一种乳腺癌多基因检测panel、试剂盒及其应用的制作方法

1.本发明属于乳腺癌多基因检测技术领域，涉及基于一种乳腺癌多基因检测panel、试剂盒及其应用。


背景技术：

2.globocan 2020数据显示，在中国整体人群中，女性乳腺癌新发病例数为416 371例，为第四大发病原因(9.1％)，仅次于肺癌(17.9％)、结直肠癌(12.2％)和胃癌(10.5％)。乳腺癌死亡病例数为117 174例，在全癌症死亡原因中居第七位。我国的乳腺癌疾病负担不断加重，发病率和死亡率均居于前列。
3.肿瘤基因诊断基于分子生物标记物，有较高的分辨率、较早的观测时间窗口和复发转移监测的便捷性，可用于早筛、早诊、辅助诊断、伴随诊断等全周期管理。前主要有荧光pcr、荧光原位杂交、免疫组化和ngs技术，目前应用较多的是荧光pcr。基于ngs技术的肿瘤液体活检和伴随诊断，为肿瘤患者提供了更加精确的用药指导和肿瘤治疗方案以及肿瘤愈后监控评估患者复发肿瘤的危险程度。肿瘤基因检测仍在发展早期，目前仍是辅助手段。多基因检测不仅仅应用在判断肿瘤病因，预测疾病的预后和转归、寻找药物有效治疗靶点，在未来可能会是协助医生进行治疗方式选择的重要工具因此，开发一种能够基于二代测序技术进行高通量检测乳腺癌的方法是十分有必要的。


