一种纳豆激酶活性的测定方法与流程

1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种纳豆激酶活性的测定方法。


背景技术：

2.纳豆激酶（nattokinase，nk）是由枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）的一个亚种——纳豆芽孢杆菌（bacillus natto）分泌产生的一种具有强烈溶栓作用的碱性丝氨酸蛋白酶，与目前用于治疗的溶栓药物相比，纳豆激酶具有明显的优势，比如无副作用、易于吸收、半衰期长、成本低、在溶栓过程中无出血倾向等，故对于纳豆激酶的研究已成为新一代溶栓药物研究的热点。测定纳豆激酶活力的方法主要有纤维蛋白平板法、琼脂糖-纤维蛋白平板法、纤维蛋白块溶解时间法、四肽底物法、血清板法和酶联反应吸附法。在对纳豆激酶的发酵及分离提取操作中，琼脂糖-纤维蛋白平板法是被使用最多的测定纳豆激酶活力的方法，并被指定作为尿激酶、蚓激酶活性测定的标准方法。然而，该方法存在制板耗时长、制板机械强度低成本高等缺陷，且在纳豆激酶培育后所生成的酶溶圈不均匀，清晰度较差，不利于结果的观测。
3.cn113337575a专利申请文件中，利用纤维蛋白平板打孔法进行测定，该方法包括纤维蛋白平板的制备，其中溶解琼脂的tirs-hcl溶液ph为7.5-8.5，琼脂与nacl质量比为5:(5-6)，纤维蛋白原溶液的浓度为40-60mg/ml，凝血酶溶液浓度为80-120u/ml，纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液的体积比为10：(0.5-1.5)；待测样品的制备，样品稀释液nacl溶液的浓度为7-9g/l；尿激酶标准曲线的测定，量取的标准尿激酶溶液的体积与待测样品取样的体积相同，尿激酶溶液标准品的制备过程：先取无菌的生理盐水溶解尿激酶标准品，浓度为64aiu/支，制成32aiu/ml的溶液，再从上述溶液中稀释成16aiu/ml的溶液，进一步依次稀释成8aiu/ml、4aiu/ml、2aiu/ml、aiu/ml的标准尿激酶溶液；a为自然数。其中生理盐水的浓度为0.9-1.2％w/v。尿激酶标准曲线的绘制；待测样品纳豆激酶活性的检测，取待测样品上样于同一平皿的孔中，放置10min后置于37℃恒温培养箱中反应，18h后测量溶解圈的垂直两直径，根据标准曲线方法及稀释浓度求出样品的纳豆激酶活性。但在平板上直接打孔存在一定的缺陷，如：会把凝固的平板弄碎、无法保证酶溶液是否会渗透到别处、酶溶液会溢出等。如cn102041293a专利申请中，在特定条件ph为7.5的情况下，纳豆激酶水解为酪蛋白底物，利用folin-酚试剂在弱碱性溶液波长680nm处吸光度的大小来推测酶活力的大小。该方法稳定性差，无法确定纳豆激酶的水解程度，且会产生一些副产物以及水解后溶液的澄清度都会影响吸光度的测定。


