OGN基因作为生物标志物在制备诊断胰腺癌的试剂盒中的应用

ogn基因作为生物标志物在制备诊断胰腺癌的试剂盒中的应用
技术领域
1.本发明属于胰腺癌检测和治疗技术领域，尤其涉及ogn基因作为生物标志物在制备诊断胰腺癌的试剂盒中的应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤是一种非传染性流行病，其难治愈性和致死性成为严重危害人类生命健康的疾病之一。胰腺恶性肿瘤属消化系统肿瘤一类，由于其诊断困难且暂无良好的治疗方法，5年总生存率低，世界范围内胰腺癌的发病率和死亡率均呈上升趋势。因此，了解肿瘤的发生机制对开发相关药物至关重要。细胞外基质(extracellular matrix，ecms)可调节肿瘤细胞的生长发育，其在人体发育、维持体内稳态和病理反应中发挥重要作用。肿瘤组织中，ecms可引起肿瘤微环境的动态变化，其通过调控肿瘤增殖信号的传递和肿瘤细胞的增殖和侵袭能力，从而影响肿瘤的发展过程。其中，slrps作为一种基质蛋白聚糖，参与炎症、纤维化和细胞增殖等多种过程，在各类肿瘤细胞增殖和迁移过程中发挥一定调节作用(frikeche j,maiti g,chakravarti s.small leucine-rich repeat proteoglycans in corneal inflammation and wound healing[j].exp eye res,2016,151:142-9.；chen s w,tung y c,jung s m,et al.；simoes r s,soares j m,jr.,simoes m j,et al.small leucine-rich proteoglycans(slrps)in the endometrium of polycystic ovary syndrome women:a pilot study[j].j ovarian res,2017,10(1):54)。在iii类slrp家族中，存在一种多糖基化位点蛋白ogn，ogn在哺乳动物的骨骼中具有多种功能，并以其诱导骨形成的功能而命名为骨诱导因子，随后因其体积较小且功能多样复杂，改名为ogn(costa r a,martins r s t,capilla e,et al.vertebrate slrp family evolution and the subfunctionalization of osteoglycin gene duplicates in teleost fish[j].bmc evol biol,2018,18(1):191)。研究已证实ogn参与多种生理进程(xu t,zhang r,dognm et al.osteoglycin(ogn)inhibits cell proliferation and invasiveness in breast cancer via pi3k/akt/mtor signaling pathway.onco targets ther 2019；12:10639-10650.)，tasheva等通过ogn-null小鼠研究进一步发现，ogn缺失可诱导胶原纤维生成和肠道平滑肌细胞分化(tasheva e s,koester a,paulsen a q,et al.mimecan/osteoglycin-deficient mice have collagen fibril abnormalities[j].mol vis,2002,8:407-15.)；体外ogn敲除实验发现，ogn敲除可促进血管紧张素ii(angiotensinⅱ，angii)和血小板源性生长因子(platelet derived growth factor，pdgf)等增殖相关细胞因子的表达，从而促进血管平滑肌细胞的增殖(gu x s,lei j p,shi j b,et al.mimecan is involved in aortic hypertrophy induced by sinoaortic denervation in rats[j].mol cell biochem,2011,352(1-2):309-16.)。ogn功能具有多样性，在多种疾病中发挥着重要作用。目前，已在多种疾病组织中发现ogn基因的特异性表达，如关节炎等骨疾病、动脉粥样硬化等心血管疾病、喉部恶性肿瘤、直结肠恶性肿瘤和肺部恶性肿瘤等肿瘤疾病、青光眼等眼部
疾病。
[0003]
