蔗糖梯度离心溶液及其制备方法、流感裂解病毒疫苗制备工艺及病毒纯化工艺与流程

1.本技术实施例涉及流感裂解病毒疫苗领域，尤其涉及一种蔗糖梯度离心液的制备方法、蔗糖梯度离心溶液、流感裂解病毒疫苗制备工艺及流感裂解病毒纯化工艺。


背景技术：

2.流行性感冒(简称流感)是一种具有严重危害的病毒性急性呼吸道传染疾病，该病主要通过带有流感病毒的空气飞沫在人群中传播。在流感大流行期间，流感的发病率可达5％-30％，严重的病例可引起病毒性肺炎和继发细菌性感染，患慢性呼吸道疾病的老人死亡率达1/1500。流感疫苗是预防流感爆发和流行的最有效措施。目前，流感疫苗有流感灭活疫苗、流感减毒活疫苗和重组疫苗。其中，流感灭活疫苗有全病毒疫苗、裂解病毒疫苗和亚单位疫苗三种。
3.现有技术中，流感病毒疫苗生产过程的纯化工艺一般采用多步纯化：流感病毒离心破碎、超滤浓缩、超速离心机梯度离心纯化、层析纯化。
4.超速离心机梯度离心纯化原理为：用超速离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部会出现一定的密度梯度。若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。
5.超速离心机梯度离心纯化普遍采用蔗糖溶液作为梯度离心溶液。现有技术的梯度离心溶液，普遍采用磷酸盐溶液加蔗糖溶解，除菌过滤后使用。
6.然而，发明人在长期研究流感裂解病毒疫苗制备工艺的过程中发现：现有技术的纯化工艺中，配制大批量高密度的蔗糖梯度离心溶液(或简称蔗糖溶液)时，制备好的磷酸盐溶液放置于库房，再配制高密度蔗糖溶液的过程中，磷酸盐溶液加蔗糖后，容易出现溶解不完全的问题，密度越高，这种情况越明显。由于溶解效果达不到质量要求，除菌过滤阶段，配制好的蔗糖溶液特别粘稠，极易堵塞过滤器，过滤效果特别不好，为满足工艺要求，只能增加除菌过滤器的使用量，因而需要消耗大量的除菌过滤器，导致除菌过滤器单次使用量大，成本极为高昂。


技术实现要素：

7.本技术实施例提供一种蔗糖梯度离心溶液的制备方法、蔗糖梯度离心溶液、流感裂解病毒疫苗制备工艺及流感裂解病毒纯化工艺，以有效解决蔗糖溶液配制过程中溶解不完全、除菌过滤阶段堵塞过滤器的技术难题，大量减少除菌过滤器使用量，显著降低生产成本。
8.为达到上述发明目的，第一方面，本技术实施例提供了一种蔗糖梯度离心溶液的制备方法，应用于流感裂解病毒梯度离心纯化工艺，包括：
9.取200-900.00g/l注射用水加热，得到40～80℃的高温注射用水；
10.取不少于所述高温注射用水总量85％的第一部分至配液搅拌罐，开启搅拌系统后，加入30-100.00g/l磷酸盐混合物溶解；
11.至溶解后的溶液澄清后，分梯度加入蔗糖100-800.00g/l；
12.加入不少于总量的5％的第二部分所述高温注射用水定容并搅拌至澄清后，除菌分装。
13.在一些可能的实施方式中，所述高温注射用水温度为60-80℃。
14.在一些可能的实施方式中，所述高温注射用水温度为60-70℃。
15.在一些可能的实施方式中，所述高温注射用水温度为70-80℃。
16.在一些可能的实施方式中，所述30-100.00g/l磷酸盐混合物包括10-100.00g/l磷酸氢二钠、10-100.00g/l磷酸二氢钾和10-100.00g/l氯化钠的至少一种。
17.在一些可能的实施方式中，所述第一部分所述高温注射用水为所述高温注射用水总量的90％。
18.在一些可能的实施方式中，所述第二部分所述高温注射用水为所述高温注射用水总量的10％。
19.第二方面，本技术实施例提供了一种蔗糖梯度离心溶液，采用如上所述的蔗糖梯度离心溶液的制备方法制得。
20.第三方面，本技术实施例提供了一种流感裂解病毒疫苗病毒纯化工艺，采用如上所述的蔗糖离心液进行梯度离心。
