在重组宿主中生产甜菊醇糖苷的制作方法

在重组宿主中生产甜菊醇糖苷1.本技术是申请号为201580039715.0的中国专利申请的分案申请，原申请是2015年8月7日提交的pct国际申请pct/ep2015/068314于2017年2月10日进入中国国家阶段的申请。
技术领域：
：2.本公开内容一般地涉及通过重组宿主(例如重组微生物)的甜菊醇糖苷(steviolglycoside)例如莱鲍迪苷(rebaudioside)a(reba)，莱鲍迪苷b(rebb)，莱鲍迪苷d(rebd)和莱鲍迪苷m(rebm)的重组生产及其分离方法。特别地，本公开内容涉及对重组宿主中的转运系统的修饰，以使这些甜菊醇糖苷的生产和/或使这些甜菊醇糖苷向培养基中的转运增加。
背景技术：
：：3.甜味剂作为最常用于食品、饮料或糖果业的成分是公知的。甜味剂既可以在生产过程中加入最终食品，也可以在适当稀释的情况下作为佐餐甜味剂(tabletopsweeter)或者作为烘培中糖的家用替代品单独使用。甜味剂包括天然甜味剂(例如蔗糖、高果糖玉米糖浆、糖蜜、枫糖浆和蜂蜜)和人工甜味剂(例如阿斯巴甜、糖精和三氯半乳蔗糖(sucralose))。甜菊提取物(steviaextract)是可从多年生灌木甜菊(steviarebaudiana)中分离和提取的天然甜味剂。甜菊在南美洲和亚洲被普遍种植用于商业生产甜菊提取物。各种程度纯化的甜菊提取物在商业中用作食品中的高甜度甜味剂，以及在共混物中或单独地作为佐餐甜味剂。4.图1中显示了几种甜菊醇糖苷的化学结构，包括二萜甜菊醇和多种甜菊醇糖苷。甜菊植物的提取物通常包含有助于甜味的莱鲍迪苷和其他甜菊醇糖苷，尽管每种甜菊醇糖苷的量通常在不同的生产批次之间不同。5.由于从甜菊植物中回收和纯化甜菊醇糖苷已被证明是劳动密集型的和低效的，因此仍然需要可以高产率生产所需甜菊醇糖苷(如rebd和rebm)的重组生产系统。技术实现要素：6.与上述背景相反，本发明提供了优于现有技术的某些优点和进步。7.特别地，本发明提供了能够合成甜菊醇糖苷的重组宿主，其包含编码转运蛋白(transporter)多肽的基因和/或编码调节至少一种转运蛋白基因表达的转录因子多肽的基因；其中编码所述转运蛋白多肽的基因和/或编码所述调节至少一种转运蛋白基因表达的转录因子多肽的基因之表达被修饰，并且所述重组宿主将至少一部分所述合成的甜菊醇糖苷从所述宿主转运到培养基中。8.在本文公开的重组宿主的一些方面中，所述编码转运蛋白多肽的基因是内源基因。9.在本文公开的重组宿主的一些方面中，所述转运蛋白多肽包括atp结合盒(atp-bindingcassette，abc)转运蛋白、主要促进子超家族(majorfacilitatorsuperfamily，mfs)转运蛋白、氨基酸/生长素通透酶(aminoacid/auxinpermease，aaap)家族转运蛋白、atp酶转运蛋白、硫酸盐通透酶(sulfatepermease，sulp)家族转运蛋白、溶酶体胱氨酸转运蛋白(lysosomalcystinetransporter，lct)家族转运蛋白、ca2+：阳离子反向转运蛋白(ca2+：cationantiporter，caca)家族转运蛋白、氨基酸-多胺-有机阳离子(aminoacid-polyamine-organocation，apc)超家族转运蛋白、多药/寡糖基脂质/多糖(multidrug/oligosaccharidyl-lipid/polysaccharide，mop)转运蛋白、zrt/irt样蛋白(zrt/irt-likeprotein，zip)金属转运蛋白家族转运蛋白、线粒体蛋白移位酶(mitochondrialproteintranslocase，mpt)家族转运蛋白、电压门控离子通道(voltage-gatedionchannel，vic)家族转运蛋白、单价阳离子：质子反向转运蛋白-2(cation：protonantiporter-2，cpa2)家族转运蛋白、推定的跨膜氨基酸外排转运蛋白thre家族、寡肽转运蛋白(oligopeptidetransporter，opt)家族转运蛋白、k+转运蛋白(k+transporter，trk)家族转运蛋白、胆汁酸：na同向转运体(bileacid：nasymporter，bass)家族转运蛋白、药物/代谢物转运蛋白(drug/metabolitetransporter，dmt)超家族转运蛋白、线粒体运载体(mitochondrialcarrier，mc)家族转运蛋白、生长素外排运载体(auxineffluxcarrier，aec)家族转运蛋白、氨通道转运蛋白(ammoniachanneltransporter，amt)家族转运蛋白、金属离子(mn2+-铁)转运蛋白(metalion(mn2+-iron)transporter，nramp)家族转运蛋白、瞬时受体电位ca2+通道(transientreceptorpotentialca2+channel，trp-cc)家族转运蛋白、耐砷-3(arsenicalresistance-3，acr3)家族转运蛋白、核碱基：阳离子同向转运体-1(nucleobase：cationsymporter-1，ncs1)家族转运蛋白、无机磷酸转运蛋白(inorganicphosphatetransporter，pit)家族转运蛋白、亚砷酸-亚锑酸盐(arsenite-antimonite，arsab)外排家族转运蛋白、转运蛋白iisp家族、甘油摄取(glyceroluptake，gup)家族转运蛋白、金属离子转运(metaliontransport，mit)家族转运蛋白、铜转运(coppertransport，ctr)家族转运蛋白或阳离子扩散促进子(cationdiffusionfacilitator，cdf)家族转运蛋白。