ppm、100ppm、150ppm和200ppm。在接种mem-a-402后，在3天、6天、9天和12天，测定重金属去除效率。结果表明，温度和ph值对pb
2+
的去除效率有显著的影响。在ph值6～10之间和温度10℃～35℃的范围内，mem-a-402对pb
2+
的最大去除率(表1和图8)。
[0071]
表1.用于去除铅(pb)离子的响应面方法(rsm)二次模型的方差分析(anova)。
[0072][0073]
该模型的f值为11.50时，表明该模型是有意义的。
[0074]
实施例4、mem-a-402菌株的特征
[0075]
从中国海南省东方城市附近的铅矿区分离出的一株新型绿藻，经鉴定为微星藻属micractinium belenophorum，编号为mem-a-402。形态上mem-a-402是球形绿色微藻，在正
常生长条件下直径约为15
±
2微米(图9)。这种新型分离物具有多种特性，可在10℃～45℃
±
5℃的不同温度下生长，耐受ph范围为2.5～11，耐受不同浓度的pb
2+
和cu
2+
离子(从1ppm～200ppm)。以上优良性状使其成为重金属污染修复的最佳候选者。
[0076]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。