21.第四方面，本技术实施例提供了一种流感裂解病毒疫苗制备工艺，采用如上所述的病毒纯化工艺对流感裂解病毒疫苗病毒进行纯化。
22.本技术的有益效果是：
23.本技术实施例通过将蔗糖溶液的水溶剂加热至40-80℃后，再加入磷酸盐混合物和蔗糖溶解，最后再加入少量加热后的所述水溶剂补充，从而达到了确保高密度蔗糖溶液溶解完全的技术效果。且由于溶液是高温状态，除菌分装的时候，粘稠状态有很大的物理改善，除菌过滤速度加快，单根过滤器能够过滤的溶液体积量有多倍增加。
具体实施方式
24.为使本技术的目的、技术方案和优点更加清楚，以下将参通过实施方式详细地描述本技术实施例的技术方案。显然，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
25.本技术实施例提供了一种蔗糖梯度离心溶液的制备方法，应用于流感裂解病毒梯度离心纯化工艺，包括：
26.取200-900.00g/l注射用水加热，得到40～80℃的高温注射用水；
27.取不少于总量85％的第一部分所述高温注射用水至配液搅拌罐，开启搅拌系统后，加入30-100.00g/l磷酸盐混合物溶解；
28.至溶解后的溶液澄清后，分梯度加入蔗糖100-800.00g/l；
29.加入不少于总量的5％的第二部分所述高温注射用水定容并搅拌至澄清后，除菌分装。
30.在一些可能的实施方式中，所述高温注射用水温度为60-80℃。
31.在一些可能的实施方式中，所述高温注射用水温度为60-70℃。
32.在一些可能的实施方式中，所述高温注射用水温度为70-80℃。
33.在一些可能的实施方式中，所述30-100.00g/l磷酸盐混合物包括10-100.00g/l磷酸氢二钠、10-100.00g/l磷酸二氢钾和10-100.00g/l氯化钠的至少一种。
34.在一些可能的实施方式中，所述第一部分所述高温注射用水为所述高温注射用水总量的90％。
35.在一些可能的实施方式中，所述第二部分所述高温注射用水为所述高温注射用水总量的10％。
36.本技术实施例还提供了一种蔗糖梯度离心溶液，采用如上所述的蔗糖密度梯度离心液的制备方法制得，本实施例制得的高密度蔗糖溶液包含以下组分：蔗糖(药用级)100～800.00g/l、磷酸氢二钠(药用级)10～100.00g/l、磷酸二氢钾(药用级)10～100.00g/l、氯化钠(药用级)10～100.00g/l、40-80℃高温注射用水200g～900.00g/l，在溶液分装阶段，所述高温注射用水温度会稍有下降，但仍可达37-65℃(详见下表2溶液分装温度)。
37.本技术实施例还提供了一种四价流感裂解病毒疫苗病毒纯化工艺，采用如上所述的蔗糖梯度离心溶液进行梯度离心。
38.本技术实施例还提供了一种四价流感裂解病毒疫苗制备工艺，采用如上所述的病毒纯化工艺对四价流感裂解病毒疫苗病毒进行纯化。
39.与现有技术的常温水溶剂配置蔗糖溶液的方案相比，本技术实施例具有以下优点：
40.能够确保高密度蔗糖溶液溶解完全，由于是溶液高温状态，除菌分装的时候，粘稠状态有很大的物理改善，除菌过滤速度加快，单根过滤器能够过滤的溶液体积量有多倍增加。
41.为了更进一步阐释本实施例为达成预定发明目的所采取的技术手段和效果，对本实施例蔗糖梯度离心溶液的制备方法的具体步骤，通过实例数据详细说明如下。
42.实施例1：
43.将高温注射用水加热至40℃后，先加入配方量90％的高温注射用水，再投料配方量的磷酸氢二钠(药用级)、磷酸二氢钾(药用级)、氯化钠(药用级)，至溶液澄清后再加入配方量的蔗糖(药用级)，最后补加10％的注射用水，完成配方量定容。快速搅拌，尽快完成蔗糖溶液配制，之后目测溶液澄清后除菌分装。
44.实施例2：
45.将高温注射用水加热至50℃后，先加入配方量90％的高温注射用水，再投料配方量的磷酸氢二钠(药用级)、磷酸二氢钾(药用级)、氯化钠(药用级)，至溶液澄清后再加入配方量的蔗糖(药用级)，最后补加10％的注射用水，完成配方量定容。快速搅拌，尽快完成蔗糖溶液配制，之后目测溶液澄清后除菌分装。