id4全称dna结合抑制因子4(inhibitor ofdna binding 4，id4)，属于dna结合抑制因子家族。id4在调控细胞的增殖凋亡、肿瘤形成、侵袭和迁移过程发挥重要作用。其在人体中分布广泛，在脑组织、胰腺癌组织、精原细胞、甲状腺、睾丸中存在表达，且在前列腺和乳腺的发育过程中起着不可代替的作用。id4基因在肿瘤形成过程中既可以是促癌基因的角色，也可以是抑癌基因的角色。其在神经系统中及肿瘤血管形成机制中起着促癌基因作用，在急性白血病、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、胃癌、食道癌等中是抑癌基因。在结直肠癌中，其通过以ck18依赖的方式抑制pi3k/akt途径抑制结直肠癌细胞的生长和转移(chen hj,yu y,sun yx et al.id4 suppresses the growth and invasion ofcolorectal cancer hct116 cells through ck18-related inhibition of akt and emt signaling.j oncol 2021；2021:6660486.)。在肝癌中，它的表达促进肝癌细胞的增殖及体外克隆形成(zhang y,zhang lx,liu xq et al.id4 promotes cell proliferation in hepatocellular carcinoma.chin j cancer 2017；36:19.)。在肺癌中，它可通过锌指转录因子(slug)促进e-钙黏素(e-cadherin)的表达，引起上皮细胞-间充质转化(emt)，并抑制癌症转移(wang cc,hsu yl,chang cj et al.inhibitor of dna-binding protein 4 suppresses cancer metastasis through the regulation ofepithelial mesenchymal transition in lung adenocarcinoma.cancers(basel)2019；11(12):2021)。而ogn与id4在胰腺癌发生发展中的关系至今未见报道。


技术实现要素：

[0004]
有鉴于此，本发明的目的在于提供ogn基因作为生物标志物在制备诊断胰腺癌的试剂盒中的应用；发明人研究发现ogn基因在胰腺癌细胞中的表达水平显著高于癌旁组织，过表达ogn基因能够增强胰腺癌细胞活性，促进胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭，抑制凋亡；而抑制ogn基因的表达，能够降低胰腺癌细胞的活性，抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭，促进凋亡。因此，ogn基因能够作为胰腺癌诊断的生物标志物，并能够作为胰腺癌治疗的靶点。
[0005]
本发明提供了ogn基因作为生物标志物在制备诊断胰腺癌的试剂盒中的应用。
[0006]
优选的，所述试剂盒包括检测ogn基因的引物组，所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0007]
本发明提供了过表达ogn基因的试剂在促进胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭中的应用。
[0008]
优选的，所述过表达ogn基因的试剂包括用于过表达ogn基因的重组载体。
[0009]
优选的，所述重组载体以pcmv3-c-myc质粒为初始载体。
[0010]
本发明提供了过表达ogn基因的试剂在抑制胰腺癌细胞凋亡中的应用。
[0011]
本发明提供了ogn基因表达的抑制剂在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。
[0012]
优选的，所述ogn基因表达的抑制剂包括以ogn基因为靶基因的sirna。
[0013]
优选的，所述sirna的序列如seq id no.3所示和seq id no.4所示。
[0014]
本发明还提供了ogn基因作为dna结合抑制因子4表达促进剂的应用。
[0015]
