一种快速检测草莓滑刃线虫的LAMP引物组及检测方法与流程

一种快速检测草莓滑刃线虫的lamp引物组及检测方法
技术领域
1.本发明属于植物病害的分子生物学检测领域，具体涉及一种快速检测草莓滑刃线虫的lamp引物组及检测方法。


背景技术：

2.草莓滑刃线虫(aphelenchoides fragariae)隶属于线虫门，侧尾腺纲，滑刃目，滑刃亚目，滑刃科，滑刃亚科，滑刃属。是一种叶和芽寄生线虫，可侵染多种农作物和观赏植物，是我国检疫性有害生物。
3.草莓滑刃线虫可危害重要的经济作物草莓，不直接侵入到植物的组织内，外寄生取食草莓的生长点，造成叶片皱缩、扭曲，常叶片小；线虫的取食活动可引起草莓果芽减少，导致草莓的产量减低，引起草莓春矮病。据德国开展的试验报道，该线虫危害草莓可造成产量损失高达45％。在俄罗斯莫斯科地区，草莓滑刃线虫与细菌复合侵染时，可影响草莓产量损失达28.6-38％。
4.草莓滑刃线虫隶属于滑刃属，该属有100余种。但草莓滑刃线虫及其近似种的形态特征极其相似，传统的形态学鉴定方法很难区分。如a.besseyi、a.pswudolesistus、a.oryzae、a.olesistus等都曾在一段时间内被认为是草莓滑刃线虫的同物异名。
5.目前，草莓滑刃线虫的鉴定以传统的形态学鉴定为主，必要时辅以分子生物学方法开展。但常规的特异引物pcr方法对设备要求高：需pcr仪、凝胶电泳仪等设备。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，lamp)技术是近年来发展的一种新颖和较成熟的等温核酸扩增技术。与pcr方法相比，lamp不需要pcr仪，扩增产物通过肉眼观察或浊度仪即可判定结果，适合于现场或条件较差的实验室进行快速检测。
6.因此，建立一种草莓滑刃线虫的lamp检测方法，以期能够快速、准确、灵敏、无污染的检测该线虫，是十分迫切和必要的。


技术实现要素：

7.针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种快速检测草莓滑刃线虫的lamp引物组；本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种草莓滑刃线虫的lamp检测方法。
8.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
9.一种快速检测草莓滑刃线虫的lamp引物组，包括一对外引物f3/b3，一对内引物fip/bip和一条环引物lf，引物的核苷酸序列分别如seq id no.1-seq id no.5所示。
10.具体如下：
11.af-f3：acaccttgtttgagatcttct；
12.af-b3：cgccacatcgggtcatt；
13.af-fip：aacccaaaatagccgtttcaagtaacagactagcaagtgc
14.tatgc；
15.af-bip：gagtagttgtctagttcgtgactactagaatcaagccaa
16.tagagcga；
17.af-lf：tttttcaagtattgtgtattgagaag。
18.外引物af-f3/af-b3、内引物af-fip/af-bip能够针对草莓滑刃线虫的基因上的6个区域进行识别扩增，分别位于3
′
端的f3c区段，f2c区段，f1c区段和5
′
端的b1区段，b2区段，b3区段。通过增加一条环引物af-lf促进lamp反应，提升反应速率，缩短反应时间。
19.所述的lamp引物组能够快速检测植物组织样品中是否含有草莓滑刃线虫。
20.同时，所述的lamp引物组能够快速检测混合线虫样品中是否含有草莓滑刃线虫。
21.其他植物线虫包括菊花滑刃线虫、次薄滑刃线虫、松材线虫、拟松材线虫、湖南剑线虫、雪松毛刺线虫、奇氏拟鞘线虫、卢斯短体线虫、长岭发垫刃线虫、旱稻孢囊线虫、花生根结线虫、腐烂茎线虫、鳞球茎茎线虫、柑橘半穿刺线虫、肾状肾形线虫、深圳针线虫。
22.一种快速检测草莓滑刃线虫的试剂盒，试剂盒中包括所述的lamp引物组，也在本发明的保护范围内。
23.一种草莓滑刃线虫的lamp检测方法，包括以下步骤：
