一株大豆根瘤菌及其应用

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株大豆根瘤菌及其应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.大豆是重要的食用与饲用作物，为人类提供优质的油脂和蛋白质资源，随着我国生活水平和饮食结构的变化，畜禽产业对大豆饲料的需求逐年增加。然而，我国耕地资源有限，大豆的单产低于主粮作物，为了保障粮食总产量不下降，扩大大豆种植面积必须在不与粮争地的情况下完成。盐碱地是我国重要的、不可或缺的后备土地资源，其中具有农业利用潜力的达2亿亩，占我国耕地总面积的10％，增加盐碱地大豆种植面积和产量是振兴我国大豆产业的有力途径。盐碱地高盐高碱的不利条件胁迫大豆生长，限制大豆产量，通过技术手段提高大豆抗性或改良盐碱地成为当前必须努力攻克的难点。
4.接种根瘤菌可增强大豆对盐胁迫的耐受性，从而提高盐碱地大豆的产量。根瘤菌是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌，能与豆科植物根茎形成根瘤或茎瘤，将空气中的氮素固定为植物可吸收利用的氨，从而促进作物生长，并在土壤肥力的改良和保持中发挥重要作用。对根瘤菌的生物地理学研究发现，在特定环境条件下，根瘤菌会与宿主植物协同进化，且优良菌种多来自于宿主植物种植的同一地区。因此，在盐碱地原位筛选土著大豆根瘤菌及其应用是促进盐碱地大豆增产的有效措施。


技术实现要素：

5.基于上述现有技术的不足，本发明提供一株大豆根瘤菌及其应用，该菌株是从耐盐碱大豆根瘤中分离、筛选、纯化及鉴定等技术获得，属于费氏中华根瘤菌(sinorhizobium fredii)。经实验证明，其本身具有极佳的抗逆性，且代时短，生长繁殖迅速，同时能够有效促进盐碱地大豆结瘤和生长，达到大豆促生增产的效果，因此具有良好的实际应用之价值。
6.为实现上述技术目的，本发明涉及以下技术方案：
7.本发明的第一个方面，提供一株费氏中华根瘤菌(sinorhizobium fredii)dy23-9，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2021年10月27日，保藏编号为cgmcc no.23670。
8.所述费氏中华根瘤菌dy23-9的代谢物也属于本发明的保护范围。
9.本发明的第二个方面，提供上述费氏中华根瘤菌dy23-9的培养方法，所述培养方法包括将所述费氏中华根瘤菌dy23-9接种至发酵培养基进行发酵培养。
10.其中，所述发酵培养基可以是酵母甘露醇培养基。
11.本发明的第三个方面，提供一种菌剂，其包括上述第一方面所述的费氏中华根瘤
菌dy23-9或其发酵物或其代谢产物。
12.本发明所述的代谢产物包括菌体胞内代谢产物和/或胞外代谢产物。
13.本发明的第四个方面，提供一种菌肥，所述菌肥包括上述第一方面所述的费氏中华根瘤菌dy23-9或其发酵物或其代谢产物或第三方面菌剂。
14.本发明的第五个方面，上述费氏中华根瘤菌dy23-9、菌剂和/或菌肥在如下1)-2)中全部或部分中的应用也是本发明保护的范围：
15.1)促进大豆结瘤；
16.2)促进大豆生长。
17.其中，所述应用1)和2)中，大豆生长环境为盐碱环境。
18.所述应用1)中，促进大豆结瘤具体表现包括但不限于提高大豆结瘤数量、根瘤鲜重和根瘤直径。
19.所述应用2)中，促进大豆生长具体表现包括但不限于提高植株株高和茎粗。
20.本发明的第六个方面，提供一种在盐碱地环境中栽培生产大豆的方法，所述方法包括：在大豆播种时，施加上述费氏中华根瘤菌dy23-9、菌剂和/或菌肥。
21.上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
22.1)上述技术方案一株盐碱地土著根瘤菌，为盐碱地大豆种植提供新的微生物种质资源，为开发盐碱地适宜的大豆种植绿色投入品，促进大豆产业发展提供基础。
23.2)盐碱地高盐高碱的不利条件胁迫大豆植株生长，限制大豆产量。上述技术方案提供的大豆根瘤菌菌株dy23-9能够有效促进盐碱地大豆结瘤和生长，达到促生增产的效果。
24.3)上述技术方案在黄河三角洲农业高新技术产业示范区布置核心田间试验点，开展了菌株dy23-9在盐碱地的大田施用效应研究，效果良好，具有很好的开发应用前景。
附图说明
25.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
26.图1为本发明实施例1中菌株dy23-9在yma平皿培养基的菌落形态和经革兰氏染色后在显微镜下的形态；
