一种检测HPV病毒的引物探针组合物及其应用的制作方法

一种检测hpv病毒的引物探针组合物及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及一种检测hpv病毒的引物探针组合物及其应用。


背景技术：

2.宫颈癌是目前唯一一种发病原因比较清楚的肿瘤，主要病因是由高危型人乳头瘤病毒(hpv)的持续和反复感染所致。研究表明，几乎所有(99.7％)的宫颈癌患者中都有hpv的感染，从hpv感染至宫颈癌发生需经历多年的时间，通过积极地处理hpv感染及癌前病变，可以有效阻断病情发展，预防宫颈癌的发生，因此，对hpv感染进行早期检测，对于宫颈癌治疗具有重要意义。
3.目前，临床上用于hpv检测的方法主要包括细胞学方法、免疫组化、原位杂交、斑点杂交、核酸印迹和pcr等，其中，pcr方法的灵敏度高、操作简便、高效廉价，是目前应用最为广泛的方法。实时荧光pcr检测方法是hpv诊断的最常见检测方法，在完全封闭的系统中运行，从而避免了交叉污染的可能性；在常规pcr扩增的基础上加入特异性探针，提高了检测的灵敏度和特异性，又可以实时荧光监测扩增过程。
4.但是，目前基于实时荧光pcr技术的hpv检测产品也存在一些不足。第一、产品不具有分型功能，只针对17种中高危hpv病毒进行检测，不能对hpv型别进行鉴定，影响预后和治疗；第二、产品可分型，但单次检测样本量少，虽具有分型功能，但是每检测一个样本，需要8个反应，大大增加了试剂及人工的成本，效率低；第三、产品的灵敏度和特异性低，市场上部分产品的灵敏度和特异性不高，经常出现漏检或假阳性现象。
5.综上所述，如何提供一种准确性高、成本低、高效且具有分型功能的hpv检测产品，是hpv检测领域亟需解决的问题之一。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足和实际需求，本发明采用提供一种检测hpv病毒的引物探针组合物及其应用，所述检测hpv病毒的引物探针组合物能够有效应用于实时荧光pcr检测hpv，单管四通道检测18种hpv达到分型类似效果，具备高特异性和准确性，且检测下限低。
7.为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
8.第一方面，本发明提供一种检测hpv病毒的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括检测18种型别hpv病毒的引物和探针，所述hpv病毒包括hpv16型、hpv18型、hpv31型、hpv33型、hpv35型、hpv39型、hpv45型、hpv51型、hpv52型、hpv56型、hpv58型、hpv59型、hpv66型、hpv68型、hpv26型、hpv53型、hpv73型和hpv82型。
9.本发明中，选择18种型别高感染率和癌变率的hpv病毒，并设计检测其的引物探针组合物，所述引物探针组合物能够有效应用于hpv检测，辅助宫颈癌早期诊断。
10.优选地，所述hpv16型的引物的核酸序列包括seq id no.1～seq id no.2所示的序列，hpv16型的探针的核酸序列包括seq id no.3所示的序列。
11.优选地，所述hpv18型的引物的核酸序列包括seq id no.4～seq id no.5所示的
序列，hpv18型的探针的核酸序列包括seq id no.6所示的序列。
12.优选地，所述hpv31型的引物的核酸序列包括seq id no.7～seq id no.8所示的序列，hpv31型的探针的核酸序列包括seq id no.9所示的序列。
13.优选地，所述hpv33型的引物的核酸序列包括seq id no.10～seq id no.11所示的序列，hpv33型的探针的核酸序列包括seq id no.12所示的序列。
14.优选地，所述hpv35型的引物的核酸序列包括seq id no.13～seq id no.14所示的序列，hpv35型的探针的核酸序列包括seq id no.15所示的序列。
15.优选地，所述hpv39型的引物的核酸序列包括seq id no.16～seq id no.17所示的序列，hpv39型的探针的核酸序列包括seq id no.18所示的序列。
16.优选地，所述hpv45型的引物的核酸序列包括seq id no.19～seq id no.20所示的序列，hpv45型的探针的核酸序列包括seq id no.21所示的序列。
17.优选地，所述hpv51型的引物的核酸序列包括seq id no.22～seq id no.23所示的序列，hpv51型的探针的核酸序列包括seq id no.24所示的序列。
