一种核苷二聚体亚膦酰胺的合成方法与流程

1.本发明属于核苷酸的化学合成技术领域，具体涉及一种核苷二聚体亚膦酰胺的合成方法。


背景技术：

2.寡核苷酸药物已成为前景广阔的新型治疗方法，越来越多国家已经批准了多种寡核苷酸药物来治疗遗传疾病。在医疗领域，随着寡核苷酸药物疗法的投放逐渐增多，寡核苷酸的生产工艺正变得至关重要，从单体结构单元的可获得性、不同溶剂的选用(废物处理成本)、产品大批量生产、高纯度和可扩展性等方面提出了更高要求。对寡核苷酸的合成需求量已创历史最高水平，其需求将会持续增长。寡核苷酸可以作为潜在的反义和抗原性药物，此外，基于寡核苷酸的芯片技术、诊断工具、纳米科技和生物学应用中的应用也方兴未艾。为了这些目的，亟需拓展有效和多样的寡核苷酸合成方法，对于寡核苷酸合成原料新类型的开发更为紧迫。
3.本领域迫切需要提供一种合成步骤简洁、反应条件温和、且收率较高的合成核苷二聚体亚膦酰胺的方法，成为本发明需要解决的技术问题。


技术实现要素：

4.本发明旨在提供一种操作简单且成本低廉的基于一种修饰性核苷单体和另一种修饰性核苷单体亚膦酰胺为原料的偶联/硫化/脱保护“一锅法”的合成方法。
5.在本发明的第一方面，提供一种结构如式m
‑ⅴ
所示的化合物的制备方法，所述方法为一锅法，包括步骤：
6.(i)使结构如式m
‑ⅰ
所示的化合物与结构如式m
‑ⅱ
所示的化合物混合，在活化剂作用下反应得到含结构如式m
‑ⅲ
所示的化合物的反应液；
7.(ii)使含结构如式m
‑ⅲ
所示的化合物的反应液在硫化剂存在下反应得到含结构如式m
‑ⅳ
所示的化合物的反应液；和
8.(iii)使含结构如式m
‑ⅳ
所示的化合物的反应液经脱硅烷保护基反应，得到结构如式m
‑ⅴ
所示的化合物。
9.在另一实施方式中，步骤(i)中所述活化剂选自四氮唑、4,5-二氰基咪唑、三氟乙酸吡啶或5-乙硫基四唑。
10.在另一实施方式中，步骤(i)的反应介质选自下述的一种或两种以上：乙二醇二甲醚、二氯甲烷、1,4-二氧六环、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、n-甲基吡咯烷酮、乙腈和吡啶。
11.在另一实施方式中，步骤(i)所述反应的温度为10-80℃；优选20-25℃。
12.在另一实施方式中，步骤(ii)中所述硫化剂选自n,n-二甲基-n'-(3-硫代-3h-1,2,4-二噻唑-5-基)甲脒、3-氨基-1,2,4-二噻-5-唑硫酮或苯乙酰二硫化物。
13.在另一实施方式中，步骤(ii)所述反应的温度为10-80℃。
14.在另一实施方式中，步骤(ii)所述反应时间为0.5-8.0小时。
15.在另一实施方式中，步骤(iii)使含结构如式m
‑ⅳ
所示的化合物的反应液与氟试剂反应以脱硅烷保护；所述氟试剂选自四丁基氟化胺、氟化氢吡啶盐或氟化氢三乙胺盐。
16.在另一实施方式中，所述氟试剂的用量为2-6当量。
17.在另一实施方式中，所述脱硅烷保护基反应后经水洗、柱层析除去氟试剂和杂质。
18.在本发明的第二方面，提供一种结构如式ⅰ所示的化合物的制备方法，所述方法包括步骤：使结构如式m
‑ⅴ
所示的化合物和双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦混合，反应得到结构如式ⅰ所示的化合物。
19.在另一实施方式中，所述结构如式m
‑ⅴ
所示的化合物和1.0-4.0当量的双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦混合。
20.在本发明的第三方面，提供一种结构如式ⅰ所示的化合物的制备方法，所述方法包括步骤：
21.(1)使结构如式m
‑ⅰ
所示的化合物与结构如式m
‑ⅱ
所示的化合物混合，在活化剂作用下反应得到含结构如式m
‑ⅲ
所示的化合物的反应液；
22.(2)使含结构如式m
