猪烈性传染病病原体多联检测试剂盒及其应用的制作方法

1.本发明属于分子生物学技术领域，涉及猪4种传染病病原体的检测，具体为猪烈性传染病病原体多联检测试剂盒及其应用。


背景技术：

2.猪急性、烈性传染病，其传染性、发病性极强，死亡率极高。如非洲猪瘟、猪瘟、口蹄疫、丹毒、肺疫等重大疫病。
3.猪烈性传染病对猪养殖业构成了严重威胁，如非洲猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、经典猪瘟和猪伪狂犬等烈性传染病对养猪业构成了很大威胁，也给养猪业造成了严重的经济损失。猪烈性传染病具有高度传染性、发病率和致死性，与其它非烈性传染病临床症状相似，临床症状不易区分，并且常与其它病原体混合感染，这都给临床诊断带来很大的麻烦。目前实验室诊断方法主要有病原体直接涂片镜检观察、细胞培养检查、血清酶联免疫学检测和核酸检测技术，其中镜检和培养法的特异性最好，但灵敏度较差，对样本的采集、保存、运输和实验条件要求高，检测周期长，部分病原体极难培养、无法质控，对混合感染检出率低；而免疫学检测灵敏度低，而且病原体感染具有窗口期，对于发病急、死亡率高的猪烈性传染病诊断价值不大。核酸检测技术由于其高灵敏度和特异性已越来越广泛地应用于猪病相关病原体的检测，但较低的检测通量以及检测试剂需要冷链运输及低温保存等问题限制了其在病原微生物方面的应用。因此，以上方法在实际应用中均存在一定的局限性。


