一种中生菌素F组分母药及其制备方法与流程

一种中生菌素f组分母药及其制备方法
技术领域
1.本发明属于农药领域，具体涉及一种中生菌素f组分母药及其制备方法。


背景技术：

2.中生菌素（zhongshengmycin）又名农抗751菌素、链丝菌素，属n-糖苷类抗生素。根据文献报道，浅灰色链霉菌海南变种（streptomyces lavendulae var heinanensis n.var）和秦岭链霉菌（streptomyces qinlingnensis sp. nov）等多个链霉菌均能产生中生菌素。中生菌素抗菌谱广，能抗革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、分枝杆菌、酵母菌及丝状真菌等，对昆虫也有一定的杀灭作用。其杀菌机理是能够抑制polyu引导的多肽合成，并能导致蛋白翻译中的错读，使细菌不能合成蛋白质而死亡。中生菌素在农业上偏重于水稻白叶枯、黄瓜细菌性角斑病、白菜软腐病、杆菌溃疡病等细菌性病害，也可用于苹果轮纹病、黄瓜霜霉病、灰霉病、白粉病和番茄晚疫病等真菌性病害的防治。中生菌素有多个有效组分，其中，中生菌素f组分是中生菌素中具有较高农药利用价值的组分之一。f组分结构如下（n=1）：由于具有显著且直接杀菌作用，因此产生中生菌素的链霉菌在自然界比较容易被发现并分离得到。本发明在长期的野外菌种采集分离中多次得到产生中生菌素的菌株。2003年从蒲城土壤中分离得到一株放线菌，公司菌株编号
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d190515，经形态、生理生化、细胞壁特征及分子生物学等特征判断为一株链霉菌。产物分离鉴定发现抑菌成分以中生菌素c、d、f组分为主，未发现报道的中生菌素a和x组分，且b、e组分含量低。随后陕西麦可罗生物科技有限公司菌种中心进行了长期持续不断的单一紫外诱变筛选，得到菌株zs
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d190515（2019年经中科院微生物所鉴定，结果同为链霉菌），随后开展了培养基和培养条件优化，液体发酵，产物分离鉴定，活性测试等方面的研究，其具体表征如如图1-3所示。在相关高校和科研单位的协助下，2015-2020年开始采用10m3发酵罐，深层液体发酵试验，产物试样以乙腈+水+庚烷磺酸钠+磷酸氢二钠+磷酸为流动相，使用rp-c18为填料的不锈钢柱和紫外检测器，在波长200nm对试样中各组分进行高效液相色谱分离，发现产物以中生菌素f为主，未发现a和x组分，同时bcde等它组分含量低。


技术实现要素：

3.为了解决现有技术中存在的上述技术问题， 本发明提供一种中生菌素f组分母药
及其制备方法。该方法可制造含有60.8-78.7wt%的中生菌素f组分的母药，产品含量远高于目前农业部登记的12%中生菌素母药，溶解于水，不溶物小于0.2%，填补了高纯度中生菌素母药的空白，为混配制剂和含量高于12%农药产品生产开发提供了原料药。
4.为了实现发明目的，本发明采用如下技术方案：一种中生菌素f组分母药的制备方法，包括以下步骤：（1）配制生产试管斜面培养基，并在斜面上接入链霉菌，进行培养；当斜面培养基中长出单菌落时用接种针挑出单菌落进入下一步培养；（2）配制菌种发酵的种子培养基，并接种步骤（1）的单菌落进行培养，得到种子培养液；（3）配制发酵罐培养基，接入上步骤（2）得到的种子培养液，其中，种子培养液与发酵培养液体积比为10%-15%；（4）将发酵液经过过滤、离子交换、洗脱、浓缩、脱色、降温、干燥步骤后得到中生菌素母药。
5.更为优选的，所述的制备方法包括以下步骤：（1）生产试管的斜面培养基采用玉米粉或者玉米淀粉作为碳源，用量3-7%；采用尿素作为氮源，用量1-3%；微量元素氯化钠，用量0.1-0.2%；微量元素氯化镁用量0.1-0.2%；磷源采用磷酸二氢钾，用量0.2-0.4%；琼脂用量20g/l；用2mol/l盐酸或2mol/l氢氧化钠调ph值为7.0-7.4；用自来水补足，配制时步骤如下：第一步，在40