‑ⅲ
所示的化合物的反应液在硫化剂存在下反应得到含结构如式m
‑ⅳ
所示的化合物的反应液；
23.(3)使含结构如式m
‑ⅳ
所示的化合物的反应液经脱硅烷保护基反应，得到结构如式m
‑ⅴ
所示的化合物；和
24.(4)使结构如式m
‑ⅴ
所示的化合物和双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦混合，反应得到结构如式ⅰ所示的化合物。
25.在另一实施方式中，所述步骤(1)-(3)通过一锅法进行。
26.据此，本发明提供了一种步骤简洁、反应条件温和、且收率较高的合成核苷二聚体亚膦酰胺的方法
具体实施方式
27.发明人经过广泛而深入的研究，开发了一种[5'-o-二甲氧基三苯甲基-2'-r
1-b1碱基](腈基乙氧基硫代膦)[2'-r
2-b2碱基]-亚磷酰胺(ⅰ)的新型合成方法，经过简便的偶联反应、硫化反应、脱硅基化反应，合成出稳定的[5'-o-二甲氧基三苯甲基-2'-r
1-b1碱基](腈基乙氧基硫代膦)[2'-r
2-b2碱基](m
‑ⅴ
)。通过式m
‑ⅴ
化合物与双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦进行膦酰化反应构建p-o键，较高收率、高选择性地生成目标产物核苷二聚体亚膦酰胺。在此基础上，完成了本发明。
[0028]
本发明涉及的主要化合物如下表所列：
[0029]
[0030]
[0031]
[0032]
[0033]
[0034]
[0035]
[0036][0037]
在本文中，“结构如式ⅰ所示的化合物”、“式ⅰ化合物”或
“ⅰ”
可以互换使用，都是指上表中编号为ⅰ的化合物。以此类推于其他结构的化合物。
[0038]
以下以制备结构如式1a所示的化合物的方法为例说明本发明，但不能因此限制本发明的范围。
[0039]
本发明提供一种结构如式1a所示的化合物的制备方法，步骤如下：
[0040]
第一步，使n6-苯甲酰基-3'-o-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-甲氧基腺苷m1a与5'-o-二甲氧基三苯甲基-n6-苯甲酰基-2'-甲氧基腺苷m2a混合，在活化剂的作用下进行偶联反应，得到结构如式m3a所示的中间体反应液；
[0041]
第二步，结构如式m3a所示的化合物的三价膦硫化至五价膦反应，得到结构如式m4a所示的中间体反应液；
[0042]
第三步，结构如式m4a所示的化合物的3’脱硅烷保护反应，得到结构如式m5所示的化合物；
[0043]
第四步，结构如式m5a所示的化合物的膦酰化反应。
[0044]
上述第一步中可使用活化剂，选自四氮唑、4,5-二氰基咪唑、三氟乙酸吡啶或5-乙硫基四唑。
[0045]
上述第一步的偶联反应可以在乙二醇二甲醚(dme)、1,4-二氧六环(dioxane)、二氯甲烷(dcm)、四氢呋喃(thf)、二甲基亚砜(dmso)、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、n,n-二甲基乙酰胺(dma)、n-甲基吡咯烷酮(nmp)、吡啶、乙腈、或丙酮中的一种或两种以上反应介质中进行。
[0046]
上述第一步中m1a与m2a混合进行的偶联反应温度为0-60℃，例如但不限于，5-25℃、20-45℃等；在本发明的一种实施方式中，m1a与m2a在二氯甲烷/乙腈(4/1)中混合，在20-25℃下进行偶联反应，得到结构如式m3a所示的化合物。
[0047]
上述第二步中的硫化反应在乙二醇二甲醚(dme)、1,4-二氧六环(dioxane)、四氢呋喃(thf)、二甲基亚砜(dmso)、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、n,n-二甲基乙酰胺(dma)、n-甲基吡咯烷酮(nmp)、乙腈、吡啶、二氯甲烷和丙酮中的一种或两种以上的反应介质中进行。