10.在本文公开的重组宿主的一些方面中，修饰的表达包括：11.(a)过表达所述编码转运蛋白多肽的基因和/或所述编码转录因子多肽的基因；或12.(b)缺失所述编码转运蛋白多肽的基因和/或所述编码转录因子多肽的基因。13.在本文公开的重组宿主的一些方面中，所述编码转运蛋白多肽的基因和/或所述编码转录因子多肽的基因具有提高的活性。14.在本文公开的重组宿主的一些方面中，所述编码转运蛋白多肽基因中的一个或更多个和/或所述编码转录因子多肽的基因中的一个或更多个过表达。15.在本文公开的重组宿主的一些方面中，所述转运蛋白多肽和/或转录多肽包含：seqidno：14中所示的yal067c，seqidno：15中所示的ybl089w，seqidno：16中所示的ybl099w，seqidno：86中所示的ybr008c，seqidno：87中所示的ybr021w，seqidno：88中所示的ybr043c，seqidno：13中所示的ybr180w，seqidno：17中所示的ybr241c，seqidno：89中所示的ybr287w，seqidno：18中所示的ybr294w，seqidno：90中所示的ybr295w，seqidno：91中所示的ybr296c，seqidno：92中所示的ycl038c，seqidno：19中所示的ycl069w，seqidno：93中所示的ycr011c，seqidno：20中所示的ycr028c，seqidno：21中所示的ycr075c，seqidno：94中所示的ydl054c，seqidno：95中所示的ydl100c，seqidno：22中所示的ydl128w，seqidno：23中所示的ydl185w，seqidno：24中所示的ydl194w，seqidno：25中所示的ydl210w，seqidno：96中所示的ydl245c，seqidno：97中所示的ydl247w，seqidno：98中所示的ydr011w，seqidno：26中所示的ydr061w，seqidno：27中所示的ydr093w，seqidno：99中所示的ydr292c，seqidno：28中所示的ydr338c，seqidno：29中所示的ydr406w，seqidno：100中所示的ydr497c，seqidno：30中所示的ydr536w，seqidno：101中所示的yel006w，seqidno：102中所示的yel027w，seqidno：31中所示的yel031w，seqidno：103中所示的yel065w，seqidno：104中所示的yer019c-a，seqidno：105中所示的yer053c，seqidno：106中所示的yer119c，seqidno：32中所示的yer166w，seqidno：33中所示的yfl011w，seqidno：107中所示的yfl028c，seqidno：108中所示的yfr045w，seqidno：34中所示的ygl006w，seqidno：35中所示的ygl013c，seqidno：109中所示的ygl084c，seqidno：110中所示的ygl104c，seqidno：111中所示的ygl114w，seqidno：112中所示的ygl167c，seqidno：36中所示的ygl255w，seqidno：37中所示的ygr125w，seqidno：38中所示的ygr181w，seqidno：39中所示的ygr217w，seqidno：40中所示的ygr224w，seqidno：113中所示的ygr257c，seqidno：41中所示的ygr281w，seqidno：42中所示的yhl016c，seqidno：114中所示的yhl035c，seqidno：115中所示的yhl036w，seqidno：116中所示的yhr002w，seqidno：117中所示的yhr096c，seqidno：118中所示的yil006w，seqidno：43中所示的yil088c，seqidno：119中所示的yil120w，seqidno：120中所示的yil121w，seqidno：121中所示的yil166c，seqidno：44中所示的yjl093c，seqidno：45中所示的yjl094c，seqidno：46中所示的yjl108c，seqidno：122中所示的yjl133w，seqidno：47中所示的yjl212c，seqidno：123中所示的yjl219w，seqidno：48中