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2℃的自来水中依次加入氯化钠、氯化镁、磷酸二氢钾、尿素，搅拌充分溶解后，再加入玉米淀粉，搅拌至均匀无团块；该步用自来水为总配制用水量的70%，配制过程在水浴中完成；第二步，用第一步同样温度的自来水定容；第三步，用第二步定容好的溶液放置室温，等温度降至20℃如果ph高于7.4，用2mol/l盐酸调整；如果低于7.0，用2mol/l氢氧化钠调整ph；然后加入琼脂，搅拌均匀；第四步，以上调整好的培养基灭菌后制作斜面，并在37℃培养72小时，无杂菌落便可使用；第五步，在斜面上接入链霉菌，培养140-150小时后，长出灰白色菌苔；（2）菌种发酵的种子培养基中采用玉米粉或者玉米淀粉作为碳源，用量2-3%；冷榨大豆饼粉作为氮源，用量2%-3；添加速效碳源葡萄糖0.5-2%；添加速效氮源尿素1%-2%；添加无机盐氯化钠、磷酸二氢钾和氯化镁，用量分别是氯化钠0.1-0.2%，磷酸二氢钾用量0.1-0.2%，氯化镁0.2-0.4%；同时添加豆油作为消泡剂用量为0.3%-0.5%；进行消毒，种子培养基体积与发酵培养基体积百分比为10-15%，培养时通气量为300l/min；搅拌速度为120-150rmp，培养温度28
±
2℃，ph值自然，培养周期24-28h；（3）菌种发酵罐的培养基采用玉米粉或者玉米淀粉作为碳源，用量2-3%；用冷榨大豆饼粉作为氮源，用量2%-3%；添加速效氮源尿素1%-2%；添加无机盐氯化钠、磷酸二氢钾和氯化镁，氯化钠的用量为0.1-0.2%，磷酸二氢钾的用量为0.1-0.2%，氯化镁的用量为0.2-0.4%；同时添加豆油作为消泡剂用量为0.1%-0.2%，进行消毒，种子培养基体积与发酵培养基体积百分比为10-15%，培养时通气量为300l/min，搅拌速度为120-150rmp，培养温度28
±
2℃，ph自然，发酵周期72-90h，ph为7.2开始放罐；
（4）放罐时，发酵液中中生菌素f含量为3-5g/l，发酵液生产中生菌素f母药的流程如下：第一步，将发酵液用草酸调节ph为3.5
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0.3，然后采用超滤过滤；第二步，滤液以2bv/h的速度通过树脂进行离子交换，再用洗脱液洗脱，收集后的洗脱液调整ph值至3.5；第三步，采用减压浓缩将洗脱液至浓度为40
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5g/l；第四步，在上一步浓缩液中加入活性炭，常温搅拌脱色30min过滤；第五步，滤液在60℃下再减压浓缩至浓度为90
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5g/l；第六步，将浓缩液以10℃/min的降温速度降至9℃，在9℃保持10h，期间搅拌转速维持50-100转/分，大量晶体析出；第七步，过滤并干燥，在压力-0.1mpa，温度60℃条件下干燥至水分≤5%，得到中生菌素母药，经检测得到的是含量在60-80%的中生菌素母药。
6.在本发明的优选的实施方式中，所述的链霉菌优选为陕西麦可罗生物科技有限公司生产的链霉菌（公司菌株标号zs
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d190515）为生产菌株，该菌株采用深层液体发酵技术生产，具有产物中f组分比例高的特点，特别适合制成中生菌素f组分母药。
7.在本发明的优选的实施方式中，步骤（1）的第四步中所述的灭菌是在121℃灭菌30分钟。
8.在本发明的优选的实施方式中，所述的消毒为在121℃消毒30min。
9.在本发明的优选的实施方式中，步骤（3）中，在发酵进行到24