本发明提供了ogn基因作为生物标志物在制备诊断胰腺癌的试剂盒中的应用；本发明所述的ogn基因在胰腺癌细胞中的表达明显高于胰腺正常组织细胞；利用mtt和cck8法检测，发现过表达ogn基因可显著增强胰腺癌的细胞活性；edu、tunel荧光检测表明，过表达ogn基因能够促进胰腺癌细胞增殖，抑制胰腺癌细胞凋亡；real-time pcr实验发现，过表达ogn基因是通过调控细胞增殖和凋亡相关基因的表达来实现其作用的；细胞迁移和侵袭实验发现，过表达ogn基因能够明显增强胰腺癌细胞迁移及侵袭能力；过表达本发明所述的ogn基因能够促进id4的表达，说明id4是ogn基因下游调控分子之一；本发明所述的ogn基因能够作为诊断胰腺癌有效的血清标志物。同时，以ogn基因或id4基因为靶点，抑制靶点基因的表达是治疗胰腺癌的有效方法，本发明提供的以ogn基因作为胰腺癌的生物标志物具有较大的研究前景和临床价值。
附图说明
[0016]
图1为ogn基因在胰腺癌组织中的表达情况，其中a为gepia数据库中胰腺癌组织样本与正常胰腺组织样本ogn基因的表达情况；b为不同病理分期的胰腺癌患者胰腺癌组织样本中ogn基因的表达水平；
[0017]
图2为ogn基因高表达和低表达胰腺癌患者生存率差异，其中a和b分别为使用gepia数据库对ogn基因高、低表达胰腺癌患者总体生存率和无疾病生存率分析；
[0018]
图3为胰腺癌组织细胞和胰腺正常组织细胞ogn基因的表达水平，其中a为western blot法检测癌旁组织和癌组织中ogn蛋白表达水平，(***p《0.001，n＝4)；b为real-time pcr法检测ogn基因在胰腺正常细胞hpde6-c7和胰腺癌细胞bxpc-3的表达水平(***p＜0.01，n＝3)；
[0019]
图4为免疫组化法观察不同病理分期胰腺癌组和癌旁组ogn基因的表达情况；
[0020]
图5为ogn基因过表达对胰腺癌细胞活性的影响，其中a为real-time pcr法检测质粒转染成功；b为采用mtt法，在570nm处测定空转染和ogn基因过表达的胰腺癌bxpc-3细胞吸光度，c为采用cck8法分别在450nm处测定空转染和ogn基因过表达的胰腺癌bxpc-3细胞吸光度，(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，n＝5)；
[0021]
图6为ogn基因过表达对胰腺癌细胞增殖的影响，其中a为edu法检测细胞增殖的情况；b为edu法检测阳性荧光细胞所占比例(***p＜0.001，n＝5)；
[0022]
图7为ogn过表达对增殖相关基因的影响，其中a～d分别为cyclin a2、cyclin b1、cyclin d1、pcna基因在空转染和ogn基因过表达的胰腺癌bxpc-3细胞中的表达水平(**p＜0.01，***p＜0.001，n＝8)；
[0023]
图8为ogn基因过表达对胰腺癌细胞凋亡的影响，其中a为tunel法检测细胞凋亡的情况；b为tunel法检测阳性细胞所占比例(**p《0.01，n＝8)；
[0024]
图9为ogn基因过表达对胰腺癌细胞凋亡相关基因表达影响，其中a～e分别为p21、p53、bax、bcl-2及bax/bcl-2在空转染和ogn基因过表达的胰腺癌bxpc-3细胞中的表达水平(*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，n＝4-6)；
[0025]
图10为ogn基因过表达对胰腺癌细胞迁移速率的影响，其中a为细胞在24h、48h中间区域的细胞迁移情况，b为细胞伤口愈合面积百分比(*p＜0.05，**p《0.01，n＝3)；
[0026]
图11为ogn基因过表达对胰腺癌细胞侵袭作用的影响，其中a为用显微镜观察视野
内细胞的迁移数目；b为在control组和ogn组随机取六个视野对细胞数目计数后取平均值，进行统计(**p＜0.01，n＝4)；
[0027]
图12为ogn基因与id4在胰腺癌中表达水平的相关性分析；
[0028]
图13为id4在胰腺癌细胞中的表达水平，其中a为real-timepcr法检测id4在两组细胞中的rna表达水平(**p＜0.01，n＝8)；b为westernblot法检测id4在两组细胞中的蛋白表达水平(*p＜0.05，**p＜0.01，n＝4)；
[0029]
图14为id4基因在ogn过表达胰腺癌细胞中的表达水平，其中a为real-timepcr法检测id4在两组细胞中的rna表达水平，*p＜0.05，n＝8；b为westernblot法检测id4在两组细胞中的蛋白表达水平(*p＜0.05，n＝4)。
具体实施方式
[0030]
