一种鉴定当归及常见当归混伪品的特异性引物对及其应用

1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种鉴定当归及常见当归混伪品的特异性引物对及其应用。


背景技术：

2.中药配方颗粒已完全失去了传统中药饮片的鉴别特征，其鉴别与监管已成为制约配方颗粒产业的瓶颈问题之一。由于生产、控制工艺的不同，中药配方颗粒缺乏统一可控的质量标准，在生产、流通、使用环节上未有有效监管，也导致了中药配方颗粒可能出现以伪充真、以次充好的现象，影响了配方颗粒的临床功效。2015年12月国家食品药品监督管理总局发布了关于征求《中药配方颗粒管理办法(征求意见稿)》意见的公告(2015年第283号)，其中规定“应准确鉴定其物种，包括亚种、变种或品种，不同种的中药材不可相互混用”，为配方颗粒的质量控制问题提出了新挑战，亟需建立准确性高、稳定性好的方法用于配方颗粒原料物种的鉴定。
3.2021年4月29日，国家药监局发布了第一批160个中药配方颗粒国家标准，其中包括当归配方颗粒。中药配方颗粒国家标准以“标准汤剂”为基准衡量配方颗粒与饮片汤剂的“一致性”，建立量值传递数据表与特征图谱控制指标，实现配方颗粒质量专属性与整体性的综合管控。dna分子鉴定技术对于近缘物种的区分更为有效，增加dna分子鉴定方法有助于进一步提高配方颗粒物种基原专属性控制水平。


技术实现要素：

4.本发明提供了当归特异引物对，所述当归特异引物对由核苷酸序列是seq id no.1的单链dna分子和核苷酸序列是seq id no.2的单链dna分子组成。
5.可选地，所述当归特异引物对中的核苷酸序列是seq id no.1的单链dna分子和核苷酸序列是seq id no.2的单链dna分子的摩尔比为1:1。
6.所述当归特异引物对可以用于鉴别或辅助鉴别当归及常见当归混伪品，所述常见当归混伪品为欧当归、东当归、白芷、前胡、藁本、独活和/或当归属其他物种。
7.本发明还提供了用于鉴定当归的试剂，包括上述的当归特异引物对和限制性核酸内切酶smli。
8.所述试剂可以用于鉴别或辅助鉴别当归及常见当归混伪品，所述常见当归混伪品为欧当归、东当归、白芷、前胡、藁本、独活和/或当归属其他物种。所述试剂可为pcr-rflp试剂。
9.本发明还提供了用于鉴定当归的试剂盒，包括上述的当归特异引物对和限制性核酸内切酶smli，或包括上述的试剂。
10.所述试剂盒可以用于鉴别或辅助鉴别当归及常见当归混伪品，所述常见当归混伪品为欧当归、东当归、白芷、前胡、藁本、独活和/或当归属其他物种。所述试剂盒可为pcr-rflp试剂盒。
11.上文中，所述当归特异引物对和限制性核酸内切酶smli均可独立包装。
12.上述的当归特异引物对、上述的试剂或上述的试剂盒的应用也在本发明保护范围内。
13.该应用为如下a1)-a8)任一种中的应用：
14.a1)在鉴别或辅助鉴别当归及常见当归混伪品中的应用，所述常见当归混伪品为欧当归、东当归、白芷、前胡、藁本、独活和/或当归属其他物种；
15.a2)在制备鉴别或辅助鉴别当归及常见当归混伪品的产品中的应用，所述常见当归混伪品为欧当归、东当归、白芷、前胡、藁本、独活和/或当归属其他物种；
16.a3)在鉴定或辅助鉴定当归中的应用；
17.a4)在制备鉴定或辅助鉴定当归的产品中的应用；
18.a5)在鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有当归中的应用；
19.a6)在制备鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有当归的产品中的应用；
20.a7)在制备鉴别当归配方颗粒真伪的产品中的应用；
21.a8)在鉴别当归配方颗粒真伪中的应用。
22.本发明还提供了一种检测或辅助检测待测样本是否为当归或是否含有当归的方法，所述方法包括如下步骤：
23.a1)采用上述的当归特异引物对对所述待测样本的基因组dna进行pcr扩增，得到扩增产物；
24.a2)以smli酶切所述扩增产物，得到酶切产物；
25.a3)凝胶电泳检测所述酶切产物，根据检测结果按照如下确定所述待测样本是否为当归或是否含有当归：若所述酶切产物仅在100～200bp之间有单一dna条带，则所述待测样本为或候选为当归，或者含有或候选含有当归；若所述酶切产物不为仅在100～200bp之间有单一dna条带，则所述待测样本不为或候选不为当归，或者不含有或候选不含有当归。
26.具体地，上述方法中，所述不为仅在100～200bp之间有单一dna条带分如下3种情况：
27.b1)没有条带；
28.b2)有多条条带。
29.具体地，上述方法中，所述pcr扩增采用的引物退火条件为60℃退火2min。