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5h时，溶氧开始下降并趋于稳时，需要补充和上述配方相同，总量为上述配方1/4的发酵罐的培养基，以便迅速补充菌体繁殖的所需营养成分。
10.在本发明的优选的实施方式中，步骤（4）中，第二步中，所述的树脂为钠型树脂，优选为724树脂；所述的洗脱液为1mol/l浓度的盐酸，用2mol/l氢氧化钠调整ph值。
11.在本发明的优选的实施方式中，步骤（4）中，第三步所采用减压浓缩的参数为：压力-0.1mpa，浓缩温度50℃。
12.在本发明的优选的实施方式中，步骤（4）中，第四步所述的活性炭的加入量为浓缩液质量的2.0% 。
13.在本发明的优选的实施方式中，步骤（4）中，第七步采用吊袋离心机过滤，采用双锥干燥机进行干燥。
14.与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：1、利用该工艺可以减少能耗，降低中生菌素原药生产时费用；2、加入活性碳后显著减少中生菌素的色素，提高产品质量；3、利用该工艺提高中生菌素f组分纯度。
附图说明
15.下面结合附图做进一步的说明。
16.图1为zs
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d190515菌落形态。
17.图2为zs
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d190515发酵产物液相色谱图。
18.图3为zs
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d190515发酵产物液相色谱图。
19.图4为zs
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d190515的鉴定报告。
20.图5为中生菌素f母药产品液相色谱图。
具体实施方式
21.下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
22.实施例一按照以下方法制备中生菌素f组分母药：称取玉米淀粉30g，尿素10g，氯化钠 2g，氯化镁2g；磷酸二氢钾3g，琼脂200g。先量取700ml自来水，加热至40℃，放入40℃水浴锅中，依次加入称量好的氯化钠、氯化镁、磷酸二氢钾和尿素，搅拌均匀，颜色略现乳白，然后在搅拌下缓慢加入玉米粉，搅拌均匀。用40℃自来水定容至1000ml，然后用ph计测量ph6.7，用2mol/l氢氧化钠调 ph7.2；加入琼脂粉搅拌均匀。分装于普通直径3cm试管中，每支试管15ml。分装好的试管于121℃灭菌30min。从灭菌锅中取出后摆出斜面，冷却后放入37℃培养箱培养72h，观察无杂菌生长。在斜面上接入链霉菌。培养145小时后，长出灰白色菌苔。
23.同时称取9kg玉米淀粉，9kg冷榨大豆粉，6kg葡萄糖，6g尿素，300g氯化钠，300g磷酸二氢钾和300g氯化镁，600g氯化镁，900g豆油，100kg水，依次加入500l种子罐，水补至230l体积，121℃，30min。灭菌后体积300l，冷却至30℃，接种链霉菌，接种量为10-15%。调整通气量600l/min。搅拌线速度为326米/分钟。培养26h，显微镜观察菌丝成网状，生长良好。
24.称取240kg玉米淀粉；240kg冷榨豆饼粉；120kg尿素；8kg氯化钠，8kg磷酸二氢钾，16kg氯化镁，16kg豆油4000l水。在水中依次放入以上原料，在15000l发酵罐中定容至6500l，消毒时间采用常规121℃，30min，消毒后体积7760l，温度降低至30℃时接入链霉菌，接种量为10-15%，调整通气量600l/min。搅拌线速度为343-350米/分钟（波动）。培养温度28
±
2℃。ph自然。培养至22h，发现溶氧缓慢上升，24h上升变慢，趋于稳定，补入实现灭菌好，和发酵罐配方一致的料液2000l，体积10000l左右，发酵周期84h时，ph上升至7.2放罐。
