一种三花莸的挥发油提取纯化的方法及其应用与流程

1.本发明属于护肤品的技术领域，具体涉及一种三花莸的挥发油提取纯化的方法及其应用。


背景技术：

2.三花莸(caryopteris terniflora maxim.)为马鞭草科(verbenaeeae)莸属(caryopteris)植物，亚灌木，又名六月寒、大风寒草等。三花莸资源丰富，主要分布于四川、河南等地，有很高的生态效益及绿化价值。另外，三花莸味辛、微苦，性平，具有疏风解表、宣肺止咳、活血调经等功效，为民间常用草药，主治感冒、咳嗽、百日咳、外障目翳、产后腹痛、水火烫伤等，有较高的药用价值。
3.植物挥发油是植物体内的次生代谢物质，由分子量相对较小的简单化合物组成，具有一定芳香气味，在常温下能挥发的油状液体物质。该物质所含化学成分比较复杂，按其化学结构的不同可分为脂肪族、芳香族和萜类三大类化合物以及它们的含氧、氮、硫衍生物。植物挥发油几乎没有毒副作用，可以被广泛的应用在医药、食品、化妆品等行业，因此，研究植物挥发油有着重要的现实意义。
4.目前对仅有一篇文章报道了三花莸全草的挥发油，是用自制的水蒸气蒸馏-溶液萃取装置提取，并采用毛细管气相色谱-质谱法对成分进行了分析，共分离出50多个组分，鉴定出25个成分。这篇文章发表于1993年，并未采用气相色谱-质谱联用仪结合kovats保留指数(ri)对比的方法对挥发油的组分进行鉴定分析，其鉴定出的成分较少，并不能全面准确的分析三花莸挥发油的组成。另外，现有的技术中并没有对三花莸花中的挥发油进行提取纯化、成分分析以及用于抗氧化、美白功效的实例。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种三花莸的挥发油提取纯化的方法及其应用，并且该挥发油具有抗氧化、美白的功效。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案，
7.一种三花莸的挥发油提取纯化的方法，所述方法包括以下步骤：
8.s1取100g阴干的三花莸的花洗净晾干后粉碎至粒径为60目，加入2000g蒸馏水后搅拌进行水蒸汽蒸馏，蒸馏提取时间为5h，得含挥发油水系；
9.s2向步骤s1获得的挥发油水系中加入乙醚进行萃取，弃去分出的水层，向含挥发油的乙醚溶液中加入无水硫酸钠脱水，过滤回收乙醚即得到干燥纯净的三花莸挥发油。
10.本发明还提供一种利用三花莸的挥发油的应用，所述三花莸挥发油用于dpph自由基的清除。
11.本发明再提供一种利用三花莸的挥发油的应用，所述三花莸挥发油用于对β-胡萝卜素-亚油酸体系抗氧化。
12.本发明再提供一种利用三花莸的挥发油的应用，所述三花莸挥发油用于对酪氨酸
酶的活性抑制作用。
13.本发明再提供一种含有三花莸挥发油的应用的护肤品，所述三花莸挥发油可作为护肤品中的添加成分，其含量为0.5％-2％。
14.需要说明的是，所述护肤品可具有单一针对dpph自由基的清除或β-胡萝卜素-亚油酸体系抗氧化或酪氨酸酶的活性抑制作用的作用或及以上多种组合。
15.本发明有益效果在于，本发明的三花莸挥发油具有较高的抗氧化活性，并且对酪氨酸酶具有较高的抑制作用，可用于开发成天然抗氧化剂，以及具有抗氧化、美白淡斑效果的化妆品添加剂。
附图说明
16.图1本发明实施例2中的三花莸的挥发油对dpph自由基的清除能力数据示意图；
17.图2本发明实施例2中的三花莸的挥发油及bht对β-胡萝卜素-亚油酸氧化体系的抗氧化作用数据示意图。
具体实施方式
18.以下将对结合附图本发明作进一步的描述，需要说明的是，以下实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
19.本发明为一种三花莸的挥发油提取纯化的方法，所述方法包括以下步骤：
20.s1取100g阴干的三花莸的花洗净晾干后粉碎至粒径为60目，加入2000g蒸馏水后搅拌进行水蒸汽蒸馏，蒸馏提取时间为5h，得含挥发油水系；