30.具体地，上述方法中，所述pcr扩增中采用的pcr反应程序为：95℃初始变性5min；95℃变性30s，60℃退火2min，72℃延伸30s，40个循环；72℃终延伸60min。
31.具体地，上述方法中，所述方法中pcr反应体系中模板dna浓度为4.5～13.3ng/μl，taq dna聚合酶为2
×
m5 superfast taq pcr mastermix。
32.具体地，上述方法中，所述方法中酶切体系中smli限制性内切酶用量为5000u/30μl，酶切时间为60min。
33.本发明建立了可同时区分当归及常见当归混伪品欧当归、东当归、白芷、前胡、藁本、独活和/或当归属其他物种的pcr-rflp检测体系。
34.本发明的引物对、pcr-rflp试剂、pcr-rflp试剂盒准确、快捷，在鉴别当归与常见当归混伪品(欧当归、东当归、白芷、前胡、藁本、独活和/或当归属其他物种)方面，尤其是中药配方颗粒中是否含有当归，具有更高的准确性与适应性，具有重要的应用价值。
附图说明
35.图1为本发明当归特异性酶切鉴定引物设计图。
36.图2为本发明实施例1中pcr反应退火温度对当归特异性pcr-rflp鉴别结果的影响。图中，m：trans 2k dna marker；as：当归；ase：当归配方颗粒浸膏；asg：当归配方颗粒；lo：欧当归；ad：白芷；pp：前胡；ap：独活；asp：野当归；ls：藁本；n：空白对照。
37.图3为本发明实施例1中pcr循环数对当归pcr-rflp鉴别结果的影响。图中，m：trans 2k dna marker；as：当归；ase：当归配方颗粒浸膏；asg：当归配方颗粒；lo：欧当归；ad：白芷；pp：前胡；ap：独活；asp：野当归；ls：藁本；n：空白对照。
38.图4为本发明实施例1中不同聚合酶种类对当归pcr-rflp鉴别结果的影响。图中，m：trans 2k dna marker；as：当归；ase：当归配方颗粒浸膏；asg：当归配方颗粒；lo：欧当归；ad：白芷；pp：前胡；ap：独活；asp：野当归；ls：藁本；n：空白对照。
39.图5为本发明实施例1中起始dna模板量对当归特异性pcr鉴别结果的影响。图中，m：trans 2k dna marker；as：当归；ase：当归配方颗粒浸膏；asg：当归配方颗粒；lo：欧当归；ad：白芷；pp：前胡；ap：独活；asp：野当归；ls：藁本；n：空白对照。
40.图6为本发明实施例1中不同pcr扩增仪对当归pcr-rflp鉴别结果的影响。图中，m：trans 2k dna marker；as：当归；ase：当归配方颗粒浸膏；asg：当归配方颗粒；lo：欧当归；ad：白芷；pp：前胡；ap：独活；asp：野当归；ls：藁本；n：空白对照。
41.图7为本发明实施例1中限制性内切酶用量对当归pcr-rflp鉴别结果的影响。图中，m：trans 2k dna marker；as：当归；ase：当归配方颗粒浸膏；asg：当归配方颗粒；lo：欧当归；ad：白芷；pp：前胡；ap：独活；asp：野当归；ls：藁本；n：空白对照。
42.图8为本发明实施例1中限制性内切酶酶切时间对当归pcr-rflp鉴别结果的影响。m：trans 2k dna marker；as：当归；ase：当归配方颗粒浸膏；asg：当归配方颗粒；lo：欧当归；ad：白芷；pp：前胡；ap：独活；asp：野当归；ls：藁本；n：空白对照。
43.图9为本发明实施例1中限制性内切酶种类对当归pcr-rflp鉴别结果的影响。图中m：trans 2k dna marker；as：当归；ase：当归配方颗粒浸膏；asg：当归配方颗粒；lo：欧当归；ad：白芷；pp：前胡；ap：独活；asp：野当归；ls：藁本；n：空白对照。
44.图10为本发明实施例2中不同来源当归及其混伪品pcr-rflp鉴别结果。图中，m.trans 2k dna marker；1-31：不同来源当归；32-33：欧当归:；34-35：白芷:；36-37：前胡；38-39：独活；40：野当归；41：藁本；n：空白对照。
45.图11为本发明实施例2中不同企业、批次当归配方颗粒鉴定结果。图中，m.trans2k dna marker；1-3：当归配方颗粒浸膏(7190417c,7190207c-03,7190305c)；4-24：当归配方颗粒，4-13：华润三九(1903009w,1903003w,1903005w,1801009w,1801005w,1807001w,1903001w,1801007w,1901001w,1801011w)，14-15：康仁堂(18007822,krtdg02)，16-17：江阴天江(19070491,19070481)，18-22：广东一方(9050342,9059011,9025892,9049211,9050332)，23：四川新绿色(xlsdg03)，24：江西百神(190925122512)。