所示的yjr106w，seqidno：49中所示的yjr160c，seqidno：124中所示的ykl016c，seqidno：125中所示的ykl050c，seqidno：50中所示的ykl064w，seqidno：126中所示的ykl120w，seqidno：127中所示的ykl146w，seqidno：128中所示的ykl209c，seqidno：129中所示的ykr039w，seqidno：51中所示的ykr050w，seqidno：52中所示的ykr105c，seqidno：53中所示的ykr106w，seqidno：130中所示的ylr411w，seqidno：54中所示的ylr447c，seqidno：131中所示的yml038c，seqidno：55中所示的yml116w，seqidno：56中所示的ymr034c，seqidno：57中所示的ymr056c，seqidno：132中所示的ymr166c，seqidno：58中所示的ymr253c，seqidno：133中所示的ymr279c，seqidno：134中所示的ynl003c，seqidno：59中所示的ynl065w，seqidno：60中所示的ynl070w，seqidno：61中所示的ynl083w，seqidno：62中所示的ynl095c，seqidno：63中所示的ynl121c，seqidno：64中所示的ynl142w，seqidno：135中所示的ynl268w，seqidno：136中所示的ynr055c，seqidno：65中所示的yol020w，seqidno：66中所示的yol075c，seqidno：67中所示的yol077w-a，seqidno：68中所示的yol122c，seqidno：137中所示的yol158c，seqidno：69中所示的yor079c，seqidno：70中所示的yor087w，seqidno：71中所示的yor092w，seqidno：138中所示的yor100c，seqidno：72中所示的yor130c，seqidno：139中所示的yor153w，seqidno：73中所示的yor222w，seqidno：140中所示的yor271c，seqidno：141中所示的yor273c，seqidno：74中所示的yor291w，seqidno：75中所示的yor306c，seqidno：142中所示的yor307c，seqidno：76中所示的yor316c，seqidno：143中所示的yor332w，seqidno：77中所示的yor334w，seqidno：144中所示的yor348c，seqidno：145中所示的ypl036w，seqidno：78中所示的ypl078c，seqidno：79中所示的ypl270w，seqidno：80中所示的ypl274w，seqidno：81中所示的ypr003c，seqidno：82中所示的ypr011c，seqidno：83中所示的ypr058w，seqidno：84中所示的ypr128c，或seqidno：85中所示的ypr201w。16.在本文公开的重组宿主的一些方面中，以下序列得到过表达：seqidno：88中所示的ybr043c，seqidno：95中所示的ydl100c，seqidno：94中所示的ydl054c，seqidno：22中所示的ydl128w，seqidno：146中所示的ydl198c，seqidno：26中所示的ydr061w，seqidno：30中所示的ydr536w，seqidno：102中所示的yel027w，seqidno：147中所示的yfl054c，seqidno：112中所示的ygl167c，seqidno：38中所示的ygr181w，seqidno：42中所示的yhl016c，seqidno：121中所示的yil166c，seqidno：44中所示的yjl093c，seqidno：48中所示的yjr106w，seqidno：126中所示的ykl120w，seqidno：127中所示的ykl146w，seqidno：129中所示的ykr039w，seqidno：56中所示的ymr034c，seqidno：132中所示的ymr166c，seqidno：68中所示的yol122c，seqidno：69中所示的yor079c，seqidno：79中所示的ypl270w，和/或seqidno：82中所示的ypr011c。17.在一些方面中，所述重组宿主还包含：18.(a)编码蔗糖转运蛋白和蔗糖合酶的一种或更多种基因；19.(b)编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(geranylgeranyldiphosphatesynthase，ggpps)多肽的基因；20.(c)编码e型-柯巴基二磷酸合酶(ent-copalyldiphosphatesynthase，cdps)多肽的基因；21.(d)编码贝壳杉烯合酶(kaurenesynthase，ks)多肽的基因；22.(e)编码贝壳杉烯氧化酶(kaureneoxidase，ko)多肽的基因；23.