46.实施例3：
47.将高温注射用水加热至60℃后，先加入配方量90％的高温注射用水，再投料配方量的磷酸氢二钠(药用级)、磷酸二氢钾(药用级)、氯化钠(药用级)，至溶液澄清后再加入配方量的蔗糖(药用级)，最后补加10％的注射用水，完成配方量定容。快速搅拌，尽快完成蔗糖溶液配制，之后目测溶液澄清后除菌分装。
48.实施例4：
49.将高温注射用水加热至70℃后，先加入配方量90％的高温注射用水，再投料配方量的磷酸氢二钠(药用级)、磷酸二氢钾(药用级)、氯化钠(药用级)，至溶液澄清后再加入配方量的蔗糖(药用级)，最后补加10％的注射用水，完成配方量定容。快速搅拌，尽快完成蔗糖溶液配制，之后目测溶液澄清后除菌分装。
50.实施例5：
51.将高温注射用水加热至75℃后，先加入配方量90％的高温注射用水，再投料配方量的磷酸氢二钠(药用级)、磷酸二氢钾(药用级)、氯化钠(药用级)，至溶液澄清后再加入配方量的蔗糖(药用级)，最后补加10％的注射用水，完成配方量定容。快速搅拌，尽快完成蔗糖溶液配制，之后目测溶液澄清后除菌分装。
52.实施例6：
53.将高温注射用水加热至80℃后，先加入配方量90％的高温注射用水，再投料配方量的磷酸氢二钠(药用级)、磷酸二氢钾(药用级)、氯化钠(药用级)，至溶液澄清后再加入配方量的蔗糖(药用级)，最后补加10％的注射用水，完成配方量定容。快速搅拌，尽快完成蔗糖溶液配制，之后目测溶液澄清后除菌分装。
54.对照例1：
55.采用常温水溶剂，先制备好磷酸盐缓冲液，除菌过滤，溶液检验合格后再配制蔗糖溶液，水溶剂温度为22.4℃。
56.对照例2：
57.采用常温水溶剂，先制备好磷酸盐缓冲液，除菌过滤，溶液检验合格后再配制蔗糖溶液，水溶剂温度为21.8℃。
58.对照例3：
59.采用常温水溶剂，先制备好磷酸盐缓冲液，除菌过滤，溶液检验合格后再配制蔗糖溶液，水溶剂温度为22.6℃。
60.表1、蔗糖溶液水溶剂配制温度与溶解时间对照表
61.溶液批次配制量溶剂温度溶解时间配制方法r0414-2021005180l22.4℃120分钟对照例1r0414-2021015180l21.8℃115分钟对照例2r0414-2021030180l22.6℃124分钟对照例3r0414-2021033180l40.2℃110分钟实施例1r0414-2021034180l50.3℃100分钟实施例2r0414-2021036180l60.1℃95分钟实施例3r0414-2021040180l70.1℃70分钟实施例4r0414-2021062180l75.2℃65分钟实施例5r0414-2021063180l80.0℃60分钟实施例6
62.由上表1可见，配方量相同的蔗糖溶液，采用常温的水溶剂，溶解时间基本需要2个小时左右。而将水溶剂加热至40-80℃后，其溶解时间明显缩短，水溶剂温度基本与溶解时间成反比，最短只需要一个小时就能溶解完全。
63.表2、除菌过滤器使用数量对照表
64.溶液批次配制量溶液分装温度除菌过滤时间除菌过滤器配制方法r0414-2021005180l21.5℃120分钟2根对照例1r0414-2021015180l22.0℃120分钟2根对照例2r0414-2021030180l22.4℃130分钟2根对照例3r0414-2021033180l33.0℃110分钟2根实施例1r0414-2021034180l37.3℃107分钟2根实施例2r0414-2021036180l45.3℃105分钟2根实施例3r0414-2021040180l60.1℃75分钟1根实施例4r0414-2021062180l62.2℃55分钟1根实施例5r0414-2021063180l65.5℃50分钟1根实施例6