27.图2为本发明实施例1中菌株dy23-9的16srdna序列系统发育树状图；
28.图3为本发明实施例2中菌株dy23-9的生长曲线和代时；
29.图4为本发明实施例2中菌株dy23-9的盐度、温度和酸碱度耐受性评价；
30.图5为本发明实施例3中在盐碱土盆栽接种菌株dy23-9对大豆结瘤的影响；
31.图6为本发明实施例3中盐碱土盆栽接种菌株dy23-9植株表型图；
32.图7为本发明实施例4中在盐碱地大田接种菌株dy23-9对大豆生长的影响；
33.图8为本发明实施例4中盐碱地大田接种菌株dy23-9植株表型图。
具体实施方式
34.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通
常理解的相同含义。
35.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
36.如前所述，接种根瘤菌可增强大豆对盐胁迫的耐受性，从而提高盐碱地大豆的产量。盐碱地特殊的生境驯化出了适应其条件的根瘤菌，有针对性地筛选能够耐受盐碱环境、能够与耐盐碱大豆共生的根瘤菌，是有效提高盐碱地大豆产量的核心。
37.有鉴于此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一株费氏中华根瘤菌(sinorhizobium fredii)dy23-9，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2021年10月27日，保藏编号为cgmcc no.23670。
38.所述费氏中华根瘤菌dy23-9的特性如下：
39.菌体特征：光学显微镜下呈短杆状，长约2-4μm，革兰氏染色后呈红色，为革兰氏阴性菌，菌体内部有被染红的横膈。
40.菌落特征：在酵母甘露醇琼脂(yma)平皿培养基上，形成圆形或近似圆形、粘稠、光滑、微微凸起、乳白色菌落。在含刚果红染料的yma培养基上菌落呈粉红色。
41.其16s rdna序列如seq id no.1所示。
42.所述费氏中华根瘤菌dy23-9的代谢物也属于本发明的保护范围。
43.本发明的又一具体实施方式中，提供上述费氏中华根瘤菌dy23-9的培养方法，所述培养方法包括将所述费氏中华根瘤菌dy23-9接种至发酵培养基进行发酵培养。
44.其中，所述发酵培养基可以是酵母甘露醇培养基，所述酵母甘露醇培养基具体组成为：酵母浸粉1g/l，甘露醇10g/l，硫酸镁0.2g/l，氯化钠0.1g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，ph值6.8-7.2。
45.本发明的又一具体实施方式中，提供一种菌剂，其含有所述费氏中华根瘤菌dy23-9或其发酵物或其代谢产物。
46.本发明所述的代谢产物包括菌体胞内代谢产物和/或胞外代谢产物。
47.本发明中，术语“发酵物”用于指代发酵产品。相应的发酵物可以是从发酵培养费氏中华根瘤菌dy23-9细菌的过程获得的液体，因此，也可称为发酵液；液体可以含有细菌(菌体)，但并不必然需要含有细菌。液体优选的含有由本发明的费氏中华根瘤菌dy23-9产生的代谢物。
48.以及，在本发明的实施方式中，包含菌体的发酵液或培养液经离心、过滤、沉降或所属领域中已知的其他手段将在发酵液或培养液中生长的菌体细胞与液体分离，去除菌体细胞时所剩余的液体为“上清液”，并且在本发明中，上清液内含有费氏中华根瘤菌dy23-9的胞外代谢产物。在本发明的实施方式中，所述菌剂也可以包含该上清液。
49.以及，在本发明的实施方式中，包含菌体的发酵液或培养液经离心、过滤、沉降或所属领域中已知的其他手段将在发酵液或培养液中生长的菌体细胞与液体分离获取菌体，菌体可进行破碎获取菌体破碎物，破碎方式可以为超声(比如冰浴超声破碎细胞)或者本领域已知的其他手段，或者，更进一步的，对该菌体破碎物离心收集上清液，该上清液记为无
细胞提取物，并且在本发明中，该菌体破碎物或无细胞提取物内含有费氏中华根瘤菌dy23-9的胞内代谢产物。在本发明的实施方式中，所述菌剂也可以包含该菌体破碎物或无细胞提取物。
50.以及，在本发明的实施方式中，为方便存储、运输，提高菌株存活率等，所述菌剂也可以是固体，进一步优选为冻干粉剂。即针对上述费氏中华根瘤菌dy23-9或其发酵物或其代谢产物进一步进行冷冻干燥获得，所述冷冻干燥技术(包括真空冷冻干燥技术)可采用常规方法进行。
51.本发明的又一具体实施方式中，所述菌剂中，除含活性成分外，还含有载体。所述载体可为微生物制剂领域常用的且在生物学上是惰性的载体。
52.所述载体可为固体载体或液体载体；