技术实现要素：

4.解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，实现单样品多指标同时检测，简化实验操作步骤、提高检测通量，以满足多指标快速筛查及精准检测的迫切需求，真正实现“样本进、结果出”的一体化检测流程；鉴于此，本发明提供了猪烈性传染病病原体多联检测试剂盒及其应用。
5.技术方案：猪烈性传染病病原体多联检测试剂盒，所述试剂盒包括扩增非洲猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、经典猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的4个基因位点的特异性引物及荧光探针；其中，4个基因位点为：非洲猪瘟病毒的vp72基因，猪繁殖与呼吸道综合征病毒的n基因，经典猪瘟病毒的5’utr基因，猪伪狂犬病毒的gd基因；以及猪内参基因actb的特异性引物和荧光探针。
6.优选的，所述特异性引物及荧光探针序列如下：asfv、seq id no.1-3；prrsv、seq id no.4-6；csfv、seq id no.7-9；prv、seq id no.10-12；sus、seq id no.13-15。
7.表1特异性引物及荧光探针序列表
[0008][0009]
优选的，所述试剂盒包含pcr反应液ⅰ和pcr反应液ⅱ；其中，pcr反应液ⅰ包括seq id no.1-2、seq id no.4-5、seq id no.13-14所示的特异性引物，以及seq id no.3、seq id no.6和seq id no.15所示的荧光探针；pcr反应液ⅱ包括seq id no.7-8、seq id no.10-11所示的特异性引物，以及seq id no.9、seq id no.12所示的荧光探针。
[0010]
优选的，所述特异性引物和荧光探针在扩增体系中的终浓度为：seq id no.1为0.2μm，seq id no.2为0.2μm，seq id no.3为0.2μm，seq id no.4为0.2μm，seq id no.4为0.2μm，seq id no.6为0.2μm，seq id no.7为0.12μm，seq id no.8为0.12μm，seq id no.9为0.12μm，seq id no.10为0.12μm，seq id no.11为0.12μm，seq id no.12为0.12μm，seq id no.13为0.12μm，seq id no.14为0.12μm，seq id no.15为0.12μm。
[0011]
优选的，所述试剂盒包括：dntp为0.2mm，taq酶为2.5u，rtase为1.25u，rnase inhibitor为1.25u，mgcl2为4mm。
[0012]
优选的，seq id no.3的5’端采用荧光染料6-fam标记，seq id no.6的5’端采用荧光染料hex标记，seq id no.15的5’端采用荧光染料cy5标记，seq id no.9的5’端采用荧光染料6-fam标记，seq id no.12的5’端采用荧光染料hex标记。
[0013]
以上任一所述试剂盒在针对单个样品同时检测非洲猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、经典猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒中的应用。
[0014]
优选的，所述试剂盒对非洲猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、经典猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的检测灵敏度均达到500拷贝/反应。
[0015]
优选的，针对单个样品同时检测非洲猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、经典
猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的具体方法为：在核酸提取壳体的样品孔中加入待检测的样品，样品经过整个核酸提取流程后得到样品中纯化的核酸，然后将所得纯化核酸转移至装有检测冻干试剂的核酸检测壳体中，冻干试剂与液体的纯化核酸接触后复溶为完整的核酸扩增体系，最后通过添加密封试剂即可进行样品检测，待整个核酸扩增过程结束后，检测仪器会自动对检测结果进行判断。
[0016]
有益效果：(1)本发明所述试剂盒将多重荧光定量pcr扩增技术与冷冻干燥技术进行结合，实现单样品多指标同时检测，该系统简化了实验操作步骤、提高了检测通量，为猪烈性传染病病原体多指标精准检测提供了新方法，满足多指标快速筛查及精准检测的迫切需求；(2)所述试剂盒应用方法简单，仅需将提取试剂和预先冻干的检测试剂置于相应区域，只需加入样品即可进行检测；(3)所述试剂盒在检测过程中检测区完全相互隔离和密闭，检测完成后，密封试剂固化，有效防止整个检测过程和检测结束后扩增产物向外扩散，防止环境污染；(4)所述试剂盒在2个小时左右即可实现在一个装置内同时实现4种常见猪烈性传染病病原体的检测。
附图说明
[0017]
图1是本发明所述试剂盒应用的检测装置结构示意图。
具体实施方式
[0018]
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0019]
实施例1
[0020]
猪烈性传染病病原体多联检测试剂盒：所述试剂盒包括扩增非洲猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、经典猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的4个基因位点的特异性引物及荧光探针；其中，4个基因位点为：非洲猪瘟病毒的vp72基因，猪繁殖与呼吸道综合征病毒的n基因，经典猪瘟病毒的5’utr基因，猪伪狂犬病毒的gd基因；以及猪内参基因actb的特异性引物和荧光探针。
[0021]
所述特异性引物及荧光探针序列如下：asfv、seq id no.1-3；prrsv、seq id no.4-6；csfv、seq id no.7-9；prv、seq id no.10-12；sus、seq id no.13-15。
[0022]
表1特异性引物及荧光探针序列表
[0023][0024]
所述试剂盒包含pcr反应液ⅰ和pcr反应液ⅱ；其中，pcr反应液ⅰ包括seq id no.1-2、seq id no.4-5、seq id no.13-14所示的特异性引物，以及seq id no.3、seq id no.6和seq id no.15所示的荧光探针；pcr反应液ⅱ包括seq id no.7-8、seq id no.10-11所示的特异性引物，以及seq id no.9、seq id no.12所示的荧光探针。
[0025]
所述特异性引物和荧光探针在扩增体系中的终浓度为：seq id no.1为0.2μm，seq id no.2为0.2μm，seq id no.3为0.2μm，seq id no.4为0.2μm，seq id no.4为0.2μm，seq id no.6为0.2μm，seq id no.7为0.12μm，seq id no.8为0.12μm，seq id no.9为0.12μm，seq id no.10为0.12μm，seq id no.11为0.12μm，seq id no.12为0.12μm，seq id no.13为0.12μm，seq id no.14为0.12μm，seq id no.15为0.12μm。
[0026]
所述试剂盒包括：dntp为0.2mm，taq酶为2.5u，rtase为1.25u，rnase inhibitor为1.25u，mgcl2为4mm。
[0027]
seq id no.3的5’端采用荧光染料6-fam标记，seq id no.6的5’端采用荧光染料hex标记，seq id no.15的5’端采用荧光染料cy5标记，seq id no.9的5’端采用荧光染料6-fam标记，seq id no.12的5’端采用荧光染料hex标记。
[0028]
实施例2特异性试验
[0029]
(1)检测装置含2个部分，一部分是提取试剂，按要求罐装相应体积的提取试剂，并塑封；另一部分为检测试剂，采用冻干球形式，主要由引物，mg
2+
,dntps，聚合酶，逆转录酶等组成，组分按一定比例配制后，进行冻干。冻干程序包括-45-50℃的预冻，一次干燥，二次干燥。出厢后与提取试剂部分合并抽真空保存。
[0030]
(2)取出检测装置，将含有非洲猪瘟病毒vp72基因序列的质粒、科前猪蓝耳活疫苗
(jxa1-r株)、齐鲁猪瘟活疫苗、科前伪狂犬活疫苗(hb-98株)、哈维科猪传染性胃肠炎/猪流行性腹泻/猪轮状病毒(g5型)三联活疫苗、科前猪细小灭活疫苗、科前猪乙型脑炎活疫苗、中牧猪圆环病毒2型灭活疫苗、科前猪支原体肺炎灭活疫苗、科前猪流感病毒h1n1亚型灭活疫苗加入该检测装置的样本孔中，放入仪器后进行核酸提取及检测，检测结果如表2所示。
[0031]
表2特异性检测结果
[0032]
[0033][0034]
表2中，+表示检测结果阳性；-表示检测结果阴性。
[0035]
表2结果表明本发明能特异性地检测非洲猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、经典猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒，而与其他病原微生物无交叉反应，如猪传染性胃肠炎病毒、
猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、猪流感病毒。
[0036]
实施例3灵敏度检测试验
[0037]
将含有非洲猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、经典猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒各自靶标的质粒dna用灭菌纯化水稀释一定拷贝数倍比稀释液，然后分别加入到检测装置的检测孔上进行检测。
[0038]
由检测结果可以说明该检测方法对非洲猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、经典猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的检测灵敏度都是500拷贝/反应。