24.1)以待测样品的dna为模板利用所述的lamp引物组进行lamp扩增；
25.其中，lamp扩增的反应体系为：2μl待测样品的dna模板、lamp引物组中每条引物各1μl、反应酶1μl、rm 12.5μl，用去离子水补足体系，总反应体系体积为25μl；
26.lamp扩增的反应条件为：62℃恒温反应60min；80℃灭活5min结束反应。
27.2)根据扩增结果判断待测样品中是否含有草莓滑刃线虫；
28.分别以实时浊度仪和目视浊度法观察检测反应管内的浊度情况判断是否产生特异性扩增。
29.若发生特异性的扩增，则表明待测样品中含有草莓滑刃线虫；若未发生特异性的扩增，则表明待测样品中不含有草莓滑刃线虫。
30.相比于现有技术，本发明的有益效果为：
31.1)快速、便捷。本发明只需要60min即可完成lamp反应，而且对仪器设备要求低，不需要pcr仪、凝胶成像系统等昂贵仪器，使用水浴锅即可完成检测；
32.2)特异性强。本发明只能够特异地扩增草莓滑刃线虫，供试其它植物线虫均未发生扩增，具有物种特异性；
33.3)灵敏度较高。检测灵敏度为1/500条线虫；
34.4)步骤简单。所有试剂在反应前添加，实现一步核酸扩增；
35.5)结果判定简便。其产物的检测方法比较多，用肉眼观察浊度就能够判断扩增与否，实现了结果可视化，还可采用实时浊度仪等方法判定；
36.6)对人和环境安全，检测过程不需要使用eb等有毒试剂。
附图说明
37.图1为lamp特异性检测la-320c柱状图；图中，block a中1-8号样本分别为草莓滑刃线虫(寄主植物材料：芍药；来源：荷兰)；草莓滑刃线虫(寄主植物材料：芍药；来源：荷兰)；草莓滑刃线虫(寄主植物材料：芍药；来源：荷兰)；草莓滑刃线虫(寄主植物材料：铃兰；来源：荷兰)；草莓滑刃线虫(寄主植物材料：酢浆草；来源：荷兰)；菊花滑刃线虫(寄主植物
材料：独尾草；来源：荷兰)；菊花滑刃线虫(寄主植物材料：蒲公英；来源：意大利)；菊花滑刃线虫(寄主植物材料：苜蓿草；来源：美国)；block b中1-8号样本分别为菊花滑刃线虫(寄主植物材料：大花葱；来源：荷兰)；菊花滑刃线虫(寄主植物材料：落新妇；来源：荷兰)；次薄滑刃线虫(寄主植物材料：大花葱；来源：荷兰)；滑刃属线虫(寄主植物材料：石莲；来源：韩国)；滑刃属线虫(寄主植物材料：落新妇；来源：荷兰)；滑刃属线虫(寄主植物材料：百合；来源：荷兰)；滑刃属线虫(寄主植物材料：木包装；来源：捷克)；滑刃属线虫(寄主植物材料：铁杉原木；来源：美国)；block c中1-8号样本分别为真滑刃属线虫(寄主植物材料：百合；来源：荷兰)；松材线虫(寄主植物材料：木包装；来源：不详)；拟松材线虫(寄主植物材料：木包装；来源：不详)；湖南剑线虫(寄主植物材料：茶梅；来源：日本)；雪松毛刺线虫(寄主植物材料：茶梅；来源：日本)；奇氏拟鞘线虫(寄主植物材料：茶梅；来源：日本)；卢斯短体线虫(寄主植物材料：茶梅；来源：日本)；长岭发垫刃线虫(寄主植物材料：玉米；来源：中国)；block d中1-8号样本分别为旱稻孢囊线虫(寄主植物材料：玉米；来源：中国)；花生根结线虫(寄主植物材料：种苗；来源：越南)；腐烂茎线虫(寄主植物材料：大蒜；来源：韩国)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：洋葱；来源：伊朗)；柑橘半穿刺线虫(寄主植物材料：树苗；来源：意大利)；肾状肾形线虫(寄主植物材料：种苗；来源：越南)；深圳针线虫(寄主植物材料：蝴蝶兰；来源：中国)；去离子水；