[0048]
上述第二步中的硫化反应可使用的硫化试剂选自n,n-二甲基-n'-(3-硫代-3h-1,2,4-二噻唑-5-基)甲脒、3-氨基-1,2,4-二噻-5-唑硫酮或苯乙酰二硫化物。
[0049]
上述第二步硫化反应的反应温度为10℃-80℃，例如但不限于，20-75℃、30-60℃、40-70℃、20-50℃等。
[0050]
在本发明的一种实施方式中，上述第二步中将含有结构如式m1a所示的反应液和硫化试剂混合在反应介质中，在10-80℃反应0.5-8小时得到结构如式m4所示的化合物。
[0051]
在本发明的一个实施例中，上述第二步的硫化反应在乙腈中进行，反应温度为20-25℃、以1.1至2.5当量3-氨基-1,2,4-二噻-5-唑硫酮作硫化剂。
[0052]
在本发明的一个实施例中，上述第二步的硫化反应在吡啶(反应介质)中进行，3-氨基-1,2,4-二噻-5-唑硫酮为硫化剂，反应温度为10-35℃(例如但不限于，15-30℃、20-25℃等)时，反应1-4小时，超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography，uplc)监控，反应转化彻底。
[0053]
在本发明的一个实施例中，上述第二步的硫化反应在吡啶(反应介质)中进行，苯乙酰二硫化物为硫化剂，反应温度为25
±
5℃，搅拌2-6小时，反应转化彻底。
[0054]
上述第三步是将结构如式m4a所示的化合物通过与氟试剂反应进行3’脱硅烷保护，得到结构如式m5a所示的化合物；所述氟试剂选自为四丁基氟化胺(tbaf)、氟化氢吡啶盐、或氟化氢三乙胺盐；反应溶剂(反应介质)可以是四氢呋喃、吡啶、二氯甲烷、乙腈中的一种或两种以上。
[0055]
在本发明的一种实施方式中，上述第三步中结构如式m2a所示的化合物与氟试剂的反应温度为0-60℃，例如但不限于，5-50℃、45-55℃等。
[0056]
上述第三步中经过柱层析分离纯化得到的结构如式m5a所示的化合物，通过本发明上述第三步获得的结构如式m5a所示的化合物的纯度可以达到95％-98％(通过本发明提供的uplc法测定)。
[0057]
可用于柱层析的溶剂包括但不限于，正庚烷、正己烷、环己烷、乙腈、吡啶、二氯甲烷和丙酮中的一种或两种以上。柱层析可以采用100～200目、200～300目或300～400目硅胶。
[0058]
上述第三步通过柱层析分离纯化得到的式m5a化合物是本发明提供的制备式1化合物的方法中唯一使用柱层析的步骤，例如在上述第二步硫化之后不进行层析纯化的操作。
[0059]
本发明提供的制备式1化合物的方法中第一步至第三步是通过一锅法进行。
[0060]
在本发明的一种实施方式中，上述第三步中在结构如式m4a所示的化合物与氟试剂反应结束后萃取，然后用水洗有机相至少2次，以充分除去氟试剂；所述氟试剂的用量为2-6当量。
[0061]
在本发明的一种实施方式中，结构如式m4a所示的化合物反应液与四丁基氟化胺的反应在乙腈(反应介质)中混合，0-60℃反应至完成，浓缩后加入水，乙酸乙酯萃取后有机相用水至少洗涤2次，有机相浓缩得到粗品，柱层析采用100～200目、200～300目或300～400目硅胶，以小极性溶剂(例如但不限于，正庚烷、正己烷、环己烷、二氯甲烷)和大极性溶剂(例如但不限于，乙腈、甲醇、丙酮、乙醇)按照比例为100：1至10:1进行，得到结构如式m5a所示的化合物，经uplc法测定纯度为98.85％。
[0062]
在本发明的一种实施方式中，结构如式m4a所示的化合物反应液与氟化氢吡啶盐的反应在乙腈(反应介质)中混合，10-25℃反应至完成，浓缩后加入水，乙酸乙酯萃取后有