53.所述固体载体可为矿物材料、植物材料和/或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、麦饭石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉、稻壳粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇或/和聚二醇；
54.所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷或/和十二烷。
55.所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂；优选为粉剂。
56.根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、ph调节剂等。
57.本发明的又一具体实施方式中，提供一种菌肥，所述菌肥包括上述第一方面所述的费氏中华根瘤菌dy23-9或其发酵物或其代谢产物或第三方面菌剂。
58.本发明的又一具体实施方式中，上述费氏中华根瘤菌dy23-9、菌剂和/或菌肥在如下1)-2)中全部或部分中的应用也是本发明保护的范围：
59.1)促进大豆结瘤；
60.2)促进大豆生长。
61.所述应用1)中，促进大豆结瘤具体表现包括但不限于提高大豆结瘤数量、根瘤鲜重和根瘤直径。
62.所述应用2)中，促进大豆生长具体表现包括但不限于提高植株株高和茎粗。
63.因此，本发明的又一具体实施方式中，提供提供一种在盐碱地环境中栽培生产大豆的方法，所述方法包括：在大豆播种时，施加上述费氏中华根瘤菌dy23-9、菌剂和/或菌肥。
64.以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
65.实施例1：菌株dy23-9的捕获、分离、纯化与鉴定
66.1.1菌株的捕获
67.从山东省东营市黄河三角洲农业高新技术产业示范区核心区大豆小区种植试验田，随机间隔20-30米取地表至地下10cm盐碱土层，得到27个盐碱土样品。
68.取大小适中，结构完整的大豆种子，95％乙醇处理1min，无菌水洗2-3次，1％次氯
酸钠溶液处理5min，无菌水洗5-7次，置于0.7％琼脂培养基28℃催芽48h，后胚根朝下植入盛有东营土壤的穴盘，在种子周围施加4ml低氮营养液，随后不定期浇无菌水保持土壤湿润，每个土壤样品设3个重复。
69.1.2菌株的分离和纯化
70.待大豆植株进入三叶期后，用无菌水洗出全部根系，减掉无根瘤根系，将留下的结有根瘤的根系以95％乙醇处理5min，无菌水洗2-3次，20％次氯酸钠溶液处理15min，无菌水洗5-7次。在超净工作台，用无菌刀片切开根瘤，无菌接种针挑取根瘤内部粉色组织，在淀粉甘露醇琼脂(yma)培养基上划线，而后28℃恒温培养，直至清晰菌落出现。
71.挑取单菌落在新的yma培养基划线纯化二次，挑取单菌落转接yma斜面，并将获得的菌株命名为dy23-9。
72.yma固体培养基的组成为(1l)：硫酸镁0.2g，酵母提取物1.0g，甘露醇10.0g，氯化钠0.1g，磷酸二氢钾0.5g，琼脂15.0g，刚果红0.025g。ph调至7.0。
73.1.2菌株的鉴定
74.(1)菌株的形态学鉴定
75.将菌株dy23-9接种在yma固体培养基上进行培养，在28℃培养72h后，菌落为圆形或近似圆形、边缘整齐、半透明、粘稠、直径2.0-5.0mm。光学显微镜下菌体呈短杆状，两端圆钝，0.4-0.9
×
1.6-3.0μm，无芽孢，革兰氏染色阴性，细胞中常见横膈。
76.(2)菌株的16srrna基因序列鉴定
77.利用细菌通用引物对27f(5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’，seq id no.2)和1492r(5
’‑
tacggctaccttgttacgactt-3’，seq id no.3)扩增16srrna基因。pcr反应体系(50μl)：上下游引物各2μl，2
×
taqmixdna聚合酶25μl，triton(x100)1μl，灭菌ddh2o19μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸45s，扩增35个循环；72℃补偿延伸5min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，由上海生工工程股份有限公司对扩增产物进行双向测序，以cexpress 3.0软件拼接双向测序所得序列，剪切掉序列两端峰图不清楚的约20bp碱基，所得序列即为dy23-9的16s rrna基因序列seq id no.1。