38.图2为lamp特异性检测la-320c速率曲线图；图中，blocka中ch1-ch8号样本分别为草莓滑刃线虫(寄主植物材料：芍药；来源：荷兰)；草莓滑刃线虫(寄主植物材料：芍药；来源：荷兰)；草莓滑刃线虫(寄主植物材料：芍药；来源：荷兰)；草莓滑刃线虫(寄主植物材料：铃兰；来源：荷兰)；草莓滑刃线虫(寄主植物材料：酢浆草；来源：荷兰)；菊花滑刃线虫(寄主植物材料：独尾草；来源：荷兰)；菊花滑刃线虫(寄主植物材料：蒲公英；来源：意大利)；菊花滑刃线虫(寄主植物材料：苜蓿草；来源：美国)；block b中ch1-ch8号样本分别为菊花滑刃线虫(寄主植物材料：大花葱；来源：荷兰)；菊花滑刃线虫(寄主植物材料：落新妇；来源：荷兰)；次薄滑刃线虫(寄主植物材料：大花葱；来源：荷兰)；滑刃属线虫(寄主植物材料：石莲；来源：韩国)；滑刃属线虫(寄主植物材料：落新妇；来源：荷兰)；滑刃属线虫(寄主植物材料：百合；来源：荷兰)；滑刃属线虫(寄主植物材料：木包装；来源：捷克)；滑刃属线虫(寄主植物材料：铁杉原木；来源：美国)；block c中ch1-ch8号样本分别为真滑刃属线虫(寄主植物材料：百合；来源：荷兰)；松材线虫(寄主植物材料：木包装；来源：不详)；拟松材线虫(寄主植物材料：木包装；来源：不详)；湖南剑线虫(寄主植物材料：茶梅；来源：日本)；雪松毛刺线虫(寄主植物材料：茶梅；来源：日本)；奇氏拟鞘线虫(寄主植物材料：茶梅；来源：日本)；卢斯短体线虫(寄主植物材料：茶梅；来源：日本)；长岭发垫刃线虫(寄主植物材料：玉米；来源：中国)；block d中ch1-ch8号样本分别为旱稻孢囊线虫(寄主植物材料：玉米；来源：中国)；花生根结线虫(寄主植物材料：种苗；来源：越南)；腐烂茎线虫(寄主植物材料：大蒜；来源：韩国)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：洋葱；来源：伊朗)；柑橘半穿刺线虫(寄主植物材料：树苗；来源：意大利)；肾状肾形线虫(寄主植物材料：种苗；来源：越南)；深圳针线虫(寄主植物材料：蝴蝶兰；来源：中国)；去离子水；
39.图3为lamp特异性检测la-320c扩增曲线图；图中，blocka中ch1-ch8号样本分别为草莓滑刃线虫(寄主植物材料：芍药；来源：荷兰)；草莓滑刃线虫(寄主植物材料：芍药；来源：荷兰)；草莓滑刃线虫(寄主植物材料：芍药；来源：荷兰)；草莓滑刃线虫(寄主植物材料：
铃兰；来源：荷兰)；草莓滑刃线虫(寄主植物材料：酢浆草；来源：荷兰)；菊花滑刃线虫(寄主植物材料：独尾草；来源：荷兰)；菊花滑刃线虫(寄主植物材料：蒲公英；来源：意大利)；菊花滑刃线虫(寄主植物材料：苜蓿草；来源：美国)；block b中ch1-ch8号样本分别为菊花滑刃线虫(寄主植物材料：大花葱；来源：荷兰)；菊花滑刃线虫(寄主植物材料：落新妇；来源：荷兰)；次薄滑刃线虫(寄主植物材料：大花葱；来源：荷兰)；滑刃属线虫(寄主植物材料：石莲；来源：韩国)；滑刃属线虫(寄主植物材料：落新妇；来源：荷兰)；滑刃属线虫(寄主植物材料：百合；来源：荷兰)；滑刃属线虫(寄主植物材料：木包装；来源：捷克)；滑刃属线虫(寄主植物材料：铁杉原木；来源：美国)；block c中ch1-ch8号样本分别为真滑刃属线虫(寄主植物材料：百合；来源：荷兰)；松材线虫(寄主植物材料：木包装；来源：不详)；拟松材线虫(寄主植物材料：木包装；来源：不详)；湖南剑线虫(寄主植物材料：茶梅；来源：日本)；雪松毛刺线虫(寄主植物材料：茶梅；来源：日本)；奇氏拟鞘线虫(寄主植物材料：茶梅；来源：日本)；卢斯短体线虫(寄主植物材料：茶梅；来源：日本)；长岭发垫刃线虫(寄主植物材料：玉米；来源：中国)；block d中ch1-ch8号样本分别为旱稻孢囊线虫(寄主植物材料：玉米；来源：中国)；花生根结线虫(寄主植物材料：种苗；来源：越南)；腐烂茎线虫(寄主植物材料：大蒜；来源：韩国)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：洋葱；来源：伊朗)；柑橘半穿刺线虫(寄主植物材料：树苗；来源：意大利)；肾状肾形线虫(寄主植物材料：种苗；来源：越南)；深圳针线虫(寄主植物材料：蝴蝶兰；来源：中国)；去离子水；