机相用水至少洗涤2次，有机相浓缩得到粗品，柱层析采用100～200目、200～300目或300～400目硅胶，以小极性溶剂(例如但不限于，正庚烷、正己烷、环己烷、二氯甲烷)和大极性溶剂(例如但不限于，乙腈、甲醇、丙酮、乙醇)按照比例为100：1至10:1进行，得到结构如式m5所示的化合物，经uplc法测定纯度为99.60％。
[0063]
上述第四步中的膦酰化反应时将结构如式m5a所示的化合物与双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(1.0-4.0当量)混合，反应得到结构如式1所示的化合物；反应温度为0-50℃，优选为20-25℃；反应时间在1-8小时。
[0064]
上述第四步中的膦酰化反应在酸(催化剂)存在下进行，所用的酸选自四氮唑、4,5-二氰基咪唑、三氟乙酸吡啶或5-乙硫基四唑。在本发明的一种实施方式中，所述酸为四氮唑，其用量在1.0至6.0当量之间，优选在2.0至3.5当量。
[0065]
上述第四步中的膦酰化反应的反应溶剂(反应介质)为乙二醇二甲醚(dme)、1,4-二氧六环(dioxane)、四氢呋喃(thf)、二甲基亚砜(dmso)、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、n,n-二甲基乙酰胺(dma)、n-甲基吡咯烷酮(nmp)、二氯甲烷、乙腈和吡啶中的一种或两种以上。柱层析采用100～200目、200～300目或300～400目硅胶，以小极性溶剂(例如但不限于，正庚烷、正己烷、环己烷、二氯甲烷)和大极性溶剂(例如但不限于，乙腈、丙酮)按照比例为100：1至10:1进行，得到结构如式1所示的化合物。
[0066]
如本发明所用，室温是指10-40℃，优选15-30℃，例如但不限于，20-45℃、25-35℃等。
[0067]
通过本发明提供的制备方法得到的结构如式i所示的[5'-o-二甲氧基三苯甲基-2'-r
1-b1碱基](腈基乙氧基硫代膦)[2'-r
2-b2碱基]-亚磷酰胺可以用于合成硫代磷酸酯核苷酸，例如但不限于，在3
’‑5’
固相合成中，将已修饰的受控孔玻璃cpg表面脱保护后，与核苷二聚体3
’‑
亚磷酰胺进行偶联，随后硫化三价膦得到中间体，其中，b3和b4分别表示碱基，包括但不限定于保护型和非保护型腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)、或尿嘧啶(u)等碱基；r3和r4分别表示氢、氟、甲氧基、或甲氧基乙氧基等；cpg表示受控孔玻璃。重复n次此脱保护-偶联-硫化步骤
得到n＝1-10。最后脱除碱基和膦上的保护基得到形式上的硫代磷酸酯核苷酸。
[0068]
本文描述和公开的理论或机制，无论是对或错，均不应以任何方式限制本发明的范围，即本发明内容可以在不为任何特定的理论或机制所限制的情况下实施。
[0069]
在本文中，所有以数值范围或百分比范围形式界定的特征，如数值、数量、含量与浓度仅是为了简洁及方便。据此，数值范围或百分比范围的描述应视为已涵盖且具体公开所有可能的次级范围及范围内的个别数值(包括整数与分数)。
[0070]
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，只要这些特征的组合不存在矛盾，所有可能的组合都应当认为是本说明书记载的范围。说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
[0071]
本发明的主要优点在于：
[0072]
(1)使用的式m
‑ⅰ
、m
‑ⅱ
等为常规的带保护基核苷单体，原料易得，适合规模化生产；
[0073]
(2)本发明使用多步反应“一锅”进行，避免了多步合成分离纯化的繁琐过程，得到关键中间体m
‑ⅴ
，提高了产品纯度，降低了生产成本。
[0074]