(f)编码甜菊醇合酶(steviolsynthase，kah)多肽的基因；24.(g)编码细胞色素p450还原酶(cytochromep450reductase，cpr)多肽的基因；25.(h)编码ugt85c2多肽的基因；26.(i)编码ugt76g1多肽的基因；27.(k)编码ugt91d2功能同源物的基因；和/或28.(1)编码eugt11多肽的基因；29.其中所述基因的至少一个是重组基因；并且30.其中所述宿主能够生产reba、rebb、rebd和/或rebm中的一种或更多种。31.在本文公开的重组宿主的一些方面中，所述基因中的至少一个被密码子优化以用于在宿主中表达。32.在本文公开的重组宿主的一些方面中，所述基因中的至少一个被密码子优化以用于在酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)中表达。33.在本文公开的重组宿主的一些方面中，34.(a)所述ggpps多肽包含与seqidno：149中所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；35.(b)所述cdps多肽包含与seqidno：150中所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；36.(c)所述ko多肽包含与seqidno：152中所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；37.(d)所述ks多肽包含与seqidno：151中所示的氨基酸序列具有至少40％同一性的多肽；38.(e)所述kah多肽包含与seqidno：154中所示的氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽；39.(f)所述cpr多肽包含与seqidno：153中所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽和/或与seqidno：155中所示的氨基酸序列具有至少65％同一性的多肽；40.(g)所述ugt85c2多肽包含与seqidno：156中所示的氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽；41.(h)所述ugt76g1多肽包含与seqidno：158中所示的氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽；42.(i)所述ugt74g1多肽包含与seqidno：157中所示的氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽；43.(j)所述ugt91d2功能同源物包含与seqidno：159中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的ugt91d2e-b多肽；和44.(k)所述eugt11多肽包含与seqidno：148中所示的氨基酸序列具有至少65％同一性的多肽。45.在一些方面中，本文公开的所述重组宿主包含以下微生物：植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞或细菌细胞。46.在一些方面中，所述细菌细胞包含埃希氏菌属(escherichia)细菌细胞，乳杆菌属(lactobacillus)细菌细胞，乳球菌属(lactococcus)细菌细胞，棒状杆菌属(cornebacterium)细菌细胞，醋杆菌属(acetobacter)细菌细胞，不动杆菌属(acinetobacter)细菌细胞或假单胞菌属(pseudomonas)细菌细胞。47.在一些方面中，所述真菌细胞是酵母细胞。48.在一些方面中，所述酵母细胞是来自酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)、光滑念珠菌(candidaglabrata)、棉阿舒囊霉(ashbyagossypii)、产朊假丝酵母(cyberlindnerajadinii)、巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)、多形汉逊酵母(hansenulapolymorpha)、博伊丁念珠菌(candidaboidinii)、arxulaadeninivorans、红发夫酵母(xanthophyllomycesdendrorhous)或白色念珠菌(candidaalbicans)物种的细胞。49.在一些方面中，所述酵母细胞是酵母菌(saccharomycete)。50.在一些方面中，所述酵母细胞是来自酿酒酵母物种的细胞。51.本发明还提供了生产甜菊醇糖苷的方法，其包括：52.(a)在表达本文所公开的重组宿主所包含的基因的条件下，在培养基中培养本文所公开的重组宿主，53.其中所述甜菊醇糖苷由所述宿主合成；以及54.(b)任选地分离所述甜菊醇糖苷。55.