40.图4为目视浊度法呈现lamp特异性检测的结果；图中，1-32管的样本分别为：草莓滑刃线虫(寄主植物材料：芍药；来源：荷兰)；草莓滑刃线虫(寄主植物材料：芍药；来源：荷兰)；草莓滑刃线虫(寄主植物材料：芍药；来源：荷兰)；草莓滑刃线虫(寄主植物材料：铃兰；来源：荷兰)；草莓滑刃线虫(寄主植物材料：酢浆草；来源：荷兰)；菊花滑刃线虫(寄主植物材料：独尾草；来源：荷兰)；菊花滑刃线虫(寄主植物材料：蒲公英；来源：意大利)；菊花滑刃线虫(寄主植物材料：苜蓿草；来源：美国)；菊花滑刃线虫(寄主植物材料：大花葱；来源：荷兰)；菊花滑刃线虫(寄主植物材料：落新妇；来源：荷兰)；次薄滑刃线虫(寄主植物材料：大花葱；来源：荷兰)；滑刃属线虫(寄主植物材料：石莲；来源：韩国)；滑刃属线虫(寄主植物材料：落新妇；来源：荷兰)；滑刃属线虫(寄主植物材料：百合；来源：荷兰)；滑刃属线虫(寄主植物材料：木包装；来源：捷克)；滑刃属线虫(寄主植物材料：铁杉原木；来源：美国)；真滑刃属线虫(寄主植物材料：百合；来源：荷兰)；松材线虫(寄主植物材料：木包装；来源：不详)；拟松材线虫(寄主植物材料：木包装；来源：不详)；湖南剑线虫(寄主植物材料：茶梅；来源：日本)；雪松毛刺线虫(寄主植物材料：茶梅；来源：日本)；奇氏拟鞘线虫(寄主植物材料：茶梅；来源：日本)；卢斯短体线虫(寄主植物材料：茶梅；来源：日本)；长岭发垫刃线虫(寄主植物材料：玉米；来源：中国)；旱稻孢囊线虫(寄主植物材料：玉米；来源：中国)；花生根结线虫(寄主植物材料：种苗；来源：越南)；腐烂茎线虫(寄主植物材料：大蒜；来源：韩国)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：洋葱；来源：伊朗)；柑橘半穿刺线虫(寄主植物材料：树苗；来源：意大利)；肾状肾形线虫(寄主植物材料：种苗；来源：越南)；深圳针线虫(寄主植物材料：蝴蝶兰；来源：中国)；去离子水；
41.图5为lamp灵敏度检测la-320c柱状图；图中，1-7号样本分别为草莓滑刃线虫dna系列稀释的模板1倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍及去离子水；
42.图6为lamp灵敏度检测la-320c速率曲线图；图中，ch1-ch7样本分别为草莓滑刃线
虫dna系列稀释的模板1倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍及去离子水；
43.图7为lamp灵敏度检测la-320c扩增曲线图；图中，ch1-ch7样本分别为草莓滑刃线虫dna系列稀释的模板1倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍及去离子水；
44.图8为目视浊度法呈现lamp灵敏度检测的结果；图中，1-7管的样本分别为草莓滑刃线虫dna系列稀释的模板1倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍及去离子水。
具体实施方式
45.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
46.以下实施例所使用的供试线虫dna均保存在上海海关动植物与食品检验检疫技术中心实验室。线虫dna及其寄主植物材料和来源见表1。
47.表1供试线虫dna及其寄主植物材料和来源
48.[0049][0050]
以下实施例所使用的主要试剂与仪器为：
[0051]
试剂：loopamp dna扩增试剂盒购自荣研生物科技(中国)有限公司，引物由上海生工生物技术有限公司合成。
[0052]
仪器：lamp实时浊度仪la-320c；旋涡混合器；微量移液器；冰箱；离心机。
[0053]
实施例1
[0054]
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均可参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的方法或本领域的常规方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0055]
1、线虫dna提取
[0056]
线虫dna提取使用dneasy blood&tissue kit(qiagen)试剂盒，提取方法按照试剂盒使用说明书进行。
[0057]
2、lamp引物设计
[0058]
lamp引物设计比常规pcr方法要复杂，一般反应至少包括4条特异性引物：外引物(f3、b3)和内引物(fip、bip)，分别针对基因上的6个区域进行设计，分别位于3