(3)合成式ⅰ时，通过与双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦在活化剂的作用下进行膦酰化反应，高收率地生成目标产物核苷二聚体亚膦酰胺ⅰ，例如将p-cl试剂(12.5或16当量)改为p-amidite试剂(3当量)，用量更经济,试剂价格更便宜、产生含膦废物更少，得率从69.5mol％提升到75.19mol％等。
[0075]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0076]
下述实施例中的uplc条件：
[0077]
1.方法概述
[0078]
方法来源：采用uplc法测定物料的纯度，按仪器操作规程操作
[0079]
2.使用的试剂
[0080]
试剂级别乙腈hplc醋酸铵hplc水去离子水
[0081]
3.色谱条件
[0082][0083][0084]
实施例1
[0085]
[5'-o-二甲氧基三苯甲基-n6-苯甲酰基-2'-甲氧基腺苷](腈基乙氧基硫代膦)[n6-苯甲酰基-2'-甲氧基腺苷](m5a)的制备
[0086][0087]
将n6-苯甲酰基-3'-o-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-甲氧基腺苷m1a(50g,1.0eq)和5'-o-二甲氧基三苯甲基-n6-苯甲酰基-2'-甲氧基腺苷，3'-[(2-氰乙基)-(n,n-二异丙基)]-亚磷酰胺m2a(133.29g,1.5eq)溶解到乙腈(800ml)，加入四氮唑(14.02g,2.0eq)。反应在10-35℃搅拌3小时。3-氨基-1,2,4-二噻-5-唑硫酮(30.07g,2.0eq)加入反应中。反应在10-35℃搅拌4小时。咪唑(20.4g,3eq)、吡啶(15.8g,2.0eq)和氟化氢吡啶(6.16g,2eq)溶解于乙腈(500ml)中。将氟化氢混合溶液在20-25℃条件下滴加到反应液中。将反应液在20-25℃条件下搅拌4小时。将反应依次用饱和碳酸氢钠溶液(800ml*2),去离子水(800ml*3),盐水(800ml*3)洗涤。浓缩获得的有机层，得到黄色固体m5粗品。柱层析以溶剂二氯甲烷：甲醇＝50：1至10:1得到80克[5'-o-二甲氧基三苯甲基-n6-苯甲酰基-2'-甲氧基腺苷](腈基乙氧基硫代膦)[n6-苯甲酰基-2'-甲氧基腺苷]纯品m5a。得率：66.39％。lcms纯度：99.17％；ms[m+h]
+
：1204.3；
[0088]1h nmr(500mhz,dmso)δ11.27(d,j＝3.4hz,2h),10.93(d,j＝3.1hz,2h),8.63(dd,j＝12.2,4.3hz,4h),8.07(dd,j＝10.6,7.5hz,6h),7.65(t,j＝7.4hz,2h),7.56(t,j＝7.7hz,4h),7.37(d,j＝3.0hz,4h),7.24(ddd,j＝17.6,9.9,5.1hz,16h),6.85(dt,j＝9.1,4.6hz,8h),6.22(d,j＝6.6hz,2h),5.87(dd,j＝13.5,2.4hz,2h),5.41(dd,j＝13.6,6.7hz,2h),5.30(d,j＝6.5hz,2h),5.06(s,2h),4.50
–
4.42(m,3h),4.38(d,j＝5.9hz,3h),4.31
–
4.19(m,4h),4.17
–
4.10(m,2h),4.09
–
4.02(m,2h),3.81(dd,j＝7.4,3.7hz,2h),3.73(d,j＝2.7hz,12h),3.48(d,j＝9.8hz,6h),3.41(d,j＝8.4hz,7h),2.94(d,j＝18.1hz,4h),2.10(d,j＝3.1hz,6h),2.08(s,2h).
[0089]
31
p nmr(202mhz,dmso)δ(ppm):-2.05；-2.37.