在本文公开的所述方法的一些方面中，所述甜菊醇糖苷是reba、rebb、rebd和/或rebm，并且其中：56.(a)reba能够在表达ugt85c2、ugt76g1、ugt74g1和ugt91d2的本文所公开的重组宿主中合成；57.(b)rebb能够在表达ugt85c2、ugt76g1和ugt91d2的本文所公开的重组宿主中合成；58.(c)rebd能够在表达ugt85c2、ugt76g1、ugt74g1以及ugt91d2和/或eugt11的本文所公开的重组宿主中合成；和59.(d)rebm能够在表达ugt85c2、ugt76g1、ugt74g1和ugt91d2和/或eugt11的本文所公开的重组宿主中合成。60.在本文公开的所述方法的一些方面中，编码以下序列的基因过表达：seqidno：88中所示的ybr043c，seqidno：95中所示的ydl100c，seqidno：94中所示的ydl054c，seqidno：22中所示的ydl128w，seqidno：146中所示的ydl198c，seqidno：26中所示的ydr061w，seqidno：30中所示的ydr536w，seqidno：102中所示的yel027w，seqidno：147中所示的yfl054c，seqidno：112中所示的ygl167c，seqidno：38中所示的ygr181w，seqidno：42中所示的yhl016c，seqidno：121中所示的yil166c，seqidno：44中所示的yjl093c，seqidno：48中所示的yjr106w，seqidno：126中所示的ykl120w，seqidno：127中所示的ykl146w，seqidno：129中所示的ykr039w，seqidno：56中所示的ymr034c，seqidno：132中所示的ymr166c，seqidno：68中所示的yol122c，seqidno：69中所示的yor079c，seqidno：79中所示的ypl270w，和/或seqidno：82中所示的ypr011c。61.在本文公开的所述方法的一些方面中，所述甜菊醇糖苷以约500mg/l至约10,000mg/l的浓度生产。62.本发明还提供了使甜菊醇糖苷的生产或向培养基中的转运增加的方法，其包括：63.(a)在表达本文所公开的宿主所包含的基因的条件下，在培养基中培养本文所公开的重组宿主，64.其中所述甜菊醇糖苷由所述宿主合成；以及65.(b)任选地分离所述甜菊醇糖苷。66.在本文公开的所述方法的一些方面中，所述甜菊醇糖苷是reba、rebb、rebd和/或rebm。67.本发明还提供了增加重组宿主中甜菊醇或甜菊醇糖苷生产的方法，其包括修饰以下基因的表达：编码转运蛋白多肽的基因和/或编码调节至少一种转运蛋白基因表达的转录的基因，其中所述宿主能够将所生产的至少一部分甜菊醇或甜菊醇糖苷从所述宿主转运到培养基中。68.从下面结合所附权利要求的本发明的详细描述中，将更全面地理解本发明的这些和其他特征和优点。注意，权利要求的范围由其中的陈述来限定，而不是由本说明书中阐述的特征和优点的具体讨论来限定。附图说明69.图1示出了多种甜菊醇糖苷的化学结构和合成途径。70.图2是与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，过表达转运蛋白基因ygr181w(seqidno：38)或ydr061w(seqidno：26)的甜菊醇糖苷生产菌株上清液中reba、rebb、rebd或rebm的量的柱状图。参见实施例4。71.图3a和图3b是与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，ygr181w(seqidno：38)或ydr061w(seqidno：26)过表达菌株的上清液(图3a)或总培养物(图3b)中reba、rebd或rebm的量(mg/l)的柱状图。参见实施例4。72.在基因组上整合转运蛋白基因的产甜菊醇糖苷的酿酒酵母(s.cerevisiae)菌株中，13-smg的水平在图4a示出(总水平和上清液水平；μm/od600)，reba的水平在图4b示出(总水平和上清液水平；μm/od600)，rebb的水平在图4c示出(总水平和上清液水平；μm/od600)，rebd的水平在图4d示出(总水平和上清液水平；μm/od600)，且rebm的水平图4e示出(总水平和上清液水平；μm/od600)。图4a-4e的基因组上整合的转运蛋白基因是ybr043c(seqidno：88)、yel027w(seqidno：102)、yjl093c(seqidno：44)、yjr106w(seqidno：48)、ymr166c(seqidno：132)、yil166c(seqidno：121)、ykl120w(seqidno：126)、ydl054c(seqidno：94)、ydl128w(seqidno：22)、ydr536w(seqidno：30)、ygl167c(seqidno：112)、ykl146w(seqidno：127)、ykr039w(seqidno：129)、yol122c(seqidno：68)和ypr011c(seqidno：82)。