18.优选地，所述hpv52型的引物的核酸序列包括seq id no.25～seq id no.26所示的序列，hpv52型的探针的核酸序列包括seq id no.27所示的序列。
19.优选地，所述hpv56型的引物的核酸序列包括seq id no.28～seq id no.29所示的序列，hpv56型的探针的核酸序列包括seq id no.30所示的序列。
20.优选地，所述hpv58型的引物的核酸序列包括seq id no.31～seq id no.32所示的序列，hpv58型的探针的核酸序列包括seq id no.33所示的序列。
21.优选地，所述hpv59型的引物的核酸序列包括seq id no.34～seq id no.35所示的序列，hpv59型的探针的核酸序列包括seq id no.36所示的序列。
22.优选地，所述hpv66型的引物的核酸序列包括seq id no.37～seq id no.38所示的序列，hpv66型的探针的核酸序列包括seq id no.39所示的序列。
23.优选地，所述hpv68型的引物的核酸序列包括seq id no.40～seq id no.41所示的序列，hpv68型的探针的核酸序列包括seq id no.42所示的序列。
24.优选地，所述hpv26型的引物的核酸序列包括seq id no.43～seq id no.44所示的序列，hpv26型的探针的核酸序列包括seq id no.45所示的序列。
25.优选地，所述hpv53型的引物的核酸序列包括seq id no.46～seq id no.47所示的序列，hpv53型的探针的核酸序列包括seq id no.48所示的序列。
26.优选地，所述hpv73型的引物的核酸序列包括seq id no.49～seq id no.50所示的序列，hpv73型的探针的核酸序列包括seq id no.51所示的序列。
27.优选地，所述hpv82型的引物的核酸序列包括seq id no.52～seq id no.53所示的序列，hpv82型的探针的核酸序列包括seq id no.54所示的序列。
28.本发明中，采取独特策略设计18种型别hpv病毒的引物探针组合物，选择特异检测靶点，使得所述引物探针组合物具备高特异性，从而有效进行实时荧光pcr检测hpv，检测具备高准确率和特异性，且具备高灵敏度。
29.优选地，所述探针的核酸序列5’端标记有荧光基团。
30.优选地，所述探针的核酸序列3’端标记有淬灭基团。
31.优选地，所述荧光基团包括fam、hex、rox或cy5。
32.优选地，所述淬灭基团包括bhq1或bhq2。
33.优选地，将所述hpv病毒分为第一组、第二组和第三组，所述第一组包括hpv16型和hpv18型，所述第二组包括hpv58型、hpv 33型、hpv 52型和hpv 31型，所述第三组包括hpv35型、hpv39型、hpv45型、hpv51型、hpv56型、hpv59型、hpv66型、hpv68型、hpv26型、hpv53型、hpv73型和hpv82型，同组中的各hpv病毒的探针具有相同的荧光基团，且所述第一组、第二组和第三组间探针具有不同的荧光基团。
34.本发明中，根据感染后癌变率高低对hpv病毒进行分组，第一组，感染后癌变率最高的hpv16和hpv18型；第二组，感染后癌变率第3位至6位的hpv58，hpv 33、hpv 52和hpv 31；第三组，其它的8种高危hpv型别(hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv56、hpv59、hpv66和hpv68)和4种最常见的hpv型别(hpv26、hpv53、hpv73和hpv82)，按照感染后癌变率高低分组，有利于预后与治疗，并设计探针的荧光基团，使得利用所述引物探针组合物在一个反应管内可以同时检测18种型别和内参，既能达到与分型相似的效果，又能提高检测样本量，每检测一个样本，只需一个反应，操作简便，节约成本。
35.优选地，所述引物探针组合物还包括内参基因的引物和探针。
36.优选地，所述内参基因包括ppi基因。
37.优选地，所述ppi基因的引物的核酸序列包括seq id no.55～seq id no.56，ppi基因的探针的核酸序列包括seq id no.57所示的序列。
38.本发明中，seq id no.1～seq id no.57序列如表1所示，其中k、m和r为iupac中规定简并碱基符号，k代表g或t，m代表c或a，r代表g或a。
39.表1
40.41.[0042][0043]
第二方面，本发明提供如第一方面所述的检测hpv病毒的引物探针组合物在制备检测hpv病毒的产品中的应用。