[0090]
实施例2
[0091]
[5'-o-二甲氧基三苯甲基-n6-苯甲酰基-2'-甲氧基腺苷](腈基乙氧基硫代膦)[n6-苯甲酰基-2'-甲氧基腺苷]-3'-[(2-氰乙基)-(n,n-二异丙基)]-亚磷酰胺1a的制备
[0092][0093]
将[5'-o-二甲氧基三苯甲基-n6-苯甲酰基-2'-甲氧基腺苷](腈基乙氧基硫代膦)[n6-苯甲酰基-2'-甲氧基腺苷]m5a(26g,1.0eq)溶解于乙腈(500ml)。将四氮唑(3.78g,2.5eq)和双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(19.52g,3.0eq)加入反应体系中。10-25℃搅拌6.0小时。反应用饱和碳酸氢钠溶液(300ml*3),去离子水(300ml*3),盐水(300ml*2)洗涤,无水硫酸钠干燥。有机相浓缩至粗品1a。通过硅胶柱层析以二氯甲烷：乙腈＝50:1至10:1层析，得到22.8克[5'-o-二甲氧基三苯甲基-n6-苯甲酰基-2'-甲氧基腺苷](腈基乙氧基硫代膦)[n6-苯甲酰基-2'-甲氧基腺苷]-3'-[(2-氰乙基)-(n,n-二异丙基)]-亚磷酰胺(1a)纯品。得率：75.19％，lcms纯度：99.29％；ms(m+h)
+
：1404.4；
[0094]1h nmr(500mhz,cdcl3)δ10.29(s,1h),9.44(s,1h),8.67
–
8.54(m,1h),8.32
–
8.21(m,1h),8.11
–
8.03(m,1h),8.00(d,j＝7.6hz,2h),7.53(d,j＝7.3hz,1h),7.49
–
7.35(m,5h),7.34
–
7.23(m,6h),7.20(s,1h),6.79(ddd,j＝7.9,4.7,2.9hz,4h),6.16(d,j＝7.0hz,1h),5.91(dd,j＝3.6,1.7hz,1h),5.27(t,j＝5.8hz,1h),5.01(ddd,j＝17.1,11.0,5.3hz,1h),4.62(dt,j＝12.9,6.6hz,1h),4.52
–
4.31(m,4h),4.31
–
4.22(m,1h),4.22
–
4.12(m,1h),3.95(td,j＝9.7,3.9hz,1h),3.91
–
3.80(m,2h),3.75(d,j＝3.8hz,6h),3.69(td,j＝10.6,5.3hz,1h),3.59(dd,j＝20.5,14.8hz,6h),3.48(dd,j＝8.9,5.3hz,4h),2.79(dd,j＝13.3,6.6hz,1h),2.67
–
2.54(m,3h),2.21(dd,j＝4.1,2.8hz,3h),1.94(s,2h),1.21
–
1.09(m,12h).
[0095]
31
p nmr(202mhz,dmso)δ(ppm):150.44，150.31，150.08，-1.89，-2.22.
[0096]
实施例3
[0097]
[5'-o-二甲氧基三苯甲基-n
4-乙酰基-2'-甲氧基胞苷](腈基乙氧基硫代膦)[2'-甲氧基尿苷](m5b)的制备
[0098][0099]
将3'-o-叔丁基二甲基硅烷基-2'-甲氧基尿苷m1b(40g,1.0eq)溶解到二氯甲烷(560ml)，加入[5'-o-二甲氧基三苯甲基-n
4-乙酰基-2'-甲氧基胞苷]-亚磷酰胺m2b(86.11g,1.0eq),四氮唑(15.05g,2.0eq)。反应在20-25℃搅拌3小时。将3-氨基-1,2,4-二噻-5-唑硫酮(17.75g,1.1eq)加入反应中。反应在10-35℃搅拌2小时。将咪唑(21.93g,3eq)、吡啶(17g,2.0eq)和氟化氢吡啶(6.61g,2eq)溶解于乙腈(500ml)中。将氟化氢混合溶液在20-25℃条件下滴加到反应液中。将反应液在20-25℃条件下搅拌16小时。将反应依次用饱和碳酸氢钠溶液(800ml*2),去离子水(800ml*3),盐水(800ml*3)洗涤。浓缩有机层，得到黄色固体m5b粗品。柱层析以溶剂二氯甲烷：甲醇＝50：1至10:1得到75克[5'-o-二甲氧基三苯甲基-n
4-乙酰基-2'-甲氧基胞苷](腈基乙氧基硫代膦)[2'-甲氧基尿苷]纯品m5b。得率：70.75％。lcms纯度：99.42％；ms[m+h]
+
：991.3；