78.将dy23-9的16s rrna基因序列在美国生物信息中心(ncbi)进行blast比对，选择相似性高的模式菌作为参比菌株，利用mega 11软件中的邻接法(neighbor-joining)进行16s rrna基因系统发育树的构建，见图2。菌株dy23-9与sinorhizobium fredii sp.同属一个遗传分枝，亲缘关系最近；与登录号为ay260149的sinorhizobium fredii模式菌株usda205序列同源性达到99.70％；与登录号为eu145985.1的sinorhizobium sp.序列同源性最高，达到99.78％。从而确定菌株dy23-9为费氏中华根瘤菌(sinorhizobium fredii)的一个新菌株。
79.该菌株已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏日期：2021年10月27日。保藏编号为cgmccno.23670。
80.实施例2：菌株dy23-9的生理功能评价
81.2.1菌株的生长曲线和代时
82.将菌株dy23-9接种至ym液体培养基中，28℃、150r/min条件下培养，每8h取样，用酶标仪在600nm波长下测定菌液的od值，并绘制生长曲线，结果见图3，对数生长期在32h内，
32h后od600值趋于稳定，表明生长进入稳定期。由对数生长期od600值的翻倍时间计算出菌株dy23-9的世代时间为3.0h，生长速度较快。
83.2.2菌株的抗逆性评价
84.以ph为7的yma培养基28℃培养为基础，设置不同盐浓度(0％、1％、2％、3％、4％、5％nacl)、不同温度(14℃、21℃、28℃、35℃、42℃)、不同ph(5、7、9、11)等单因素变量处理。各处理以无菌牙签划线接种菌株dy23-9和大豆根瘤菌模式菌株usda110，静置培养3d，观察菌落是否生长，扫描记录菌落生长形态。
85.结果见图4，菌株dy23-9比模式菌株usda110有更强的盐耐受性，能够在含2％nacl的yma培养基上保持正常生长，3％及以上浓度的nacl处理下，菌株dy23-9生长受到抑制。菌株dy23-9比模式菌株usda110有更广泛的温度适应性，在14℃、21℃和35℃下均能够正常生长，35℃下培养比28℃有更高的生物量。菌株dy23-9比模式菌株usda110有更强的耐碱性，能够在ph为9.0的碱性yma培养基上保持正常生长。
86.实施例3：菌株dy23-9对盐碱土盆栽大豆结瘤的影响
87.本实施例在山东省科学院生物研究所工业微生物实验室里进行。挑选大小适中，结构完整的大豆种子，95％乙醇处理1min，无菌水洗2-3次，1％次氯酸钠溶液处理5min，无菌水洗5-7次，置于0.7％琼脂培养基28℃催芽48h，然后胚根朝下植入盛有东营盐碱土壤的组培瓶，在种子周围施加10ml低氮营养液，接菌处理在种子周围加入1ml酵母甘露醇液体培养3d的dy23-9菌液，空白对照处理在种子周围加入1ml无菌水，随后不定期浇无菌水保持土壤湿润，每个处理设12个重复，在光照培养箱中培养，每天25℃光照16h、20℃黑暗8h。植株生长至第3组三叶展开后(30d左右)，取出完整根系，测量根瘤数量、根瘤鲜重和根瘤最大直径等指标。
88.供试微生物：菌株dy23-9；供试植物：大豆tzx-805。
89.结果见图5和图6，菌株dy23-9显著提高(p《0.05)大豆结瘤数量、根瘤鲜重和根瘤直径。与对照组相比，接菌处理组大豆的根瘤数量、根瘤鲜重和根瘤最大直径分别增加了78.3％、62.3％和23.2％。以上结果表明，菌株dy23-9可以在盐碱土环境下显著促进大豆结瘤。
90.实施例4：菌株dy23-9对盐碱地田间大豆生长情况的影响
91.本实施例在山东省东营市黄河三角洲农业高新技术产业示范区进行。以常规种植为对照组(ck)，接菌处理在播种时在种子周围施加400ml/亩的菌株dy23-9在酵母甘露醇液体培养基培养7d的菌液，其余与对照组相同。菌液要求od
600
值大于1.0。每个处理设6个重复。种植期共100d，在80d进行田间调查，测量株高、茎粗等生长表型数据。
92.结果见图7和图8，菌株dy23-9显著提高(p《0.05)大豆植株株高和茎粗。在盐碱地大田条件下，接种菌株dy23-9处理的大豆株高比ck增加了25.1％，茎粗增加13.5％。以上结果表明，接种菌株dy23-9在盐碱地大田条件下能显著促进大豆植株生长。
93.最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所
属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。