本发明提供了ogn基因作为生物标志物在制备诊断胰腺癌的试剂盒中的应用。
[0031]
在本发明中，所述试剂盒包括检测ogn基因的引物组，所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；具体如下：
[0032]
ctacttggaccataatgccctg(seq id no.1)；
[0033]
gtcccggatgtaactggtgtc(seq id no.2)。
[0034]
在本发明中，所述试剂盒还包括检测ogn基因的试剂，优选的包括real-time pcr检测过程中使用的试剂。本发明对所述具体的试剂的种类和厂家没有特殊限定，采用常规的real-time pcr检测试剂能够实现ogn基因的检测即可。
[0035]
本发明还提供了过表达ogn基因的试剂在促进胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭中的应用以及过表达ogn基因的试剂在促进抑制胰腺癌细胞凋亡中的应用。
[0036]
在本发明中，所述过表达ogn基因的试剂包括用于过表达ogn基因的重组载体；本发明对所述重组载体的具体种类以及ogn基因的插入位点没有特殊要求，能够在细胞中实现过表达ogn基因即可。本发明对所述重组载体的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的重组载体的制备方法即可。在本发明具体实施过程中，所述重组载体购自北京义翘神州科技公司，名称：pcmv3-ogn-myc，所述重组载体通过将ogn基因的orf区域共897bp插入载体pcmv3-c-myc质粒中获得。本发明对所述重组载体转化细胞的具体方法没有特殊限定，优选的采用lipofectamine 2000实现转染进入细胞。
[0037]
在本发明中，过表达ogn基因能够增强胰腺癌细胞活性，促进胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭，抑制凋亡；过表达ogn基因的上述应用，在胰腺癌细胞培养，研究胰腺癌细胞的性能等方面具有重大意义；能够为科研人员提供性能更为良好、更稳定的研究材料。
[0038]
本发明还提供了ogn基因表达的抑制剂在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。
[0039]
在本发明中，所述ogn基因表达的抑制剂包括任意能够抑制ogn表达的物质，优选的，所述ogn基因表达的抑制剂包括以ogn基因为靶基因的sirna；进一步优选的，所述sirna的序列如seq id no.3所示和seq id no.4所示；具体如下：
[0040]
s：5
’‑
gccaagauuaugaggauaatt-3’(seq id no.3)；
[0041]
as:：5
’‑
uuauccucauaaucuuggctt-3’(seq id no.4)。
[0042]
在本发明中，所述sirna能够抑制ogn基因的表达，降低胰腺癌细胞的活性，抑制胰
腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭，促进凋亡；能够用来制备治疗胰腺癌的药物。
[0043]
本发明还提供了ogn基因作为dna结合抑制因子4表达促进剂的应用。在本发明中，过表达所述ogn基因能够促进胰腺癌细胞中dna结合抑制因子4(以下简称id4)的表达；id4在ogn基因过表达的胰腺癌细胞中表达水平明显升高；所述胰腺癌细胞以胰腺癌bxpc-3细胞为例。
[0044]
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0045]
本发明实施例中用到的主要仪器和试剂如下：
[0046]
仪器：
[0047][0048][0049]
试剂：
[0050][0051]
sds-page凝胶快速配置试剂盒(a+b)、western一抗二抗去除液(强碱性)、beyonceecl stara、b液、tubulin抗体(小鼠单抗)、cck-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、mtt细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、tunel细胞凋亡检测试剂盒和beyoclick edu-488细胞增殖检测试剂盒均购自上海碧云天生物科技有限公司。
