一种腺相关病毒纯化试剂盒及纯化方法

1.本发明涉及生物医药领域，更特别地，涉及一种腺相关病毒纯化试剂盒及纯化方法。


背景技术：

2.在生物和医学研究和产业化中，转基因技术是重要的研究内容和使用手段，一直处在快速发展中，近年来迅速发展起来的载体病毒技术即是被广泛使用的转基因技术。各种载体病毒的应用已经形成了很大的市场，包括病毒的克隆、包装、制备、纯化等都有市售产品和服务。腺相关病毒(aav)是常用的载体病毒，已经广泛应用于疫苗、基因治疗以及科研等方面。由于生产和研究的需要，目前，对腺相关病毒的需求量也越来越高。
3.目前腺相关病毒的制备和纯化技术相对滞后，由于该病毒包装后仍留在包装细胞里，其纯化过程相对复杂。实验室纯化腺相关病毒的方法主要还是采用超速梯度离心技术，此法首先需要一台超速离心机，而且操作过程繁琐、费时费力。我们与旧金山加州大学jennifer whistler博士的实验室合作制备腺相关病毒产品，先后使用了cell biolabs公司(美国)和biominga公司(美国)的腺相关病毒纯化试剂盒，但因其回收率太低而失败。cell biolabs和biomiga的产品类似，均采用树脂吸附法。除此之外，virapur公司(美国)提供基于过滤膜吸附法的腺相关病毒纯化试剂盒，由于过滤膜吸附法对腺相关病毒吸附的特异性不高，吸附容量有限，纯化效果不是特别好，因此这种产品没有得到广泛使用。已有一些研究者开发了特异性抗体搭载在固体基质上，以提高对aav的吸附特异性。然而，特异性抗体的使用带来了新的问题，例如在洗脱时难以把aav颗粒洗下来，造成回收率低，在洗脱过程中还有可能造成抗体与aav颗粒一起洗脱，影响aav颗粒纯度。
4.因此，需要一种新的腺相关病毒纯化方法和纯化试剂产品。