21.s2向步骤s1获得的挥发油水系中加入乙醚进行萃取，弃去分出的水层，向含挥发油的乙醚溶液中加入无水硫酸钠脱水，过滤回收乙醚即得到干燥纯净的三花莸挥发油。
22.本发明还提供一种利用三花莸的挥发油的应用，所述三花莸挥发油用于dpph自由基的清除。
23.本发明再提供一种利用三花莸的挥发油的应用，所述三花莸挥发油用于对β-胡萝卜素-亚油酸体系抗氧化。
24.本发明再提供一种利用三花莸的挥发油的应用，所述三花莸挥发油用于对酪氨酸酶的活性抑制作用。
25.本发明再提供一种含有三花莸挥发油的应用的护肤品，所述三花莸挥发油可作为护肤品中的添加成分，其含量为0.5％-2％。
26.需要说明的是，所述护肤品可具有单一针对dpph自由基的清除或β-胡萝卜素-亚油酸体系抗氧化或酪氨酸酶的活性抑制作用的作用或及以上多种组合。
27.实施例1三花莸花中挥发油的成分分析
28.为了进一步鉴定三花莸挥发油的成分，本发明针对提纯后的挥发油采用气相色谱-质谱联用的方法进行分析检测
29.1.分析条件
30.色谱条件：rtx-5ms 5％dipheny-95％dimethyl polysiloxne型石英毛细管色谱柱(0.25mm
×
30m
×
0.25μm)；载气为高纯氦气,载气流速1.51ml/min；进样口温度250℃；分
流比进样，分流比为20∶1；进样量1μl；柱升温程序：起始50℃,以10℃/min升温至100℃，再以2℃/min升温至160℃，最后以20℃/min升温至250℃，保留2min。
31.质谱条件：ei离子源,离子源温度200℃,电子能量为70ev；接口温度250℃；溶剂延迟4min；电子倍增器电压为0.9kv。
32.2.成分分析及鉴定
33.(1)气相色谱质谱串联分析：待分析样品在气相色谱-三重四级杆串联质联仪中进行色谱分析和质谱分析，得到总离子流图，并记录待分析样品的各个组分的保留时间。
34.(2)测定待分析样品的保留指数：按照待分析样品的色谱分析条件和质谱分析条件对正构烷径c7～c
40
的标准样品进行气相色谱质谱串联分析，并记录每个正构烷烃标准样品的保留时间，根据公式：ri＝100n+100(rt
x-rtn)/(rt
n+1-rtn)计算待分析样品的各个组分的保留指数，式中，ri为待测化合物的保留指数；n为正构烷烃的碳原子数；rt
x
为待测化合物的保留时间min；rtn和rt
n+1
分别为碳原子数为n、n+1的正构烷烃的保留时间min，且rt
n+1
》rt
x
》rtn。
35.(3)对总离子流图的共流色谱峰进行拆分处理，根据匹配度、保留指数进行核对，以匹配度和保留指数最接近的化学结构为鉴定结果，同时运用峰面积归一化法计算三花莸花中挥发油成分的相对含量。
36.三花莸花中挥发油共检测出化学成分51种，具体化学成分见表1，可以看出，主要成分有柏木脑(7.47％)、(1s)-6,6-二甲基二环(3.1.1)庚-2-烯-2-基甲醇乙酸酯(6.43％)、大根香叶烯b(6.42％)、1-石竹烯(4.83％)、δ-荜澄茄烯(4.41％)、反式-橙花叔醇(3.33％)、α-衣兰油烯(3.30％)、氧化石竹烯(3.29％)、十六烷酸(2.29％)、α-毕橙茄醇(2.09％)、α-愈创木烯(2.03％)。
37.表1三花莸花中挥发油化学成分
38.[0039][0040]
实施例2：三花莸花中挥发油的抗氧化活性
[0041]
1.挥发油对dpph自由基的清除作用
[0042]
(1)dpph测试液的配制：精确称取8.0mg的dpph，用100ml甲醇溶解配制成0.08mg/ml的dpph溶液，避光保存，备用。
[0043]