[0052]
实施例中涉及到的数据统计均以平均数
±
标准误(mean
±
sem)表示，比较采用t检验，用graphpad prism 6.0软件进行统计分析，p《0.05作为显著性差异标准。
[0053]
实施例1
[0054]
为检测ogn基因的表达与胰腺癌发病是否有关，使用gepia在线数据库分析了胰腺癌患者癌组织和正常胰腺组织中及胰腺癌患者不同病理分期ogn基因的表达水平；具体的方法如下：在浏览器搜索gepia，在搜索框中搜索ogn，分别选择boxplots，stage plot，survival analysis在搜索框输入paad，即得到图1和图2所示图像。
[0055]
分析结果发现在胰腺癌组织中ogn基因的表达明显高于正常胰腺组织(图1中的a)且以ⅲ期胰腺癌患者中ogn基因表达水平最高(图1中的b)。
[0056]
通过gepia在线数据库分析了ogn基因高表达和低表达胰腺癌患者的总体生存率与无疾病生存率差异，分析结果如图2所示，显示ogn基因高表达患者5年生存率明显低于ogn基因低表达患者。
[0057]
实施例2
[0058]
为测定正常胰腺组织细胞和胰腺癌组织细胞ogn基因表达的差异，使用正常胰腺组织细胞作为对照组，与胰腺癌组织细胞培养至相同状态，经过westernblot和real-time pcr法检测ogn基因的蛋白和rna的表达水平。具体方法如下：
[0059]
western blot法
[0060]
正常胰腺组织细胞和胰腺癌组织细胞在含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的
ripa缓冲液中裂解。定量后，将80μg的蛋白质样品装载在10％或12％的sds-page凝胶上并转移到硝酸纤维素膜上。用溶解在pbs中的5％脱脂牛奶封闭2h，然后在4℃下用一级抗体孵育12h；以tubulin作为内参。用二抗孵育后，用显影仪进行显影。
[0061]
real-time pcr法
[0062]
正常胰腺组织细胞和胰腺癌组织细胞分别用trizol试剂裂解后，提取rna，测浓度，洗涤提纯后，反转录为cdna，以cdna为模板，以seq id no.1和seq id no.2为引物进行real-time pcr，测定ogn基因的表达状况。具体步骤如下：
[0063]
(1)提取rna
[0064]
每3
×
106个细胞加入1ml trizol试剂，刮下细胞，转移至的1.5ml ep管中，标记；加入0.2ml氯仿溶液萃取，剧烈震荡5min，于12000g，4℃离心条件15min，吸取上层清液300μl，转移至另一1.5ml ep管中，标记，加入0.5ml异丙醇进行沉淀，静置10min，于12000g，4℃离心条件离心10min，弃上层清液，加入1ml 75％乙醇，涡旋，离心，弃上层清液，室温干燥，加入20μl depc水，反复吹打沉淀部位，溶解rna，转移至0.2ml ep管中，置于热循环仪中58℃加热12min，测定rna浓度。
[0065]
(2)去除dna
[0066]
取2个0.2ml ep管，做好标记，使用2μl的rna，各加入5μl 5x gdna eraserbuffer、2.5μgdnaeraser，加入depc水至25μl，室温静置5min。
[0067]
(3)反转录
[0068]
去除dna后加入2.5μl primescript rt enzyme mix 1、2.5μl rt primer mix、10μl 5x primescript buffer 2、10μl depc水(所用试剂来自试剂盒：primescript
tm rt reagent kit with gdna eraser，takara公司)，涡旋，离心后，于热循环仪中37℃15min，85℃5s，得到50μl cdna。
[0069]
(4)配制pcr反应液
[0070]
反应体系：配制扩增ogn基因的pcr反应液，每孔添加tb green premix ex taq ii 5μl，上下游引物各0.5μl，dna模板1μl，depc水3μl，共10μl，离心，进行real-time pcr，记录和分析最终数据。
[0071]
real-time pcr的扩增程序：
[0072]
两步法pcr扩增标准程序：样品体积：10μl
[0073]
step 1：95℃30s；
[0074]
step 2：pcr反应(40 cycles)
[0075]
95℃5s，