技术实现要素：

5.为解决以上问题，本发明提供了一种腺相关病毒纯化试剂盒，包括裂解-平衡缓冲液、第一抗体、锚定微珠以及洗脱液；
6.所述第一抗体为纳米抗体，具有重链可变区和fc区，所述重链可变区序列如seq id no:1所示；
7.所述抗体偶联微珠为偶联了第二抗体的微珠，所述第二抗体是针对所述fc区的抗体。
8.本发明通过研发了针对aav的第一抗体，以及针对第一抗体的第二抗体，并将第二抗体与微珠偶联，从而使得能够快速锚定和洗脱aav。本发明的试剂盒通过离心或磁力的方法进行aav纯化，大大加快了生产和科学实验中的纯化速度，同时，本发明的试剂盒能够提供更高感染滴度的aav溶液。
9.在一个具体实施方案中，所述裂解-平衡缓冲液为ph 8-8.5的tirs缓冲液，含有浓度为0.05％-0.1％的吐温20以及浓度为0.2％-0.3％的np40。第一抗体与aav的特异性亲和
力在ph 8-8.5时很高，有利于将aav锚定在例如微珠等固体基质上。
10.在一个具体实施方案中，所述洗脱液为ph 4-5的柠檬酸缓冲液，含有500-100mm的氯化钠。4-5的ph以及50-100mm的氯化钠浓度下有利于从第一抗体洗脱aav，同时保持第一抗体仍然锚定在微珠上。
11.在一个具体实施方案中，所述fc区是小鼠fc区。
12.在一个具体实施方案中，所述第二抗体为纳米抗体，重链可变区序列如seq id no:5所示。
13.在一个具体实施方案中，所述抗体偶联微珠为琼脂糖微珠或磁珠。
14.本发明还公开了一种纯化腺相关病毒的方法，包括使用上述腺相关病毒纯化试剂盒纯化腺相关病毒的步骤。
15.在一个具体实施方案中，所述方法包括以下步骤：
16.s1：收集含有腺相关病毒的细胞，使用所述裂解平衡缓冲液破碎所述细胞，离心获得含有腺相关病毒的上清液；
17.s2：向所述上清液中加入所述第一抗体，混匀，得到第一抗体-上清液；
18.s3：向所述第一抗体-上清液中加入所述抗体偶联微珠，混匀；
19.s4：从所述第一抗体-上清液中分离所述抗体偶联微珠；
20.s5：用所述洗脱液从所述抗体偶联微珠洗脱得到腺相关病毒溶液。
21.优选地，所述抗体偶联微珠对于所述第一抗体的过量。抗体偶联微珠对第一抗体过量才能将所有与aav结合的第一抗体固定在微珠上，以防止aav的损失。
22.本发明筛选和制备了针对aav的高特异性和亲和力的抗体，并且该抗体具有特定的ph活性范围，使其容易用于对aav的分离。利用该aav抗体的特点制备的aav纯化试剂盒可通过离心分离(使用琼脂糖微珠)或磁力分离(使用磁珠)的方式快速纯化腺相关病毒，并提高了分离得到的aav的感染滴度。
附图说明
23.图1为elisa法检测纳米抗体at1-3对aav1-8的特异结合能力的统计图。
24.图2为纳米抗体at2对aav的结合能力随环境ph值的变化曲线。
25.图3为第二抗体对小鼠fc的结合能力随环境ph值的变化曲线。
26.图4为破碎上清、分离上清和纯化的aav溶液中的相对蛋白含量的统计图。
27.图5为本发明试剂盒与市售试剂盒纯化得到的aav溶液的基因拷贝数滴度的比较。
28.图6为本发明试剂盒与市售试剂盒纯化得到的aav溶液的感染滴度的比较。
具体实施方式
29.以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
30.1.针对aav的单克隆抗体的筛选
31.将aav1-13的vp1、vp2和vp3的氨基酸序列进行比对，提取保守序列，合成序列克隆到酵母菌中表达得到aav外壳蛋白免疫原，将免疫原用来免疫羊驼，取羊驼脾脏进行单克隆抗体筛选。最终，我们筛选到3株对血清型aav1-8都具有良好的特异性和亲和力的单克隆抗
体(图1)。我们在研究中意外地发现，使用at2株单克隆抗体对ph特别敏感，在合适的缓冲液中，当ph为7.5-9时，该单克隆抗体对aav外壳具有非常高的结合力，但是，当ph降低至6以下时该抗体对aav外壳几乎没有结合力(图2)。通过测序，获得at2的重链可变区(vhh)序列如seq id no:1所示，其中，cdr1-3序列分别如seq id no:2-4所示。我们将该vhh与小鼠fc片段融合表达，得到具有小鼠fc片段和上述at2 vhh的新抗体，即为第一抗体。检测第一抗体的结合特性，结果显示其与at2 vhh的特性一致，对aav1-8均具有非常高的特异结合能力，并且在该特异结合能力在ph 7.5-9的范围内很高，但是当ph降低至6及以下时，抗体对aav外壳几乎没有结合力。