参见实施例6。73.图5a示出了通过user克隆系统过表达以下序列的甜菊醇糖苷生产菌株的reba、rebb、rebd和rebm(以μm/od600计)的上清液水平：ymr166c(seqidno：132)、yel027w(seqidno：102)、ykl120w(seqidno：126)、yil166c(seqidno：121)、yjr106w(seqidno：48)、yjl093c(seqidno：44)和ybr043c(seqidno：88)。图5b示出了通过user克隆系统过表达以下序列的甜菊醇糖苷生产菌株的reba、rebb、rebd和rebm(以μm/od600计)的总水平：ymr166c(seqidno：132)、yel027w(seqidno：102)、ykl120w(seqidno：126)、yil166c(seqidno：121)、yjr106w(seqidno：48)、yjl093c(seqidno：44)和ybr043c(seqidno：88)。具体实施方式74.出于所有目的，本文中引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用以其整体明确地并入本文。75.在详细描述本发明之前，将定义若干术语。除非上下文明确的另有指示，本文使用的未用量词限定的名词包括复数指示物。例如，提到“核酸”意指一个/种或更多个/种核酸。76.应注意，术语如“优选”、“一般”和“通常”在本文中并不是用于限制要求保护的发明的范围，或暗示某些特征对于要求保护的发明的结构或功能是关键的、必要的或甚至是重要的。相反，这些术语仅旨在突出可被用在或不被用在本发明的特定实施方案中的替选的或额外的特征。77.为了描述和限定本发明的目的，应注意术语“基本上”在本文中用于表示可归因于任何定量比较、值、测量或其他表述的固有的不确定程度。术语“基本上”在本文中也用于表示在不导致所讨论主题的基本功能改变的情况下，定量表达可不同于所述参考的程度。78.可使用本领域技术人员公知的方法来构建根据本发明的遗传表达构建体和重组细胞。这些方法包括体外重组dna技术、合成技术、体内重组技术和聚合酶链式反应(pcr)技术。参见，例如描述于如下文献中的技术：green&sambrook，2012，molecularcloning：alaboratorymanual，第四版，coldspringharborlaboratory，newyork；ausubel等，1989，currentprotocolsinmolecularbiology，greenepublishingassociatesandwileyinterscience，newyork，和pcrprotocols：aguidetomethodsandapplications(innis等，1990，academicpress，sandiego，ca)。79.本文中使用的术语“多核苷酸”、“核苷酸”“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用，是指包括dna、rna、其衍生物或其组合的核酸。80.如本文所用，术语“微生物”、“微生物宿主”、“微生物宿主细胞”、“宿主细胞”、“重组宿主”、“重组微生物宿主”和“重组宿主细胞”可以互换使用。如本文所用，术语“重组宿主”意指这样的宿主，其基因组已经增强(augment)至少一个dna序列。这样的dna序列包括但不限于非天然存在的基因、通常不转录成rna或翻译成蛋白质(“表达的”)的dna序列和期望引入非重组宿主中的其他基因或dna序列。应当理解，通常通过稳定引入一个或更多个重组基因来增强本文所述的重组宿主的基因组。一般而言，引入的dna最初不是作为dna接受者的宿主中所固有的，而是在本公开内容的范围内从给定宿主中分离dna片段，并随后将该dna的一个或更多个另外的拷贝引入同一宿主中，例如用来提高基因产物的产量或改变基因的表达模式。在一些情况下，引入的dna将通过例如同源重组或定点诱变来修饰或甚至替代内源基因或dna序列。合适的重组宿主包括微生物。81.如本文所使用的，术语“重组基因”是指引入接受者宿主的基因或dna序列，不管相同或相似的基因或dna序列是否可能已经存在于这样的宿主中。在本上下文中，“引入”或“增加”在本领域中已知是指人工(bythehandofman)引入或增加。因此，重组基因可以是来自另一物种的dna序列，或者可以是源自或存在于相同物种但已通过重组方法并入宿主以形成重组宿主的dna序列。应当理解，引入宿主的重组基因可以与正常存在于被转化宿主中的dna序列相同，并且被引入以提供所述dna的一个或更多个另外的拷贝，从而允许该dna基因产物的过表达或经修饰表达。所述重组基因特别地由cdna编码。82.如本文所用，术语“改造的生物合成途径”是指在如本文所述的重组宿主中发生并且不天然发生于宿主中的生物合成途径。83.如本文所用，术语“内源”基因是指源自特定生物体、组织或细胞并在其中产生或合成的基因。在一些实施方案中，内源基因是酵母转运蛋白。在一些实施方案中，转运蛋白对酿酒酵母，包括但不限于酿酒酵母菌株s288c是内源的。