65.以每年生产四价流感病毒裂解病毒疫苗产能2000万剂计算，对应的高密度蔗糖溶液使用量约是36000l，对应的除菌过滤器消耗成本核算如下表3。
66.表3、除菌过滤器成本核算表
67.配制方法蔗糖溶液数量除菌过滤器使用数量成本核算500元/根对照例1-336000l360根180000元实施例4-636000l180根90000元
68.由上表2、3可以看出，以每年设计产能2000万剂的规模核算，实施例4-6可降低除菌过滤器使用数量180根、节约除菌过滤器成本90000元，降成本效果显著。
69.表4、蔗糖溶液质量检验对照表
[0070][0071]
由上表4可以看出，实施例1-6所制备的蔗糖溶液，理化、无菌检查、细菌内毒素各项质量检测指标均合格。
[0072]
表5、流感病毒液超速离心后目标产物血凝素含量、血凝素回收率对照表
[0073][0074][0075]
表6、流感病毒液超速离心后目标产物蛋白质含量、蛋白质去除率对照表
[0076]
批号体积蛋白质含量蛋白质去除率是否满足预定要求81-bv21x001632ml2.81mg/ml95.55％是81-bv21x002632ml2.92mg/ml94.66％是81-bv21x003632ml3.35mg/ml93.70％是81-bv21x004672ml3.35mg/ml94.60％是81-bv21x005624ml3.14mg/ml94.82％是81-bv21x006624ml3.16mg/ml95.37％是81-bv21x007640ml3.32mg/ml94.50％是81-bv21x008625ml3.18mg/ml93.82％是81-bv21x009626ml3.19mg/ml95.57％是
[0077]
表7、流感病毒液超速离心后目标产物卵清蛋白含量、卵清蛋白去除率对照表
[0078]
批号体积卵清蛋白含量卵清蛋白去除率是否满足预定要求81-bv21x001632ml401ng/ml99.99％是81-bv21x002632ml331ng/ml99.99％是81-bv21x003632ml577ng/ml99.99％是81-bv21x004672ml527ng/ml99.99％是81-bv21x005624ml300ng/ml99.99％是81-bv21x006624ml297ng/ml99.99％是81-bv21x007640ml530ng/ml99.99％是81-bv21x008625ml302ng/ml99.99％是81-bv21x009626ml295ng/ml99.99％是
[0079]
由上表5、6、7可以看出，实施例1-6所制备的高密度蔗糖溶液，流感病毒液超速离心后，目标产物的血凝素含量、血凝素回收率、蛋白质含量、蛋白质去除率、卵清蛋白含量、卵清蛋白去除率指标均合格。
[0080]
从以上试验结果可以看出，本技术实施例可在满足超速离心机梯度离心纯化使用的梯度液质量要求、流感病毒液超速离心后，目标产物的血凝素含量、血凝素回收率、蛋白质含量、蛋白质去除率、卵清蛋白含量、卵清蛋白去除率需要满足预定要求的前提下，显著改善高密度蔗糖溶液制备过程中溶解不完全、除菌过程中堵塞过滤器、单次过滤器使用量过大、过滤器成本高昂的问题。
[0081]
注意，上述仅为本技术的较佳实施例及所运用技术原理。本领域技术人员会理解，本技术不限于这里所述的特定实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本技术的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本技术进行了较为详细的说明，但是本技术不仅仅限于以上实施例，在不脱离本技术构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本技术的范围由所附的权利要求范围决定。