技术实现要素：

4.本发明通过挑选tcga数据库、metabric数据库、mskcc-impact数据库、美国乳腺癌560例wgs数据库以及肿瘤医院乳腺研究所数据库中与乳腺癌发生发展及靶向治疗密切相关的基因，基于二代测序技术，利用生物素探针杂交法富集其中108个基因的重要外显子区域与部分内含子区域，并进行高深度测序，从而精准检测其中与乳腺癌有明确临床相关性的基因突变、拷贝数变异等事件，并将该多基因筛选列表做成探针，通过dna测序针对性地检测高危基因，可以更高效地检测出对诊断、治疗有指导意义的基因突变，对肿瘤患者进行精准分型，同时也可能帮助某些肿瘤患者参加到临床试验中。对临床的诊断和发现靶向治疗的靶点具有重要指导意义。有针对性地检测突变基因，也可以降低患者基因检测的成本。
5.第一方面，本发明提供了一种乳腺癌多基因检测panel，所述基因检测panel包括mtor、kdm5a、brca1、tgfbr2、hdac2、cyp2c19、arid1a、rad52、spop、setd2、ros1、hras、jak1、cacna1c、rnf43、rhoa、esr1、ctnna2、dpyd、kras、stk11、pbrm1、syne1、cdk6、notch2、erbb3、cyp4f3、atr、egfr、neb、ntrk1、cdk4、ppp2r1a、pik3ca、met、ttn、ddr2、flt3、alk、sox2、smo、prkdc、gata3、brca2、msh6、fgfr3、braf、fgfr2、ret、rb1、sf3b1、pdgfra、prex2、tp53、pten、akt1、idh1、fbxw7、cdkn2a、smad4、muc6、rad51、erbb4、tert、aqp7、nfe2l2、ccnd1、idh2、ugt1a1、map3k1、ptch1、gnas、fgf19、tsc2、runx1、pik3r1、tsc1、dgkb、fgf4、cbfb、chek2、apc、med12、cyp3a4、fgf3、cdh1、nefh、rad50、atrx、csmd1、atm、nf1、nf2、notch4、nras、fgfr1、cbl、omg、cyp2d6、kif6、ctnnb1、myc、chek1、erbb2、vhl、ttk、kit、atp2b3。
6.第二方面，本发明提供了一种检测乳腺癌的探针panel，所述探针panel为针对第一方面所述的多基因产生的突变、拷贝数变异的检测探针。
7.在某些实施例中，所述的检测探针偶联有或带有可检测标记。
8.在某些实施例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
9.第三方面，本发明还提供了本发明第一方面所述的多基因panel或本发明第二方面所述的探针panel在制备乳腺癌检测装置中的应用。
10.在某些实施例中，所述装置为测序仪器或者试剂盒。
11.第四方面，本发明还提供了一种乳腺癌的检测装置，包括：
12.测序模块，用于对待测样本的dna进行提取，并进行高通量测序，获得测序结果；
13.对比模块，用于对高通量测序的结果进行处理，并将数据与本发明第一方面所述的多基因panel进行比对，获得基因变化信息；
14.分析模块，用于分析获得的突变信息，得出用药方案。
15.在某些实施例中，所述基因变化信息包括多基因产生的突变或拷贝数变异。
16.第五方面，本发明还提供了一种乳腺癌的诊断检测方法，包括以下步骤，
17.步骤s1：获得检测样本dna(所述样本dna包括血液样本的dna组织样本dna及cfdna)，提取病人的病灶组织及癌旁或血液组织进行dna提取，石蜡包埋组织亦可。
18.步骤s2：样本dna文库的构建，将dna随机片段化成几百碱基或更短的小片段，然后采用kapa文库构建试剂盒进行文库制备。主要步骤有：dna打断，末端补平，3’端加“a”，接头连接，纯化，文库扩增，纯化。文库制备完成后将其置于-20℃保存。
19.步骤s3：构建本发明所述检测panel的检测探针，优先为rna探针，与dna文库杂交捕获，并测序；也可直接进行全基因组或者全外显子组测序。
20.步骤s4：对测序结果进行生物学信息分析，获得样本突变结果。
21.其中，所述测序结果为fastq文件，使用broad发布的获取基因突变的算法分析测序结果，得到基因突变的结果并注释。主要步骤有fastq文件的质量控制，基因组联配，体细胞突变(somatic mutation)及胚细胞突变(germline mutation)的分析，进行注释。用到的软件分别有：fastqc和fastx_toolkit用来做质量控制；bwa做联配，gatk及mutect2获得体细胞突变；haplotypecaller方法获得胚细胞突变；annovar做注释。
22.步骤s5：将样本突变结果与所述检测panel进行比对，得到该样本基因突变结果，结合临床信息得到最终诊断。
23.本发明相对于现有技术具有的有益效果：
24.1)本发明基于二代测序技术，利用生物探针杂交法富集与乳腺癌相关的108个基因的重要外显子区域与部分内含子区域，检测和分析内容包括体基因突变，拷贝数变异等，旨在达到精准检测。
25.2)将该多基因筛选列表做成探针，通过杂交捕获测序针对性地检测乳腺癌相关的高危基因，可以更高效地检测出对诊断、治疗有指导意义的基因突变，也可以降低乳腺癌患者基因检测的成本和实验员的操作难度，同时也可能帮助乳腺癌患者参加临床试验，对临床的诊断和发现靶向治疗的靶点具有重要指导意义。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
27.图1为病例1的基因突变种类检测结果。
28.图2为病例2的基因突变种类检测结果。
29.图3为病例3的基因突变种类检测结果。
30.图4为病例4的基因突变种类检测结果。
具体实施方式
31.根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施案例所描述的内容仅用于说明和解释本发明，并不用于限制权利要求书中所详细描述的本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备如无特别说明，均为常规方法，所使用的试验材料如无特别说明，均可从商业公司获取。
32.实施例
33.1.取病人的癌组织及血液样本提取dna，使用试剂盒分别为tiangen tguide cells/tissue genomic dna kit及tiangen tguide large volume blood genomic dna kit(1-3ml)。
34.2.dna样本文库制备。先使用bioruptor ucd-300非接触式全自动超声波破碎仪对dna随机打断，ctdna无需此步。取dna400ng，nuclease-free water稀释至50μl，转移至0.5ml eppendorf lobind tube管内，充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。放置样品：对称放置离心管(如有单管，用空管加水配平)，将转头拧紧，放置于冰盒上，预冷1～2min。150～200bp超声破碎。重复前一步超声破碎，共9个cycle，约90min结束。然后采用kapa文库构建试剂盒进行文库制备。
35.3.rna探针制备。从公司得到目标基因的oligo pool，用1
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te(ph 8.0)，将oligo pool稀释到1ng/μl。用herculase ii fusion dna polymerase kit扩增oligo序列。再用ambion sp6 megascript kit进行rna转录，探针制备完成。-80℃保存rna探针，取部分rna探针文库稀释至100ng/μl。
36.该方法制作的探针可以应用于200-300个样本，极大程度上降低了测序的成本。
37.4.杂交捕获及送样测序。
38.4.1将95μl block和总量不少于500ng体积约为5μl的dna文库混匀后离心，标记为“dna-block”，置于pcr仪上，盖热盖，95℃5min；65℃6old。
39.4.2配“bait”mix反应体系于pcr反应管，标记为“bait”,pcr仪温度降至65℃2.5min时，将“bait”管置于pcr仪上孵育，盖上热盖。
40.componentvolume100ng/μl rna探针(bait)5μl20u/μl superase-in rnase in6ibitor1μl
41.4.3将pcr管“bait”放置入pcr仪2.5min后，从“6yb buffer”中吸取13μl hyb buffer移至“dna-block样品中，从“bait”孔中吸取6μl移至“dna-block样品中，轻轻吸打10次，充分混匀，避免产生大量气泡，贴膜，盖上pcr仪热盖，65℃孵育过夜246。然后准备捕获
磁珠。按照每个样本需3
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165μl的6ig6-stringency buffer，分装6ig6-stringency buffer于96孔板，打开干燥仪，调整干燥仪温度为65℃，待干燥仪温度稳定在65℃，置于干燥仪预热。然后进行捕获目标区域dna文库，完成dna文库进行富集(post-pcr反应)。然后进行文库的混合和送样测序。
42.5.数据分析。
43.对ctdna进行突变的分析。利用mutect2分析，关闭duplicate read filter。在分析获得xxx_mutect_variation.vcf文件后，进行cosmic和fuscc tnbc数据的筛选，获得xxx_mutect_variation_filtered.vcf。对filtered_vcf文件利用annovar注释。
44.得到所有组织样本的注释结果后，整理后即为待测样本乳腺癌相关基因的突变或拷贝数变异结果。
45.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。