[0044]
第三方面，本发明提供一种检测hpv病毒的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的检测hpv病毒的引物探针组合物。
[0045]
本发明中，所述检测hpv病毒的试剂盒具备高特异性、准确率和灵敏度，能够在一个反应管内可以同时检测18种型别和内参，既能达到与分型相似的效果，又提高检测样本量，每检测一个样本，只需一个反应，操作简便，节约成本。
[0046]
优选地，所述试剂盒还包括pcr反应液和/或染料。
[0047]
优选地，所述pcr反应液包括dna聚合酶、mg
2+
缓冲液、dntps和水。
[0048]
优选地，所述染料包括rox校正染料。
[0049]
第四方面，本发明提供一种第三方面所述的检测hpv病毒的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，所述使用方法包括：
[0050]
提取待测样本中基因，采用检测hpv病毒的试剂盒进行实时荧光pcr检测，分析结果。
[0051]
优选地，所述实时荧光pcr检测的反应体系包括检测hpv病毒的引物探针组合物、mg
2+
、dna聚合酶和dntp。
[0052]
优选地，所述实时荧光pcr检测的反应体系中检测hpv病毒的引物和探针的浓度各自独立地为0.1μmol/l～0.8μmol/l，包括但不限于0.2μmol/l、0.3μmol/l、0.4μmol/l、0.5μmol/l、0.6μmol/l或0.7μmol/l，优选为0.4μmol/l。
[0053]
优选地，所述实时荧光pcr检测的反应体系中mg
2+
浓度为1.5mmol/l～5.0mmol/l，包括但不限于1.6mmol/l、1.7mmol/l、1.8mmol/l、1.9mmol/l、2mmol/l、3mmol/l、4mmol/l、4.2mmol/l、4.5mmol/l、4.6mmol/l或4.8mmol/l，优选为3mmol/l。
[0054]
优选地，所述实时荧光pcr检测的反应体系中dna聚合酶含量为1～4u，包括但不限于1.5u、1.8u、2u、2.5u、3u、3.2u、3.5u、3.6u或3.8u，优选为3u。
[0055]
优选地，所述实时荧光pcr检测的反应体系中dntp浓度为0.10mmol/l、～0.40mmol/l，包括但不限于0.15mmol/l、0.2mmol/l、0.25mmol/l、0.3mmol/l、0.35mmol/l或0.38mmol/l，优选为0.3mmol/l。
[0056]
优选地，所述实时荧光pcr检测的反应程序如表2所示。
[0057]
表2
[0058]
[0059]
本发明中，通过控制经过反应体系和反应条件，能够进一步提高试剂盒的灵敏度、特异性及稳定性。
[0060]
优选地，所述分析结果包括实时荧光pcr检测检测通道没有出现s型扩增曲线，判断为hpv病毒阴性；检测通道出现s型扩增曲线，且ct值≤37，则判断对应的hpv型别为阳性。
[0061]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0062]
本发明采用独特策略设计18种型别hpv病毒的引物探针组合物，并进行分组，使得所述引物探针组合物具备高特异性，从而有效进行实时荧光pcr检测hpv，检测具备高准确率、特异性和高灵敏度，同时，由于根据感染后癌变率高低对hpv病毒进行分组，控制各组病毒的探针中荧光基团，可通过单管四通道检测，在一个反应管内同时检测18种型别和内参，既能达到与分型相似的效果，又提高检测样本量，每检测一个样本，只需一个反应，操作简便，节约成本。
附图说明
[0063]
图1为实施例2中检测结果图；
[0064]
图2为hpv16的检测下限图；
[0065]
图3为hpv18的检测下限图；
[0066]
图4为hpv31的检测下限图；
[0067]
图5为hpv33的检测下限图；
[0068]
图6为hpv35的检测下限图；
[0069]
图7为hpv39的检测下限图；
[0070]
图8为hpv45的检测下限图；
[0071]
图9为hpv51的检测下限图；
[0072]
图10为hpv52的检测下限图；
[0073]
图11为hpv56的检测下限图；
[0074]
图12为hpv58的检测下限图；
[0075]
图13为hpv59的检测下限图；
[0076]
图14为hpv66的检测下限图；
[0077]
图15为hpv68的检测下限图；
[0078]
图16为hpv26的检测下限图；
[0079]
图17为hpv53的检测下限图；
[0080]
图18为hpv73的检测下限图；