46.图12为本发明实施例2中不同企业、批次当归配方颗粒混伪品鉴定结果。图中，m.trans 2k dna marker；1：当归药材；2：当归配方颗粒(1903009w)；3-6：独活配方颗粒(1910004w,19112151,20021731,9056881)；7-9：前胡配方颗粒(1904003c,19121351,9075041)；10-12：白芷配方颗粒(1911001w,20020101,9081681)；13-15：藁本配方颗粒
(1909001w,19100171,9090451)；n：空白对照。
具体实施方式
47.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
48.下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
49.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
50.实施例1pcr-rflp鉴别引物及鉴别方法的构建与优化
51.一、当归pcr-rflp鉴别引物设计
52.通过测序及从genbank数据库查找正品当归及常见当归混伪品(欧当归、东当归、白芷、前胡、藁本、独活，及当归属其他物种)its序列。用bioedit软件进行序列比较，结果见图1，筛选出当归基因组中有种间特异性且长度适合的基因座，基因序列为ctcaag，符合smli酶的识别序列(5'-ctyrag-3')的特点，可以被smli酶切割；而常见当归混伪品欧当归、东当归、白芷、前胡、藁本、独活，及当归属其他物种相应位置的基因序列均不符合smli的识别序列(ctyrag)的特点，不能被smli酶切割。
53.针对该基因座及smli的识别序列的特点设计由danggui-224f和danggui-224r组成的引物对，具体序列如下：
54.danggui-224f：5'-ctcgtggagctgtactggta-3'(如seq id no.1所示)；
55.danggui-224r：5'-ggtagtcccgcctgacct-3'(如seq id no.2所示)。
56.pcr扩增并使用smli内切酶进行酶切后(即聚合酶链式反应-限制性内切酶酶切长度多态性图谱，pcr-rflp)，当归由于具备smli酶的识别序列，可被酶切成为162bp和62bp的短片段，常见当归混伪品(欧当归、东当归、白芷、前胡、藁本、独活，及当归属其他物种)不具有smli酶识别序列，无法酶切，依然保留224bp条带或因无法扩增而无条带。
57.二、pcr-rflp检测方法的构建
58.以当归为阳性对照，以无菌双蒸水为空白对照，采用由danggui-224f和danggui-224r组成的引物对上述各待测样本基因组dna进行pcr扩增。
59.pcr反应体系为2
×
m5 superfast taq pcr master mix 12.5μl，上游引物danggui-224f(10μmol/l)和下游引物danggui-224r(10μmol/l)各0.4μl，模板dna 2μl(20ng)(模板dna在反应体系中的浓度选择4.5～13.3ng/μl均可)，双蒸无菌水9.7μl。
60.pcr扩增循环程序及参数如下：
61.初始变性条件：95℃，5min；
62.变性条件：95℃，30s；
63.退火条件：60℃，30s；
64.延伸条件：72℃，30s；
65.循环数：40个；
66.终延伸条件：72℃，5min；
67.保温：4℃维持。
68.以限制性内切酶smli对pcr扩增产物进行酶切消化。
69.酶切反应体系为：pcr反应产物溶液25μl，10
×
限制性内切酶缓冲液3μl，smli限制性内切酶0.5μl，用无菌双蒸水补足反应体积至30μl。
70.酶切时间为60min。
71.取5μl酶切反应液经2％琼脂糖凝胶电泳，gelred核酸染料染色，置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。
72.结果判定标准为：在阳性对照和空白对照结果符合规定的情况下，待测样品相应泳道上仅在100～200bp(如162bp)之间有单一dna条带者为阳性结果(即待测样品含有当归)，否则为阴性结果(即待测样品不含当归)。
73.上述pcr扩增方式及酶切方式的具体优化过程如下：
74.1、pcr扩增参数的优化
75.分别选取当归药材、当归配方颗粒浸膏、当归配方颗粒，及混伪品欧当归、白芷、前胡、独活、野当归、藁本待测样品各1个，提取基因组dna作为模板，进行pcr参数优化。
76.1.1退火温度考察