25.放罐时体积9100l，液相色谱检测发酵液中中生菌素f含量为4.5g/l。加入92kg草酸，充分搅拌溶解后ph3.3，然后进入超滤机组过滤，至出液3700l时加入资料水继续过滤，依次稀释三次后，得到滤液17000l，滤液中生菌素f含量2.09g/l。滤液以6m3/h的速度通过2个串联的734离子交换柱，吸附完毕后，用自来水挤出所有滤液。然后用事先准备好的6m31mol/l盐酸洗脱，液相色谱监控浓度，共收取洗脱液6.2m3，中生菌素f含量5.16g/l。在压力-0.1mpa,浓缩温度60℃条件下浓缩至体积为800l，含量为39.7g/l,。然后在浓缩液中加入24kg活性碳，搅拌60min后过滤，得到滤液750l，活性碳上吸附的有效成分和用水冲后下次套用。在压力-0.1mpa，浓缩温度60℃条件下在浓缩至体积为325l，浓缩液中生菌素f含量92.3g/l。这时控制温度减低10℃/min的速度降至9℃，在搅拌转速60m/min轻微搅拌下，大量白色沉淀析出，采用吊袋离心过滤后，转移至双锥混合器中在压力-0.1mpa，浓缩温度60℃条件干燥6h得到中生菌素母药23.4kg，检测中生菌素f含量为60.8%，干燥减重3.7%，母液中中生菌素f含量为43.8g/l，套用至下次结晶中，或者用于加工中生菌素f水剂。
26.实施例二按照以下方法制备中生菌素f组分母药：
称取玉米淀粉70g，尿素30g，氯化钠 2g，氯化镁4g；磷酸二氢钾3g，琼脂200g。先量取700ml自来水，加热至40℃，放入40℃水浴锅中，依次加入称量好的氯化钠、氯化镁、磷酸二氢钾和尿素，搅拌均匀，颜色略现乳白，然后在搅拌下缓慢加入玉米粉，搅拌均匀。用40℃自来水定容至1000ml，然后用ph计测量ph6.5，用2mol/l ph7.2；加入琼脂粉搅拌均匀。分装于普通直径3cm试管中，每支试管15ml。分装好的试管于121℃灭菌30min。从灭菌锅中取出后摆出斜面，冷却后放入37℃培养箱培养72h，观察无杂菌生长。在斜面上接种链霉菌。培养140小时后，长出灰白色菌苔，丰满。
27.同时称取9kg玉米淀粉，9kg冷榨大豆粉，1.5kg葡萄糖，6g尿素，300g氯化钠，300g磷酸二氢钾和300g氯化镁，600g氯化镁，900g豆油，100kg水，依次加入500l种子罐，水补至232l体积，121℃，30min。灭菌后体积300l，冷却至30℃，接种链霉菌，接种量为10-15%，调整通气量600l/min。。搅拌线速度为317米/分钟。培养25h，显微镜观察菌丝成网状，生长良好。
28.称取240kg玉米淀粉；160kg冷榨豆饼粉；160kg尿素；8kg氯化钠，8kg磷酸二氢钾，16kg氯化镁，16kg豆油4000l水。在水中依次放入以上原料，在15000l发酵罐中定容至6500l，消毒时间采用常规121℃，30min，消毒后体积7760l，接种链霉菌，接种量为10-15%，调整通气量600l/min。搅拌线速度为345-350米/分钟（波动）。培养温度28
±
2℃。ph自然。培养至22h，发现溶氧缓慢上升，24h上升变慢，趋于稳定，补入实现灭菌好，和发酵罐配方一致的料液2000l，体积10000l左右，发酵周期84h时，ph上升至7.2放罐。
29.放罐时体积9090l，液相色谱检测发酵液中中生菌素f含量为4.8g/l。加入91.6kg草酸，充分搅拌溶解后ph3.3，然后进入超滤机组过滤，至出液3750l时加入资料水继续过滤，依次稀释三次后，得到滤液18200l，滤液中生菌素f含量2.19g/l。滤液以6m3/h的速度通过2个串联的734离子交换柱，吸附完毕后，用自来水挤出所有滤液。然后用事先准备好的6m31mol/l盐酸洗脱，液相色谱监控浓度，共收取洗脱液6.2m3，中生菌素f含量5.24g/l。在压力-0.1mpa，浓缩温度60℃条件下浓缩至体积为820l，含量为41.6g/l，然后在浓缩液中加入24.6kg活性碳，搅拌60min后过滤，得到滤液770l，活性碳上吸附的有效成分和用水冲后下次套用。在压力-0.1mpa，浓缩温度60℃条件下在浓缩至体积为325l,浓缩液中生菌素f含量94.3g/l。这时控制温度减低10℃/min的速度降至9℃，在搅拌转速60m/min轻微搅拌下，大量白色沉淀析出，采用吊袋离心过滤后，转移至双锥混合器中在压力-0.1mpa，浓缩温度60℃条件干燥6h得到中生菌素母药23.4kg,检测中生菌素f含量为61.9%，干燥减重4.8。母液中中生菌素f含量为44.3g/l，套用至下次结晶中，或者用于加工中生菌素f水剂。
