一种VZV病毒数字PCR检测试剂盒及其使用方法与流程

一种vzv病毒数字pcr检测试剂盒及其使用方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种vzv病毒数字pcr检测试剂盒及其使用方法。


背景技术：

2.水痘-带状疱疹病毒(vzv)属于疱疹病毒α亚科，人类疱疹病毒3型，为双链dna病毒，基因组由125000bp的碱基组成，是较小的疱疹病毒之一，其编码的蛋白质至少有71种。vzv为圆形颗粒，直径为150～200nm，中央为双链dna核心，表面由162个壳微粒组成的对称20面体。人是vzv的唯一自然宿主，并且普遍对其易感。初次感染表现为水痘，病毒能够在宿主的脊髓感觉神经节潜伏，结果再次激活后表现为带状疱疹。vzv感染还可引起多种并发症，这些并发症症状较重，甚至可引起严重的后遗症。此外妊娠期感染vzv还可能引起胎儿畸形、早产或死胎。vzv的早期诊断对于vzv相关并发症的预防，儿童的身体健康和我国的人口健康有着重要意义。
3.目前vzv诊断以血清学手段为主，由于方法学的限制存在灵敏度和准确性不足的问题，需要一种高灵敏度和特异性的检测手段。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明提出了可用于检测血清或血浆中的vzv病毒核酸，具有较高的灵敏度和特异性的一种vzv病毒数字pcr检测试剂盒及其使用方法。
5.本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种vzv病毒数字pcr检测试剂盒，包括根据vzv gb基因序列设计的引物和探针，所述引物包括seq id no:1所示的正向引物；seq id no:2所示的反向引物；所述探针为seq id no:3所示探针；所述探针的3'端第1个碱基被锁核酸修饰，并标记po4基团。
6.在以上技术方案的基础上，优选的，所示探针的5'端标记fam荧光基团，3'端标记bhq2猝灭基团。
7.在以上技术方案的基础上，优选的，引入了一个人工构建的内标系统用于避免检测结果假阴性，所述内标系统包括内标引物和内标探针。
8.在以上技术方案的基础上，优选的，所述内标系统基于人管家基因锚定蛋白重复区域53设计，所述内标系统的引物和探针包括由seq id no:4所示的内标正向引物，由seq id no:5所示的内标反向引物和由seq id no:6所示的内标探针。
9.在以上技术方案的基础上，优选的，所述内标探针5'端标记vic荧光基团，3'端标记bhq1猝灭基团和po4基团。
10.在以上技术方案的基础上，优选的，所示内标探针的3'端第1个碱基被锁核酸修饰，并标记po4基团。
11.在以上技术方案的基础上，优选的，pcr反应体系包括2
×
qx200 bio-rad ddpcr supermix for probes 10μl、1.2μl 10μmol/l如seq id no:1-2所示的引物、0.6μl 10μ
mol/l如seq id no:3所示的探针、0.8μl 10μmol/l如seq id no:4-5所示的引物、0.4μl 10μmol/l如seq id no:6所示的探针。
12.本发明还提供了一种vzv病毒数字pcr检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
13.s1，提取样本dna；
14.s2，配置数字pcr反应液；
15.s3，制备微滴，pcr扩增，扩增步骤：95℃变性10min；94℃退火15s；58℃延伸60s，退火-延伸共40个循环；98℃ 10min，4℃ 5min，结束反应。
16.s4，使用微滴读取仪进行微滴读取和分析。
17.在以上技术方案的基础上，优选的，步骤s1所述样本为血清或血浆。
18.本发明的一种vzv病毒数字pcr检测试剂盒及其使用方法相对于现有技术具有以下有益效果：
19.(1)本发明探针为锁核酸探针，在数字pcr过程中能够对目的片段进行富集，进一步提高了检测灵敏度和特异性。
20.(2)本发明内标系统基于人管家基因锚定蛋白重复区域53设计，能在人体样本提取核酸中稳定扩增，可以实时反映样本质量和核酸提取效果，避免因样本保存条件问题或核酸提取质量较差导致的假阴性。
21.(3)本发明的试剂盒能够准确检测出血清或血浆样品中是否含有vzv病毒，检测限可达到25copies/μl，具有较高的灵敏度和特异性。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1为基于双荧光探针的vzv病毒定量检测结果vzv gb基因和内标基因阳性、阴性结果二维图(样本浓度2500copies/μl)；
24.图2为基于双荧光探针的vzv病毒定量检测结果vzv gb基因和内标基因阳性、阴性结果二维图(样本浓度25copies/μl)。
具体实施方式
25.下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
26.vzv病毒数字pcr检测试剂盒包括根据vzv gb基因序列设计的引物和探针和根据人锚定蛋白重复区域53设计引物和探针，具体引物和探针序列如下：
27.根据vzv gb基因序列设计引物和探针如下：
28.正向引物：5'-acacccgactcgaaataccag-3'，如seq id no:1所示；
29.反向引物：5'-gagcatagcaaattccaccgat-3'，如seq id no:2所示；
30.探针：5'-tcccgacgaagcgtgccagttgagt-3'，如seq id no:3所示；
31.pcr扩增产物：acacccgactcgaaataccagatcccgacgaagcgtgccagttgagttgcgtgccaatagaacaataacaaccacctcatcggtggaatttgctatgctc，如seq id no:7所示；
32.根据人锚定蛋白重复区域53设计引物和探针如下：
33.正向引物：5'-cggcccacaatgtggaatg-3'，如seq id no:4所示；
34.反向引物：5'-ctccaggaagctgctgaagt-3'，如seq id no:5所示；