77.分别设置退火温度为58、60、62、64℃，保持其它参数不变，结果表明在58-62℃时，当归药材、浸膏和配方颗粒正品能扩增得到224bp的亮带，阴性对照在此范围内均未扩增，64℃时当归配方颗粒条带明显减弱，当归浸膏无条带，如图2。为确保pcr-rflp酶切前dna产物有足够的量，确定pcr退火温度为60℃。
78.1.2循环次数考察
79.分别选用36、38、40、42个循环进行考察，保持其它参数不变，结果表明36个循环的凝胶电泳图谱当归药材、浸膏、配方颗粒可看到224bp的pcr扩增条带，38～42个循环时dna条带明显(见图3)。因当归配方颗粒与当归样品相比dna含量和质量较低，为保证结果的稳定性和准确性，后续选择40个循环进行pcr反应。
80.1.3聚合酶对pcr鉴别结果的影响
81.为进一步确定不同taq dna聚合酶对当归配方颗粒pcr鉴别的适用性，选择了不同公司的taq酶及其mix进行测试，包括2
×
t5 super pcr mix(北京擎科新业生物技术有限公司)、2
×
m5 superfast taq pcr mastermix(聚合美生物有限公司)、mightyamp dna polymerase ver.2(takara生物科技有限公司)、2
×
fastpfu fly pcr supermix(全式金生物技术有限公司)进行测试。配置pcr扩增体系的循环参数：95℃初始变性5min；95℃变性30s，60℃退火2min，72℃延伸30s，40个循环；72℃终延伸60min；4℃保温。
82.结果见图4:2
×
m5 superfast taq pcr mastermix和mightyamp dna polymerase ver.2在当归药材、当归配方颗粒浸膏、当归配方颗粒中均能扩增出224bp的单一条带，2
×
fastpfu fly pcr supermix无法从配方颗粒dna中扩增出条带，2
×
t5 super pcr mix扩增条带较弱，难以进行下游酶切鉴别操作，选择2
×
m5 superfast taq pcr mastermix进行后续研究。
83.1.4模板dna浓度考察
84.调整dna模板浓度为40ng/μl，进行梯度稀释，形成40ng/μl、13.3ng/μl、4.5ng/μl、1.5ng/μl的浓度系列，进行pcr扩增，以2
×
m5 superfast taq pcr mastermix作为taq dna
聚合酶，pcr扩增体系参数：95℃初始变性5min；95℃变性30s，60℃退火2min，72℃延伸30s，40个循环；72℃终延伸60min；4℃保温。
85.结果见图5，表明当归药材、浸膏、配方颗粒在模板dna浓度4.5～13.3ng/μl均可扩增获得224bp条带，然而pcr起始dna模板量过高(40ng)时存在pcr抑制现象，浸膏和配方颗粒无法扩增，确定起始dna模板量在4.5～13.3ng/μl之间。
86.1.5pcr仪对当归配方颗粒pcr鉴别的影响
87.pcr反应体系中模板dna浓度为10ng/μl，以2
×
m5 superfast taq pcr mastermix作为taq dna聚合酶，pcr扩增体系参数：95℃初始变性5min；95℃变性30s，60℃退火2min，72℃延伸30s，40个循环；72℃终延伸60min；4℃保温。分别选择了不同厂家仪器进行pcr扩增，结果除7500型pcr仪(applied biosystems公司)扩增条带较弱外，使用veriti型(applied biosystems公司)、pct-100型(gene公司)和tc-512型pcr仪(techne公司)，当归药材、当归配方颗粒浸膏、当归配方颗粒均能扩增获得224bp特异性条带(见图6)，表明不同pcr仪对当归pcr-rflp鉴别结果无影响。
88.经以上条件考察后，获得最优pcr反应参数：pcr反应体系中模板dna浓度为4.5～13.3ng/μl，以2
×
m5 superfast taq pcr mastermix作为taq dna聚合酶，扩增体系：95℃初始变性5min；95℃变性30s，60℃退火2min，72℃延伸30s，40个循环；72℃终延伸60min；4℃保温。
89.2、smli酶切条件的优化
90.分别选取当归药材、当归配方颗粒浸膏、当归配方颗粒，及混伪品欧当归、白芷、前胡、独活、野当归、藁本待测样品各1个，提取基因组dna，使用上述步骤1中优化后的pcr反应参数，取扩增产物进行酶切条件考察。
91.2.1限制性内切酶用量考察
92.首先进行限制性内切酶用量考察，配置系列限制性内切酶酶切反应体系：pcr反应产物溶液25μl，10
×