30.实施例三按照以下方法制备中生菌素f组分母药：称取玉米淀粉70g，尿素30g，氯化钠 2g，氯化镁3g；磷酸二氢钾4g，琼脂200g。先量取700ml自来水，加热至40℃，放入40℃水浴锅中，依次加入称量好的氯化钠、氯化镁、磷酸二氢钾和尿素，搅拌均匀，颜色略现乳白，然后在搅拌下缓慢加入玉米粉，搅拌均匀。用40℃自来水定容至1000ml，然后用ph计测量ph6.6，用2mol/l ph7.2；加入琼脂粉搅拌均匀。分装于普通直径3cm试管中，每支试管15ml。分装好的试管于121℃灭菌30min。从灭菌锅中取出后摆出斜面，冷却后放入37℃培养箱培养72h，观察无杂菌生长。在斜面上接入链霉菌。培养141小时后，长出灰白色菌苔。
31.同时称取9kg玉米淀粉，9kg冷榨大豆粉，6kg葡萄糖，6g尿素，300g氯化钠，300g磷
酸二氢钾和450g氯化镁，600g氯化镁，900g豆油，100kg水，依次加入500l种子罐，水补至244l体积，121℃,30min。灭菌后体积300l，冷却至30℃，接种链霉菌，接种量为10-15%，调整通气量600l/min。搅拌线速度为313米/分钟。培养24.4h，显微镜观察菌丝成网状，生长良好。
32.称取240kg玉米淀粉；240kg冷榨豆饼粉；160kg尿素；8kg氯化钠，8kg磷酸二氢钾，16kg氯化镁，16kg豆油4000l水。在水中依次放入以上原料，在15000l发酵罐中定容至6500l，消毒时间采用常规121℃，30min，消毒后体积7760l，接种链霉菌，调整通气量600l/min。搅拌线速度为348-350米/分钟（波动）。培养温度28
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2℃。ph自然。培养至25h，发现溶氧缓慢上升，26h上升变慢，趋于稳定，补入实现灭菌好，和发酵罐配方一致的料液2000l，体积近10000l左右，发酵周期81h时，ph上升至7.2放罐。
33.放罐时体积9250l，液相色谱检测发酵液中中生菌素f含量为5.0g/l。加入95kg草酸，充分搅拌溶解后ph3.4,然后进入超滤机组过滤，至出液4050l时加入资料水继续过滤，依次稀释三次后，得到滤液18700l，滤液中生菌素f含量2.24g/l。滤液以6m3/h的速度通过2个串联的734离子交换柱，吸附完毕后，用自来水挤出所有滤液。然后用事先准备好的6m
3 1mol/l盐酸洗脱，液相色谱监控浓度，共收取洗脱液6.8m3，中生菌素f含量5.04g/l。在压力-0.1mpa，浓缩温度60℃条件下浓缩至体积为834l，含量为41.6g/l，然后在浓缩液中加入25.6kg活性碳，搅拌60min后过滤，得到滤液779l，活性碳上吸附的有效成分和用水冲后下次套用。在压力-0.1mpa，浓缩温度60℃条件下在浓缩至体积为329l，浓缩液中生菌素f含量94.3g/l。这时控制温度减低10℃/min的速度降至9℃，在搅拌转速60m/min轻微搅拌下，大量白色沉淀析出，采用吊袋离心过滤后，转移至双锥混合器中在压力-0.1mpa，浓缩温度60℃条件干燥6h得到中生菌素母药18.4kg，检测中生菌素f含量为78.7%，干燥减重2.9。母液中中生菌素f含量为41.7g/l，套用至下次结晶中，或者用于加工中生菌素f水剂。
34.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围。