技术实现要素：

4.针对目前纳豆激酶测定过程中操作复杂、不适于大批量筛选，检测准确度差、灵敏度低的问题，本发明提供一种纳豆激酶活性的测定方法，易形成溶圈且溶圈均匀度好、清晰度高，有利于观测试验结果，检测结果酶活性准确度、灵敏度高，检测下限低。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
6.一种纳豆激酶活性的测定方法，包括以下步骤：（1）提取纳豆激酶获得纳豆激酶提取液；（2）制作琼脂粉-纤维蛋白平板；（3）将中空圆管垂直插入琼脂粉-纤维蛋白平板底部分别加入纳豆激酶提取液，25℃-28℃静置孵育12-24h后，测定溶圈的垂直直径，不同重复的直径比0.9-1.1之间纳入计算，以垂直直径乘积计算溶圈面积。
7.优选地，所述中空圆管的内直径3
±
1mm，高度8-10mm。
8.优选地，所述提取纳豆激酶的方法为：将鲜纳豆加入生理盐水中，搅拌5min，4000rpm离心10min，获得上清液，即纳豆激酶提取液；鲜纳豆和生理盐水的料液比为1:（2-40）w/v。
9.所述琼脂粉-纤维蛋白平板的厚度为3-10mm。
10.优选地，上述测定方法中，还包括测定系列浓度的尿激酶标准溶液溶圈并根据尿激酶标准溶液对数和溶圈面积做标准曲线计算回归方程和纳豆激酶提取液中酶活计算的步骤。
11.本发明具有以下优点：本发明方法采用琼脂粉-纤维蛋白平板，结合辅助工具使用起来方便，可以提高纳豆激酶溶解纤维蛋白原成圈率，形成的溶圈均匀，清晰度高，并且检测结果酶活性准确度、灵敏度高，检测限低。本发明方法操作简便，机械强度好，成本低廉，辅助工具可以采用抗高温塑料材料制成，经灭菌后也可以循环利用，也可以采用一次性塑料材料，成本低。本发明方法使用较低的温度条件，可抑制杂菌生长，同时抑制纳豆激酶自身活性的损失，保持活性。本发明使用的中空圆柱形辅助工具，能够避免纳豆激酶加注过程中溢出，同时对纳豆激酶起到缓控释作用，使纳豆激酶缓慢释放，从而使形成的溶圈均匀、圆润。本发明方法适用于纳豆激酶菌种选育和发酵工艺等大量试验筛选的需求。
附图说明
12.图1中的方法a（1、2）和方法b（3、4）在15 iu/ml纳豆激酶浓度下的溶圈；图2是实施例1中尿激酶的标准曲线。
具体实施方式
13.下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
14.实施例1 纳豆激酶活性的测定（1）称取纳豆激酶标准品，配制成母液，然后稀释2200iu/ml、1100iu/ml、110iu/ml、22iu/ml、15iu/ml、10iu/ml的纳豆激酶稀释液；（2）准确称取尿激酶，溶解并定容，配制尿激酶母液并稀释成为活力单位分别为50 iu/ml、100 iu/ml、200 iu/ml、400 iu/ml、800 iu/ml的尿激酶标准溶液；（3）50℃水浴中保温的1%琼脂粉溶液和1.5mg/ml纤维蛋白原液等体积混合后混匀倒板，制成厚度为5mm的琼脂粉-纤维蛋白平板；（4）按照以下方法测定：
a）本发明方法：将若干直径3
±
1mm、高度8mm的中空圆管垂直插入琼脂粉-纤维蛋白平板中，分别加入10μl纳豆激酶稀释液或尿激酶标准溶液，重复5次，25℃静置孵育16h后，测定溶圈的垂直直径，直径比0.9-1.1之间纳入计算，以垂直直径乘积计算溶圈面积；b）琼脂糖-纤维蛋白平板法：在琼脂糖-纤维蛋白平板上打孔，然后按照a）中操作进行；c）folin-酚法：将1ml纳豆激酶稀释液与2ml 0.5%酪蛋白混合37℃孵育10min，加入3ml10%tca终止反应，放置15min后过滤，加入0.55m碳酸钠5ml，folin-酚溶液1ml，37℃孵育15min，然后吸光度680nm处检测样品吸光度，以纳豆稀释液溶剂为空白对照，计算酶活力的大小；（5）以尿激酶标准溶液活力单位对数为纵坐标，透明圈面积为横坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，根据纳豆激酶稀释液形成透明圈面积计算稀释液中的活力单位，尿激酶的标准曲线如图2所示，获得回归方程为y=0.0045x+1.1208，r2=0.9956。
15.三种方法测定的纳豆激酶稀释液的活性和6次平行试验的变异系数结果如表1所示：表1 三种方法测定结果和变异系数通过表1数据可知，相比于常规的琼脂糖-纤维蛋白平板法，本发明的方法具有更好灵敏度，最低可以检测15 iu/ml左右的纳豆激酶活性；相比与folin-酚试剂的比色法，本发明的方法在低浓度下，如110 iu/ml浓度以下有更好的准确度。
16.通过表1中溶圈直径比和图1中溶圈图片可知，相比于常规的琼脂糖-纤维蛋白平板法，本发明的方法形成的溶圈更加均匀、清晰。
17.实施例2 纳豆激酶活性的测定（1）称取纳豆激酶标准品，配制成母液，然后稀释4400iu/ml、2200iu/ml、1100iu/ml、110iu/ml、15 iu/ml、10 iu/ml的纳豆激酶稀释液；（2）准确称取尿激酶，溶解并定容，配制尿激酶母液并稀释成为活力单位分别为50 iu/ml、100 iu/ml、200 iu/ml、400 iu/ml、800 iu/ml的尿激酶标准溶液；（3）50℃水浴中保温的1%琼脂粉溶液和1.5mg/ml纤维蛋白原液等体积混合后加入1 bp/ml凝血酶溶液10μl混匀倒板，制成厚度为5mm的琼脂粉-纤维蛋白平板；（4）将若干直径3
±
1mm、高度8mm的中空圆管垂直插入琼脂粉-纤维蛋白平板，分别加入10μl纳豆激酶稀释液或尿激酶标准溶液，重复5次，25℃静置孵育16h后，测定溶圈的垂直直径，5次重复的直径比0.9-1.1之间纳入计算，以垂直直径乘积计算溶圈面积；（5）以尿激酶标准溶液活力单位对数为横坐标，透明圈面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，根据纳豆激酶稀释液形成透明圈面积计算稀释液中的活力单位。
18.通过计算，当纳豆激酶的活性在15-2200 iu/ml时较好的符合线性规律。
19.应用例1 纳豆激酶活性的测定（1）称取50g新鲜纳豆加入100ml 0.9%生理盐水，400rpm搅拌10min，静置后过滤，滤液5000rpm离心15min获得上清液，即纳豆激酶提取液，然后稀释10、20、147、220倍获得纳豆激酶稀释液；（2）准确称取尿激酶，溶解并定容，配制尿激酶母液并稀释成为活力单位分别为50 iu/ml、100 iu/ml、200 iu/ml、400 iu/ml、800 iu/ml的尿激酶标准溶液；（3）50℃水浴中保温的1%琼脂粉溶液和1.5mg/ml纤维蛋白原液等体积混合后加入1 bp/ml凝血酶溶液10μl混匀倒板，制成厚度为5mm的琼脂粉-纤维蛋白平板；（4）将若干直径3
±
1mm、高度8mm的中空圆管垂直插入琼脂粉溶-纤维蛋白平板，分别加入10μl纳豆激酶稀释液或尿激酶标准溶液，重复5次，25℃静置孵育16h后，测定溶圈的垂直直径，直径比0.9-1.1之间纳入计算，以垂直直径乘积计算溶圈面积；（5）以尿激酶标准溶液活力单位对数为横坐标，透明圈面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，根据纳豆激酶稀释液形成透明圈面积计算稀释液中的活力单位，计算获得纳豆激酶稀释液的活性分别为45.5、110.4、200.0、377.5、805.6。