限制性内切酶缓冲液3μl(neb公司)，含smli限制性内切酶(neb公司，10000u/μl)分别为0.125μl、0.25μl、0.5μl或1μl，分别用无菌双蒸水补足反应体积至30μl。将反应液振荡混匀，瞬时离心。将反应液置pcr仪，55℃保温60min。
93.酶切产物进行凝胶电泳后，结果见图7：当限制性内切酶≥0.25μl时，当归药材、配方颗粒浸膏、配方颗粒pcr产物均能完全酶切，获得约160bp特异性酶切条带，混伪品不能酶切，仍保持224bp的扩增条带或无条带，而限制性内切酶用量为0.125μl时无法完全酶切，形成224bp+160bp条带(见图7)，为保证酶切效果，选择酶切体系中smli限制性内切酶为5000u/30μl。
94.2.2限制性内切酶酶切时间考察
95.配置系列限制性内切酶酶切反应体系：pcr反应产物溶液25μl，10
×
限制性内切酶缓冲液3μl(neb公司)，含smli限制性内切酶(neb公司，10000u/μl)0.5μl，用无菌双蒸水补足反应体积至30μl。将反应液振荡混匀，瞬时离心。将反应液置pcr仪，55℃保温。分别设定保温时间为30min、60min、120min或240min进行酶切，结果30min即可对pcr产物完全酶切，孵育时间长达240min也未出现星活性(star activity，见图8)，确定限制性内切酶酶切时间为60min。
96.2.3限制性内切酶种类考察
97.为进一步确定不同内切酶对当归配方颗粒pcr鉴别的适用性，选择了neb及thermo等2家不同生产企业的smli内切酶进行酶切试验，结果不同企业内切酶均获得正确的酶切结果，当归药材、当归配方颗粒浸膏、当归配方颗粒pcr产物均被酶切获得约160bp特异性条带，混伪品不能酶切，仍保持224bp的扩增条带或无条带(见图9)。
98.经以上条件考察，优化后的酶切体系中smli限制性内切酶为5000u/30μl，酶切时间为60min。
99.实施例2pcr-rflp方法的准确性与适用性考察
100.依据全国中药资源普查标本库标本，并从西藏、四川、甘肃、湖北等地采集当归31批，欧当归、野当归、白芷、前胡、藁本药材样品共计34批药材样品，详见表1。
101.从华润三九集团、江阴天江药业、北京康仁堂药业、广东一方制药、四川新荷花药业、湖南春光九汇药业等主流配方颗粒生产厂商收集当归(24批)、白芷(3批)、前胡(3批)、独活(3批)、藁本(3批)等配方颗粒样品，详见表2。药材经性状鉴定后，使用dna测序进行辅助鉴定，以两者一致结果为最终鉴定结果。
102.表1原植物和药材样品表
103.序号样本名称样本类型学名来源地批次数(批)1当归原植物angelica sinensis西藏林芝102当归原植物angelica sinensis四川汶川53当归原植物angelica sinensis湖北恩施104当归药材angelica sinensis安国35当归药材angelica sinensis甘肃岷县36欧当归原植物levisticum officinale青海西宁87欧当归药材levisticum officinale安国28野当归药材angelica sp.四川49野当归药材angelica sp.四川甘孜310独活药材angelica pubescens安国311白芷药材angelica dahurica安国712前胡药材peucedanum praeruptorum亳州713藁本药材ligusticum sinense亳州3
104.表2配方颗粒样品表
105.[0106][0107]
注：表2中cr为华润三九集团，btc为北京康仁堂药业，jtp为江阴天江药业，yifang为广东一方制药，neo为四川新绿色药业，bai为江西百神药业。
[0108]
1鉴别方法的准确性考察
[0109]
使用实施例1制备的pcr-rflp引物对，采用实施例1中的pcr-rflp检测方法分别检测表1中不同来源的当归原植物和当归药材。
[0110]
结果见图10，所有当归正品均经pcr-rflp反应后获得160bp的特异性鉴别条带，不同来源的当归常见混伪品包括欧当归、白芷、前胡、独活、野当归、藁本均无扩增或为224bp条带。
[0111]
2方法的适用性考察
[0112]
使用实施例1制备的pcr-rflp引物对，采用实施例1中的pcr-rflp检测方法分别检测表2中不同来源的当归配方颗粒。
[0113]
结果见图11和图12，表明该体系能稳定准确地鉴定当归配方颗粒，所有当归配方颗粒均可酶切获得约160bp特异性鉴别条带，混伪品配方颗粒在相应位置上均无扩增条带。
[0114]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实
施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。