32.使用小鼠fc片段作为免疫原免疫羊驼，制备针对小鼠fc的单克隆抗体，得到第二抗体af，vhh序列如seq id no:5所示，其中，cdr1-3序列分别如seq id no:6-8所示。检测af对第一抗体的亲和力，结果如图3所示，当ph为4-9时，第二抗体af对第一抗体均具有非常好的亲和力。
33.基于上述两种抗体的特性，我们开发了一种新的aav纯化试剂盒。
34.2.aav纯化试剂盒的组成
35.本实施例的aav纯化试剂盒包括以下试剂：裂解-平衡缓冲液、第一抗体、抗体偶联微珠以及洗脱液。
36.其中，抗体偶联微珠为第二抗体偶联的磁珠或琼脂糖微珠；
37.裂解-平衡缓冲液为ph 8-8.5的tirs缓冲液，其中含有浓度为0.05％-0.1％的吐温20以及浓度为0.2％-0.3％的np40；
38.洗脱液为ph 4-5的柠檬酸缓冲液，其中含有50-100mm的氯化钠。
39.3.aav的纯化
40.1)细胞培养：培养皿中加入10％胎牛血清(fbs)的dmem培养基，接种hek293细胞，在5％co2、37℃下进行培养，每3-5日传一代。
41.2)病毒质粒转染：当细胞密度为85％以上时，将细胞悬浮，将aav质粒转入细胞中。转入的质粒包括：repcap质粒(aav-1)、辅助质粒和载体质粒，载体质粒中搭载gfp表达框，用于后续检测纯化的aav的感染效率。转化子培养3-5天。
42.3)aav病毒纯化：
43.培养后的细胞培养物离心收集细胞，用裂解-平衡缓冲液重悬细胞，涡旋振荡2-5min使细胞破碎，然后离心，取破碎上清用于继续纯化，并保留一部分用于后续的功能验证实验。
44.向上清液中加入第一抗体，翻转振荡5-10min使第一抗体与aav颗粒充分结合；抗体偶联磁珠加入到ep管中，加入裂解-平衡缓冲液涡旋振荡15s，翻转振荡2min，在磁力架上移除液体；将第一抗体-上清液加入到ep管中，涡旋振荡15s，然后翻转振荡15-20min，使aav-第一抗体复合物与磁珠上的第二抗体结合，将aav锚定在磁珠上。将ep管转移至磁力架上，去除液体(本步骤液体用于后续的功能验证实验，为了简要，在后文中称为分离上清)，使用裂解-平衡缓冲液洗两次。然后加入洗脱液，涡旋振荡15s后，翻转振荡2-5min。然后在磁力架上吸取上清液，即得到纯化的aav溶液。磁珠和第一抗体的用量应当配合，使所有第一抗体能够全部吸附在磁珠上，以防止未结合aav的抗体与结合了aav的抗体之间发生竞争。
45.4.aav纯化试剂盒的功能验证
46.将破碎上清、分离上清和纯化得到的aav溶液进行蛋白定量检测，用破碎上清的蛋白含量进行归一化，结果如图4所示，本次纯化去除了约85-90％的蛋白。通过sds-page电泳检测，纯化得到的aav溶液在电泳中只有3个蛋白条带，分别对应vp1-3。可见，本发明的试剂盒可去除杂质蛋白，获得纯度非常高aav溶液。
47.测定纯化得到的aav溶液的滴度，对aav溶液进行梯度稀释，通过荧光定量pcr的方法来确定aav溶液的基因拷贝数滴度。我们购买了两种市售aav纯化试剂盒(市售纯化-1和市售纯化-2)，按说明书纯化后得到的aav溶液与本发明的试剂盒纯化得到的aav溶液的基因拷贝数滴度进行比较。结果如图5所示，本发明试剂盒纯化的aav溶液与市售的aav纯化试剂盒纯化得到的aav溶液没有显著差异，分离上清中几乎不含基因拷贝数，可见纯化比较彻底，aav回收率较高。
48.将上述试剂盒纯化得到的aav溶液进行梯度稀释，感染hek293细胞，由于aav内包裹的载体质粒中含有gfp表达框，可根据荧光表达情况来标记被感染的细胞，从而计算出感染滴度。结果如图6所示，本发明的试剂盒纯化得到的aav溶液的感染滴度约为5
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107tu/μl，显著高于两个市售试剂盒，分离上清不具有感染活性。
49.从以上效果验证实验可看出，本发明的纯化试剂盒可或的高纯度的aav溶液，基因拷贝数滴度与市售试剂盒相差不大。但是，在感染滴度方面，本发明试剂盒纯化得到的aav溶液具有显著更高的感染滴度。我们推测，很可能是因为本发明的试剂盒通过使用特异性抗体的方式分离aav从而剔除了一些微量的杂蛋白，使得本发明试剂盒纯化的aav溶液在基因拷贝数滴度差不多的情况下具有远高于市售试剂盒的感染滴度。
50.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。