[0076]
60℃30s；
[0077]
step 3：溶解曲线。
[0078]
实验结果如图3中的a和b所示，ogn基因在胰腺癌组织细胞的表达水平显著高于胰腺正常组织细胞(p《0.01)。
[0079]
为进一步检测ogn在胰腺癌患者不同病理分期的表达差异，使用患者胰腺癌旁组织作为对照组，与胰腺癌组织组进行对比，经免疫组化实验检测ogn基因在胰腺癌患者不同病理分期的表达水平；具体检测方法如下：
[0080]
取胰腺癌组织和癌旁组织样品，进行透蜡与包埋，将包埋样品进行切片。转移到涂
有多聚赖氨酸载玻片上。将组织切片进行脱蜡与水化。用3％双氧水灭活内源性酶，放入edta溶液中进行抗原修复，加入pbs脱脂奶粉溶液封闭。加入ogn一抗稀释抗体，加入hrp标记二抗稀释抗体，各湿盒室温孵育。显色，镜检，苏木精复染与水化后，用不同浓度梯度的试剂中脱水，封片后观察。
[0081]
结果如图4所示，ogn基因表达在癌旁(paracancer)组无明显变化，而在胰腺癌(cancer)组随着病理分期的推移，ogn基因的表达明显不同，以ⅲ期癌组织中表达最高。
[0082]
为了检测ogn基因是否对胰腺癌细胞活性产生影响，使用空质粒转染的胰腺癌bxpc-3细胞作为对照组，与ogn基因过表达胰腺癌bxpc-3细胞组进行对比，首先通过real-time pcr法(具体步骤与上述real-time pcr法记载一致)检测ogn过表达成功，接着通过mtt和cck8法对细胞活性进行检测，edu法和tunel法对细胞增殖和细胞凋亡进行检测；具体步骤如下：
[0083]
细胞转染：
[0084]
待细胞密度达90％时，胰酶消化细胞，将重悬的细胞分别接种到六孔板和96孔板中。待细胞密度达80％-90％，更换无双抗培养基，各加入空质粒转染液和ogn转染液进行转染，培养5h后更换完全培养液，培养48h，进行edu、mtt、cck8或real-time pcr等后续实验。
[0085]
mtt试验
[0086]
control组和ogn组每组10孔已转染细胞，每孔加入10μl mtt溶液，孵育4h。每孔加入100μl formazan溶液，室温孵育4h，振摇，至紫色结晶溶解。使用酶标仪于570nm波长处测量吸光度。
[0087]
cck8法
[0088]
在96孔板中接种细胞悬液(100ml/孔)，将培养板放在培养箱预培养37℃，5％co2的条件下。向每孔加入10ml的cck-8溶液。将培养板在培养箱内孵育4h。用酶标仪测定在460nm处的吸光度。
[0089]
edu法
[0090]
接种于孔板的两孔细胞加入edu工作液，37℃孵育2h。用4％多聚甲醛进行固定。用3％bsa的pbs清洗，加入0.3％trotpm x-100的pbs，室温孵育12min使细胞通透。加click反应液，室温避光孵育。加1
×
hoechst33342，室温避光孵育，使细胞核染色。于细胞荧光检测仪中进行荧光检测。
[0091]
tunel法
[0092]
用4％多聚甲醛固定细胞，孵育后用穿透液穿透，tunel试剂覆盖样品，避光37℃保存60min。加入pbs与hoechst33342试剂，室温避光保存，使细胞核转染。用荧光显微镜进行观察。
[0093]
实验结果
[0094]
ogn基因过表达对胰腺癌细胞活性的影响
[0095]
结果显示，通过real-time pcr法检测ogn基因过表达成功(图5中的a)，ogn基因过表达可明显增强胰腺癌细胞活性(图5中的b～c)。
[0096]
ogn过表达对胰腺癌bxpc-3细胞增殖的影响
[0097]
进一步的，进行了edu荧光染色，通过统计两组细胞edu阳性细胞数占比发现，ogn基因过表达细胞组edu阳性细胞数占比明显高于control组(***p《0.001)(如图6所示)。
[0098]
为检测ogn基因过表达增强胰腺癌细胞增殖是否通过上调细胞增殖相关基因的表达来实现，采用real-time pcr法检测细胞周期基因cyclin a2、cyclinb1、cyclin d1和细胞增殖基因pcna的表达情况。实验结果显示，cyclina2、cyclin b1、cyclin d1、pcna等增殖相关基因在两组细胞中的表达具有明显差异，表现在上述基因在ogn过表达细胞组的表达均明显高于空质粒转染的control组(如图7所示)。
[0099]
ogn过表达对胰腺癌bxpc-3细胞凋亡的影响
[0100]