在一些实施方案中，内源酵母转运蛋白基因过表达。如本文所用，术语“过表达”用于指生物体中基因以高于野生型生物体中基因表达水平的水平表达。参见例如prelich，2012，genetics190：841-54。在一些实施方案中，使内源酵母转运蛋白基因缺失。参见例如，giaever&nislow，2014，genetics197(2)：451-65。如本文所用，术语“缺失”、“缺失的”，“敲除”和“敲除的”可互换使用，指已被操作变得不再在生物体中表达的内源基因，所述生物体包括但不限于酿酒酵母。在一些实施方案中，缺失/敲除的基因是转运蛋白基因或调节转运蛋白基因表达的转录因子基因。84.如本文所用，术语“异源序列”和“异源编码序列”用于描述来自除重组宿主.之外的物种的序列。在一些实施方案中，重组宿主是酿酒酵母细胞，异源序列来自酿酒酵母以外的生物体。异源编码序列例如可以来自原核微生物、真核微生物、植物、动物、昆虫或不同于表达异源序列的重组宿主的真菌。在一些实施方案中，编码序列对宿主是天然的序列。[0085]“可选择标志物”可以是补充宿主细胞营养缺陷型、提供抗生素抗性或导致颜色改变的任何数量的基因之一。然后使用本领域公知的方法(参见下文)将基因置换载体的线性化dna片段引入细胞。可以基于选择标志物来确定线性片段整合到基因组中和基因的破坏，并且可以通过例如pcr或southern印迹分析来验证。在将其用于选择之后，可以通过例如cre-loxp系统从宿主细胞的基因组中除去可选择性标志物(参见例如gossen等，2002，ann.rev.genetics36：153-173和u.s.2006/0014264)。或者，可以以包括待破坏的基因之一部分的方式构建基因置换载体，其中所述部分缺乏任何内源基因启动子序列并且不编码所述基因的编码序列，或编码所述基因的无活性片段。[0086]如本文所用的术语“变体”和“突变体”用于描述与特定蛋白质的野生型序列相比在一个或更多个氨基酸处已经被修饰的蛋白质序列。[0087]如本文所用的术语“无活性片段”是编码活性小于例如从基因的全长编码序列所产生之蛋白质的约10％(例如小于约9％，小于约8％，小于约7％，小于约6％，小于约5％，小于约4％，小于约3％，小于约2％，小于约1％，或0％)的蛋白质的基因片段。这样的基因部分以这样的方式插入载体中，使得没有已知的启动子序列有效地连接到基因序列，但是终止密码子和转录终止序列有效地连接至基因序列的所述部分。该载体随后可以在基因序列的所述部分中线性化并转化到细胞中。然后通过单一同源重组，将该线性化载体整合到基因的内源对应物中，使其失活。[0088]如本文所用的术语“甜菊醇糖苷”指莱鲍迪苷a(reba)(cas#58543-16-1)、莱鲍迪苷b(rebb)(cas#58543-17-2)、莱鲍迪苷c(rebc)(cas#63550-99-2)、莱鲍迪苷d(rebd)(cas#63279-13-0)、莱鲍迪苷e(rebe)(cas#63279-14-1)、莱鲍迪苷f(rebf)(cas#438045-89-7)、莱鲍迪苷m(rebm)(cas#1220616-44-3)、甜茶苷(rubusoside)(cas#63849-39-4)、杜尔可苷(dulcoside)a(cas#64432-06-0)、莱鲍迪苷i(rebi)(massbank记录号：fu000332)、莱鲍迪苷q(rebq)、1，2-甜菊苷(stevioside)(cas#57817-89-7)、1，3-甜菊苷(rebg)、1，2-二糖苷(massbank记录号：fu000299)、1，3-二糖苷、甜菊醇-13-o-葡糖苷(13-smg)、甜菊醇-19-o-葡糖苷(19-smg)、三-葡糖基化甜菊醇糖苷、四-糖基化甜菊醇糖苷、五-葡糖基化甜菊醇糖苷、六-葡糖基化甜菊醇糖苷、七-葡糖基化甜菊醇糖苷、二-葡糖基化异贝壳杉烯酸(di-glucosylatedkaurenoicacid)、三-葡糖基化异贝壳杉烯酸、二-糖基化异贝壳杉烯醇(di-glucosylatedkaurenol)、三-葡糖基化异贝壳杉烯醇，及其异构体。[0089]重组甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株描述于wo2011/153378，wo2013/022989，wo2014/122227和wo2014/122328，其各自通过引用整体并入本文。也参见实施例2。在重组宿主中，通过全细胞生物转化并且体外生产甜菊醇糖苷的方法也描述于wo2011/153378，wo2013/022989，wo2014/122227和wo2014/122328中。[0090]在一些实施方案中，通过在重组宿主中参与甜菊醇糖苷生物合成途径的一种或更多种酶的表达，在体内生产甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体。