′
端的f3c区段，f2c区段，f1c区段和5
′
端的b1区段，b2区段，b3区段。有时还可通过增加设计两条环引物(f-loop primer、b-loopprimer)促进lamp反应，可使反应速度提升1/2～1/3。
[0059]
根据ncbi公布的草莓滑刃线虫及其近似种序列进行了大量的研究、分析：包括线虫属内比较、属间比较，以及其它大量其它物种进行比较。在此基础上，设计了适用于鉴定
草莓滑刃线虫的lamp特异性检测引物，包括一对外引物f3/b3，一对内引物fip/bip和一条环引物lf。引物序列如下(下列所有引物序列方向均是5
′
端到3
′
端)：
[0060]
af-f3：acaccttgtttgagatcttct；(如seq id no.1所示)；
[0061]
af-b3：cgccacatcgggtcatt；(如seq id no.2所示)；
[0062]
af-fip：aacccaaaatagccgtttcaagtaacagactagcaagtgc
[0063]
tatgc；(如seq id no.3所示)；
[0064]
af-bip：gagtagttgtctagttcgtgactactagaatcaagccaa
[0065]
tagagcga；(如seq id no.4所示)；
[0066]
af-lf：tttttcaagtattgtgtattgagaag；(如seq id no.5所示)。
[0067]
3、lamp扩增和检测
[0068]
25μl反应体系如下：2μldna模板、每条引物各1μl、反应酶1μl、rm12.5μl。用去离子水补足体系。
[0069]
反应条件：62℃恒温反应60min，80℃灭活5min结束反应。
[0070]
分别以实时浊度仪和目视浊度法(即直接目视观察反应管内是否产生白色浑浊)观察检测结果。
[0071]
4、lamp特异性检测
[0072]
将供试23种植物寄生线虫，包括滑刃属线虫8种、真滑刃属线虫1种、其他植物线虫14种(见表1中编号18-31)的dna作为lamp反应的模板，进行lamp扩增。
[0073]
使用lamp实时浊度仪实时监测lamp反应，62℃运行60min，验证lamp反应的特异性。
[0074]
分别以实时浊度仪和目视浊度法(即直接目视观察反应管内是否产生白色浑浊)观察检测结果。
[0075]
图1-3为实时浊度仪la-320c呈现lamp特异性检测的结果。可见，所有样本中，仅草莓滑刃线虫样本呈阳性扩增，其它植物线虫样本均未发生扩增。
[0076]
图4为目视浊度法呈现lamp特异性检测的结果。可见，第1-5反应管内产生白色浑浊(阳性)，其它反应管内均未产生白色浑浊(阴性)，也即，所有样本中，仅草莓滑刃线虫样本呈阳性扩增，其它植物线虫样本均未发生扩增。
[0077]
上述结果显示，只有草莓滑刃线虫样本呈阳性扩增，其它植物线虫样本均未发生扩增。因此，本发明的lamp引物及方法具有良好的物种特异性。
[0078]
5、lamp灵敏度检测
[0079]
供试草莓滑刃线虫dna进行系列稀释，依次为1倍，5倍，10倍，20倍，50倍，100倍，进行灵敏度试验。
[0080]
分别以实时浊度仪和目视浊度法观察检测结果。
[0081]
供试草莓滑刃线虫dna提取时得到的体积为200μl，用于提取dna的线虫数量为10条。
[0082]
图5-7为实时浊度仪la-320c呈现lamp灵敏度检测的结果。可见，线虫dna在至50倍稀释度时，依然呈阳性扩增，自100倍稀释度开始未发生扩增。
[0083]
图8为目视浊度法呈现lamp灵敏度检测的结果。可见，第1-5反应管内产生白色浑浊(阳性)，其它反应管内未产生白色浑浊(阴性)，也即，线虫dna在至50倍稀释度时，依然呈
阳性扩增，自100倍稀释度开始未发生扩增。
[0084]
经计算，建立的草莓滑刃线虫lamp检测方法检测灵敏度为1/500条线虫。
[0085]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不局限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。