[0100]1h nmr(500mhz,cdcl3)δ10.45(s,1h),10.28(s,1h),10.20(s,1h),9.90(s,1h),8.51(d,j＝7.5hz,1h),8.46(d,j＝7.5hz,1h),7.66(d,j＝8.2hz,1h),7.51(d,j＝8.1hz,1h),7.40(t,j＝7.8hz,4h),7.37
–
7.25(m,15h),7.03(d,j＝7.5hz,2h),6.88(t,j＝9.4hz,8h),6.08(d,j＝15.6hz,2h),5.93(d,j＝1.8hz,1h),5.85(s,1h),5.69(d,j＝8.1hz,2h),5.12(d,j＝4.0hz,2h),4.55
–
4.47(m,1h),4.41
–
4.34(m,2h),4.30(dd,j＝10.0,6.4hz,2h),4.25
–
4.18(m,3h),4.12(m,4h),4.04(d,j＝4.3hz,2h),3.97(d,j＝4.7hz,1h),3.82(d,j＝11.4hz,13h),3.79(s,3h),3.74
–
3.67(m,3h),3.65(d,j＝6.9hz,6h),3.57(d,j＝3.7hz,6h),3.44(dd,j＝23.4,10.4hz,2h),3.37(s,1h),3.18(s,1h),2.75(t,j＝6.1hz,2h),2.57(m,2h),2.22(d,j＝8.3hz,6h),1.22(t,j＝7.0hz,3h).
[0101]
31
p nmr(202mhz,cdcl3)δ(ppm):67.21；66.72.
[0102]
实施例4
[0103]
[5'-o-二甲氧基三苯甲基-n
4-乙酰基-2'-甲氧基胞苷](腈基乙氧基硫代膦)[2'-甲氧基尿苷]-3'-[(2-氰乙基)-(n,n-二异丙基)]-亚磷酰胺1b的制备
[0104][0105]
将[5'-o-二甲氧基三苯甲基-n
4-乙酰基-2'-甲氧基胞苷](腈基乙氧基硫代膦)[2'-甲氧基尿苷]m5b(50g,1.0eq)溶解于二氯甲烷(500ml)。将四氮唑(8.84g,2.5eq)和双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(45.62g,3.0eq)加入反应体系中。10-25℃搅拌6.0小时。反应用饱和碳酸氢钠溶液(500ml*3),去离子水(500ml*3),盐水(500ml*2)洗涤,无水硫酸钠干燥。有机相浓缩至粗品1b。通过硅胶柱层析以乙酸乙酯：乙腈＝50:1至10:1层析，得到35克[5'-o-二甲氧基三苯甲基-n
4-乙酰基-2'-甲氧基胞苷](腈基乙氧基硫代膦)[2'-甲氧基尿苷]-3'-[(2-氰乙基)-(n,n-二异丙基)]-亚磷酰胺(1b)纯品。得率：60.10％，lcms纯度：99.57％；ms(m+h)
+
：1191.4；
[0106]1h nmr(500mhz,dmso)δ11.41(s,1h),10.99
–
10.92(m,1h),8.29(d,j＝7.2hz,1h),7.67
–
7.54(m,1h),7.40(d,j＝7.3hz,2h),7.33(dd,j＝14.4,7.1hz,2h),7.30
–
7.22(m,5h),7.05
–
6.96(m,1h),6.90(dd,j＝12.4,5.0hz,4h),6.00
–
5.93(m,1h),5.87
–
5.78(m,1h),5.62(d,j＝8.0hz,1h),5.14(dd,j＝10.7,4.8hz,1h),4.44
–
4.31(m,2h),4.19(m,5h),4.03
–
3.95(m,1h),3.78(m,7h),3.74
–
3.65(m,1h),3.65
–
3.57(m,2h),3.51(m,3h),3.42(d,j＝11.7hz,2h),3.35(s,2h),3.33(s,1h),2.95(m,1h),2.87
–
2.71(m,3h),2.11(s,3h),1.33
–
1.21(m,9h),1.18
–
1.10(m,12h),0.86(t,j＝6.9hz,5h)..
[0107]
31
p nmr(202mhz,dmso)δ(ppm):149.92,149.80,149.40，149.59，66.85,66.72,66.64.
[0108]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。