35.探针：5'-cagccactcgcagggcatccg-3'，如seq id no:6所示；
36.pcr扩增产物：cggcccacaatgtggaatgttagcaacaaccccgccagaccccccaccacccagatcagccactcgcagggcatccgcctgggcgtgcatccagaccccactccggagcacgacttcagcagcttcctggag，如seq id no:8所示。
37.内标基于人管家基因锚定蛋白重复区域53设计，能在人体样本提取核酸中稳定扩增，可以实时反映样本质量和核酸提取效果，避免因样本保存条件问题或核酸提取质量较差导致的假阴性。
38.如seq id no:3所示的3'端第1个碱基被锁核酸修饰，并标记po4基团；且探针的5'端标记fam荧光基团，3'端标记bhq2猝灭基团。根据人锚定蛋白重复区域53设计的3'端第1个碱基被锁核酸修饰，并标记po4基团；且5'端标记vic基团，3'端标记bhq1基团。
39.锁核酸对dna和rna均具有很好的识别能力和强大的亲和力，且不易被酶解，将锁核酸作为探针与rna/dna链结合的复合体具有很高的热稳定性，但又对碱基错配敏感，一个碱基的错配可使rna/dna的熔解温度(tm值)较大幅度地下降，本发明锁核酸修饰的探针，在pcr过程中对目的片段进行富集，进一步提高检测灵敏度和特异性。本实施例中，荧光探针如表1所示：
40.表1荧光探针序列
41.编号探针序列seq id no:35'-fam-tcccgacgaagcgtgccagttgagt-bhq2-po
4-3'seq id no:65'-vic-cagccactcgcagggcatccg-bhq1-po
4-3'
42.备注：小写字母为锁核酸修饰的碱基。
43.锁核酸对dna和rna均具有很好的识别能力和强大的亲和力，且不易被酶解，因此本发明将锁核酸作为探针与rna/dna链结合的复合体具有很高的热稳定性。一个碱基的错配可使rna/dna的熔解温度(tm值)较大幅度地下降，通过加入锁核酸探针，在pcr过程中对目的片段进行富集，进一步提高检测灵敏度和特异性。
44.vzv病毒数字pcr检测试剂盒的pcr反应液包括2
×
qx200 bio-rad ddpcr supermix for probes、如seq id no:1-6所示的引物和探针，具体浓度和含量见表2。
45.表2 pcr反应液组分及浓度
46.组分浓度/μl2
×
qx200 bio-rad ddpcr supermix for probes10正向引物(10μmol/l)1.2反向引物(10μmol/l)1.2探针(10μmol/l)0.6内标正向引物(10μmol/l)0.8
内标反向引物(10μmol/l)0.8内标探针(10μmol/l)0.4
47.vzv病毒数字pcr检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
48.s1，用商业化提取试剂提取vzv假病毒液，并将提取产物稀释至2500copies/μl和25copies/μl进行数字pcr检测，每种检测10次，评价检测方法的重复性和准确性。
49.s2，单个反应体系如下：2
×
qx200 bio-rad ddpcr supermix for probes 10μl、vzv正向引物1.2μl、vzv反向引物1.2μl、vzv探针0.6μl、内标正向引物0.8μl，内标反向引物0.8μl、内标探针0.4μl，以上引物探针浓度为10μmol/l。
50.s3，加样：按每反应15μl反应液+5μl样本混合加样。
51.s4，制备微滴：将8个20μl反应体系加入到dg8 cartridge中间一排的8个孔内。在dg8 cartridge最底一排8个孔中各加入70μl微滴生成油，盖上胶垫，将dg8 cartridge轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴，将生成于cartridge最上面一排孔内的微滴转移到96孔板中。
52.s5，微滴转入96孔板内后，用预热好的px1热封仪按180℃，5s程序对其进行封膜。
53.s6，pcr扩增，扩增步骤：95℃变性10min；94℃退火15s，58℃延伸60s，退火-延伸共40个循环；98℃ 10min，4℃ 5min，结束反应。
54.s7，打开quanta soft软件，使用微滴读取仪进行微滴读取和分析。
55.s8，结果判定方法：
56.s81，阴性对照结果的判定：“ch1+”区的点＜3个。
57.s82，阳性对照结果的判定：落在“ch1+ch2
‑”
区的点≥3个。
58.s83，无效结果的判定：每个反应管的total微滴数应≥8000，若total微滴数＜8000，该反应孔的微滴生成则不理想，需重新进行微滴生成。
59.s84，拷贝数计算公式为：每微升模板的病毒拷贝数＝ch1
×
20/5，其中ch1为目的基因拷贝数。
60.当落在“ch1+ch2
‑”
区的点≥3个时：模板中含有vzv病毒，拷贝数使用上述公式计算，ch2为内标基因。
61.当落在“ch1+ch2
‑”
区的点＜3个时：模板中未检测出vzv病毒，或病毒含量低于检测下限，ch2为内标基因。
62.s9，结果见图1-2和表3。
63.表3判定结果
[0064][0065]
图1-2为基于双荧光探针的vzv病毒定量检测结果vzv gb基因和内标基因阳性、阴性结果二维图，图1的样本浓度2500copies/μl，图2的样本浓度为25copies/μl。x轴是vic荧光信号强度，y轴是fam荧光信号强度。靶标液滴明显分为4个象限，其中第一象限代表vzv gb，第二象限代表vzv gb+内标，第三象限代表无靶标，第四象限代表内标。
[0066]
表3可知，cv值小于20％，表明本发明试剂盒和检测方法重复性较好；检测限可达
到25copies/μl即6copies/反应，与理论结果的差异程度小于15％，表明本发明试剂盒准确性较高。
[0067]
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。