(2)实验步骤：将实施例1制备的挥发油和阳性药物丁基化羟基甲苯(bht)配制成0.6mg/ml、0.5mg/ml、0.4mg/ml、0.3mg/ml、0.2mg/ml五个系列浓度的待测液，取2.0ml系列浓度的挥发油溶液和1.0ml dpph溶液混合记为溶液s；取2.0ml系列浓度的挥发油溶液和1.0ml甲醇混合记为溶液b；取2.0ml甲醇和1.0ml dpph溶液混合记为溶液c。将以上溶液室温避光，放置摇床中30min，于517nm处测定吸光度值as，ab，ac，每组设3个复孔，测定3次重复实验。按照公式：清除率(％)＝[1-(as-ab)/ac]
×
100％计算对dpph自由基清除率，如图1所示，并经过线性拟合求得挥发油的ic
50
值为0.45mg/ml。由图1可以看出，三花莸花中挥发油对自由基有良好的清除作用，可作为天然抗氧化剂用于食品、药品保健品或化妆品行业，代替有毒副作用的合成抗氧化剂。
[0044]
2.挥发油在亚油酸-β-胡萝卜素体系中的抗氧化作用
[0045]
取3ml 0.1mg/ml的β-胡萝卜素的氯仿溶液，加入40μl亚油酸和400μl tween-40，旋转蒸馏至氯仿完全挥干后，加入200ml去离子水，超声溶解，得乳状液a。取5ml乳状液a加入200μl 2mg/ml样品挥发油甲醇溶液，50℃孵育，检测波长470nm，180min内每隔20min测定一次吸光度。以bht为阳性对照，每组实验均平行三次。以测定的吸光度值计算挥发油以及bht在β-胡萝卜素所建立的乳化体系中的抑制率。抑制率(％)＝(1-r
sample
/r
control
)
×
100％，式中，r
sample
为挥发油及bht的降解速率，r
control
为阴性对照甲醇的降解速率；r＝ln(a/b)
×
(1/t)，其中，t为时间(min)，a为t＝0min时的吸光度，b为t＝20,40,
…
180min时的吸光度。β-胡萝卜素/亚油酸漂白体系主要评价的是抗氧化物质在乳化脂质体系中的抗氧化能力。从图2可以清晰地看出抑制率随时间变化的规律，三花莸花中挥发油的降解速率从刚开始的88.07％下降至54.82％，有效地减慢了反应体系自氧化的速率，具有较强的抗氧化作用。
[0046]
实施例3：三花莸花中挥发油的对酪氨酸酶抑制活性
[0047]
1.挥发油对酪氨酸酶单酚酶的抑制作用
[0048]
将实施例1制备的挥发油和阳性药物曲酸分别配制成不同浓度的样品溶液，该反应在96孔培养板中进行，总反应体系为200μl：不同浓度的样品溶液40μl；67mmol/l磷酸盐缓冲液80μl；100u/ml酪氨酸酶溶液40μl；2.5mmol/l l-酪氨酸40μl。调零孔仅加67mmol/l磷酸盐缓冲液200μl。加样完毕后，混匀，将其置于37℃水浴孵箱中孵育20min，用酶联免疫检测仪检测反应产物在490nm波长处的特异性吸光值，重复测试3次。
[0049]
按照以下公式计算样品挥发油和曲酸对酪氨酸酶单酚酶的抑制作用。抑制率(％)＝[1-(a
1-a2)/(a
3-a4)]
×
100％，式中：a1、a2、a3、a4分别是样品组、样品背景组(pbs代替酪氨酸酶)、空白组(蒸馏水代替样品)、空白背景组(蒸馏水代替样品、pbs代替酪氨酸酶)的吸光度。同时以抑制率对抑制剂浓度作图，根据抑制曲线求得样品和曲酸的ic
50
值。
[0050]
2.挥发油对酪氨酸酶双酚酶的抑制作用
[0051]
参照上述单酚酶抑制作用步骤，以2.5mmol/l l-多巴溶液替代2.5mmol/l l-酪氨酸溶液，于37℃下继续孵育20min，振荡后立即于490nm处测定吸光度。按照式4.1中公式计算挥发油和曲酸对酪氨酸酶双酚酶抑制率，并求得ic
50
值。结果如表2所示。
[0052]
表2三花莸花中挥发油对酪氨酸酶的抑制作用
[0053][0054]
综合上述实施例可知，本发明从三花莸花中提取纯化了一种挥发油，共分析鉴定出51种化合物，测试结果表明，三花莸花中挥发油具有较高的抗氧化活性，并且对酪氨酸酶具有较高的抑制作用，可用于开发成天然抗氧化剂，以及具有抗氧化、美白淡斑效果的化妆品添加剂。
[0055]
对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。