为了检测ogn过表达对细胞凋亡的影响，通过tunel来检测细胞凋亡。tunel染色结果表明(图8)，ogn过表达可抑制胰腺癌bxpc-3细胞的凋亡(**p《0.01)。
[0101]
为检测ogn过表达抑制胰腺癌细胞凋亡是通过调节细胞凋亡相关基因的表达实现的。采用real-time pcr法检测ogn过表达胰腺癌细胞凋亡相关基因的表达。结果如图9所示，p21、p53及bax/bcl-2在实验组的表达明显低于对照组，bcl-2、bax的表达高于对照组。ogn基因在胰腺癌细胞中的表达水平高于正常细胞，且ogn的过表达对胰腺癌细胞有促进增殖和抑制凋亡的作用。
[0102]
为了检测ogn基因的过表达是否影响胰腺癌细胞的迁移能力，进行了细胞迁移实验；具体步骤如下：
[0103]
取处于对数生长期的细胞，用胰蛋白酶消化成单细胞悬浮液，接种于12孔培养板，每孔最终的培养基总量为1ml。细胞长好后，用marker笔在12孔板背后画横线，去除划下的细胞，后更换新鲜无血清或低血清(《2％)的培养基，将细胞放入培养箱中培养。在24，48h后取出细胞，在镜下观察拍照，使用image j软件统计。结果如图10所示，ogn过表达组迁移速率明显高于对照组(图10)。
[0104]
为了检测ogn基因过表达是否会增强胰腺癌细胞的侵袭能力。进行了细胞侵袭实验；具体步骤如下：
[0105]
将基底膜与基质胶水化，用于进行后续铺细胞工作。铺基质胶，将配好的基质胶加入transwell小室中，放于37
°
的条件下孵育。制备细胞悬浮液后，接种细胞，细胞培养完成之后，进行固定与染色，于镜下观察并计数。
[0106]
结果如图11所示，ogn基因过表达组细胞迁移数要明显多于空转染组(图11)。
[0107]
实施例3
[0108]
由以上实施例可知ogn基因在胰腺癌中是一种促癌基因，ogn是否可通过调控id4的表达促进胰腺癌的发生发展至今未见报道，为进一步检测二者之间关系，首先运用gepia数据库中的multiple gene analysis预测了两者在胰腺癌中的表达相关性。结果如图12所示，两者在胰腺癌中的表达呈明显的正相关(图12)。
[0109]
为了检测id4在胰腺癌中的表达是否升高，分别进行real-time pcr与western blot实验检测胰腺正常导管上皮hpde6-c7细胞与胰腺癌bxpc-3细胞id4的表达；具体方法参见实施例2的记载；id4的引物如下：cgatgaaggcggtgagcc(seq id no.5)；ccaggctgtggatcttcgt(seq id no.6)。
[0110]
实验结果如图13所示，id4在胰腺癌bxpc-3细胞中的表达明显高于胰腺导管上皮hpde6-c7细胞(图13中的a和b)。
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进一步的，进行了real-time pcr和western blot实验检测ogn过表达胰腺癌bxpc-3细胞id4的表达水平。实验结果如图14所示，id4在ogn过表达胰腺癌bxpc-3细胞中表
达水平明显升高(图14中的a和b)。
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由有上述实施例可知，胰腺癌细胞中ogn基因的表达明显高于胰腺正常组织细胞；mtt和cck8法检测发现在胰腺癌bxpc-3细胞中过表达ogn基因可显著增强细胞活性；edu、tunel荧光检测表明，ogn基因过表达可促进细胞增殖，抑制细胞凋亡；real-time pcr实验发现，ogn过表达促进细胞增殖、抑制细胞凋亡是通过调控细胞增殖和凋亡相关基因的表达来实现的；细胞迁移和侵袭实验发现，ogn基因过表达可明显增强细胞迁移及侵袭能力；为了进一步探究ogn基因在胰腺癌发生发展中的调控机制，确定了相关调控分子id4，real-time pcr和westernblot实验发现，id4在胰腺癌细胞及ogn过表达胰腺癌细胞中表达均升高。通过上述实施例，发现ogn基因在胰腺癌中是一种促癌基因，id4是其下游调控分子之一；ogn基因与id4在胰腺癌的发生发展中可能发挥重要作用。在今后的临床胰腺癌诊疗中ogn能够成为有效的血清标志物。同时，调节ogn基因或id4的表达水平可能成为治疗胰腺癌的有效方法。
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以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。