[0081]
图19为hpv82的检测下限图；
[0082]
图20为特异性验证图(图示曲线均为vic通道内标曲线)。
具体实施方式
[0083]
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
[0084]
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，
或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
[0085]
实施例1
[0086]
本实施例提供一种检测hpv病毒的试剂盒，所述试剂盒包括18种型别hpv病毒及内参的引物探针序列如表3所示，根据所述hpv病毒的探针荧光基团对应荧光通道分类如表4所示，还包括2
×
pcr反应缓冲液、mgcl2、taq dna聚合酶(taq酶)和dntp。
[0087]
表3
[0088]
[0089]
[0090][0091]
表4
[0092][0093]
实施例2
[0094]
本实施例利用实施例中检测hpv病毒的试剂盒进行检测，包括以下步骤：
[0095]
(1)样本采集
[0096]
收集hpv阳性样本和阴性样本，提取样本dna；
[0097]
(2)按表5配制荧光pcr反应体系，将18种中高型别和内参的引物/探针分配到1个反应管；
[0098]
表5
[0099]
组分终浓度2
×
pcr反应缓冲液1
×
mg
2+
浓度3.0mmol/ldntp(含dutp)0.30mmol/ltaq酶3u引物浓度0.40μmol/l探针浓度0.2μmol/l样本dna5μl补水至50μl
[0100]
(3)按表6进行荧光pcr反应，在进行荧光pcr反应时，选择的荧光检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致，55℃时采集荧光。
[0101]
表6
[0102][0103]
荧光pcr结果如图1所示，阳性样本目标曲线与内标曲线均为典型“s”型曲线且高于阈值线，阴性质控曲线为阴性，检测结果符合技术标准。
[0104]
实施例3
[0105]
本实施例测试实施例1所述试剂盒的检测下限。
[0106]
合成含有所述18种型别hpv病毒的质粒，每个型别按103个拷贝/反应、104个拷贝/反应、105个拷贝/反应、106个拷贝/反应、107个拷贝/反应、108个拷贝/反应加入质粒，采用实施例1中试剂盒及实施2中检测过程，进行荧光pcr检测，结果见图2-图19，结果表明，在103个拷贝/反应时，各项指标也符合检测要求，因此，本发明创造性设计的引物和探针，能够提高检测的灵敏性，其检测下限可以达到103个拷贝/ml，目标曲线为典型“s”型曲线，且按稀释梯度ct值依次递增。
[0107]
实施例4
[0108]
本实施例测试实施例1试剂盒的特异性。
[0109]
收集其他hpv基因型样本14例(其中包含6型3例、61型3例、67型2例、71型6例，共14例)，生殖道寄生微生物/病毒样本17例(其中包含单纯疱疹病毒6例、人型支原体4例、白色念珠菌3例、解脲支原体4例，共17例)，测试试剂盒的特异性。
[0110]
采用实施例1中试剂盒及实施2中检测过程，进行荧光pcr检测，检测结果见图20，生殖道寄生微生物/病毒和其他hpv基因型的阳性曲线检测结果为阴性，内参曲线为典型“s”型曲线，表明试剂盒的特异性良好，可达100％。
[0111]
实施例5
[0112]
本实施例评估实施例1试剂盒的准确性。
[0113]
用人乳头瘤病毒(hpv)核酸检测试剂盒(pcr-荧光探针法)(备案证号：20193400416)，下称a试剂盒；和本发明实施例1试剂盒分别测试57例hpv阳性样本(18种型别，每种型别各1-6例)和20例阴性样本，检测结果见表7。
[0114]
表7
[0115][0116]
由表7可知，本发明实施例1试剂盒的准确率为100％，而a试剂盒的准确率为96.21％，表明本发明试剂盒的准确性高，可用于中高危hpv检测。
[0117]
综上所述，本技术采用独特策略设计18种型别hpv病毒的引物和探针，使得所述引物探针组合物具备高特异性，从而有效进行实时荧光pcr检测hpv，检测具备高准确率、特异性和高灵敏度，同时，根据感染后癌变率高低对hpv病毒进行分组，控制各组病毒的探针中荧光基团，可通过单管四通道检测，在一个反应管内同时检测18种型别和内参，既能达到与分型相似的效果，又提高检测样本量，每检测一个样本，只需一个反应，操作简便，节约成本。
[0118]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。