例如，表达一种或更多种以下基因的甜菊醇生产重组宿主可以在体内产生甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体：编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(ggpps)多肽的基因，编码内部-柯巴基二磷酸合酶(cdps)多肽的基因，编码贝壳杉烯合酶(ks)多肽的基因，编码贝壳杉烯氧化酶多肽(ko)的基因，编码甜菊醇合酶(kah)多肽的基因，编码细胞色素p450还原酶(cpr)多肽的基因，和编码ugt多肽的基因。参见实施例2。[0091]在一些实施方案中，重组宿主包含编码ugt85c2多肽的核酸，编码ugt76g1多肽的核酸，编码ugt74g1多肽的核酸，编码ugt91d2多肽的核酸，和/或编码eugt11多肽的核酸。技术人员将理解，这些基因的表达可能是产生特定甜菊醇糖苷所必需的，但是这些基因中的一个或更多个可以是宿主内源的，条件是这些基因中的至少一个(在一些实施方案中，全部)是引入所述微生物的重组基因。在一个具体实施方案中，生产甜菊醇的重组微生物包含编码ugt85c2、ugt76g1或ugt91d2多肽的外源核酸。在另一个具体实施方案中，生产甜菊醇的重组微生物包含编码ugt85c2、ugt76g1、ugt74g1和ugt91d2多肽的外源核酸。在另一个具体实施方案中，生产甜菊醇的重组微生物包含编码ugt85c2、ugt76g1、ugt74g1和eugt11多肽的外源核酸。在另一个具体实施方案中，生产甜菊醇的重组微生物包含编码ugt85c2、ugt76g1、ugt74g1、ugt91d2(尤其包括91d2e、91d2m、91d2e-b及其功能同源物)和eugt11多肽的外源核酸。参见实施例2。[0092]在某些实施方案中，甜菊醇糖苷是reba、rebb、rebd和/或rebm。reba可以在表达ugt85c2、ugt76g1、ugt74g1和ugt91d2的生产甜菊醇的重组微生物中合成。rebb可以在表达ugt85c2、ugt76g1和ugt91d2的生产甜菊醇的重组微生物中合成。rebd可以在表达ugt85c2、ugt76g1、ugt74g1以及ugt91d2和/或eugt11的生产甜菊醇的重组微生物中合成。rebm可以在表达ugt85c2、ugt76g1、ugt74g1以及ugt91d2和/或eugt11的生产甜菊醇的重组微生物中合成(参见图1，实施例2)。[0093]在一些实施方案中，通过使甜菊醇糖苷前体与参与甜菊醇糖苷途径的一种或更多种酶在体外接触而生产甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体。例如，使甜菊醇与ugt多肽接触可以导致体外生产甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，通过使上游甜菊醇糖苷前体与参与甜菊醇糖苷途径的一种或更多种酶体外接触生产甜菊醇糖苷前体。例如，使e型-异贝壳杉烯酸(ent-kaurenoicacid)与kah酶接触可以导致体外生产甜菊醇。[0094]在一些实施方案中，通过全细胞生物转化生产甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体。为了发生全细胞生物转化，使表达参与甜菊醇糖苷途径的一种或更多种酶的宿主细胞摄取并修饰细胞中的甜菊醇糖苷前体；在体内修饰后，甜菊醇糖苷保留在细胞中和/或分泌到培养基中。例如，表达编码ugt多肽之基因的宿主细胞可以摄取甜菊醇并在细胞中糖基化甜菊醇；在体内糖基化后，甜菊醇糖苷可以分泌到培养基中。在一些实施方案中，使细胞透化以摄取待修饰的底物或分泌经修饰的产物。[0095]在一些实施方案中，在体内、体外或通过全细胞生物转化生产的甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体组合物包含比特别是来自甜叶菊植物的甜叶菊提取物更少的污染物。污染物包括有助于异味的植物来源的化合物。潜在污染物包括颜料、脂质、蛋白质、酚类、糖类、脂肪醇和其他倍半萜、劳丹烷二萜(labdanediterpene)、单萜、癸酸、8，11，14-二十碳三烯酸、2-甲基十八烷、二十五烷、二十八烷、二十四烷、十八烷醇、豆固醇、β谷固醇、α-和β-香树素(amyrin)、羽扇豆醇、β香树素乙酸酯、五环三萜类、centauredin、槲皮素(quercitin)、表-α-杜松醇(epi-alpha-cadinol)、丁香烯(carophyllene)和衍生物、β-蒎烯、β-谷固醇和赤霉素。[0096]如本文所用，术语“可检测的量”、“可检测浓度”、“可测量的量”和“可测量的浓度”是指以auc、μm/od600、mg/l、μm或mm测量的甜菊醇糖苷水平。可以通过本领域技术人员通常可获得的技术检测和/或分析甜菊醇糖苷产量(即总的、上清液和/或细胞内甜菊醇糖苷水平)，例如但不限于：液相色谱-质谱法(liquidchromatography-massspectrometry，lc-ms)、薄层色谱法(thinlayerchromatography，tlc)、高效液相色谱法(high-performanceliquidchromatography，hplc)、紫外-可见光谱/分光光度法(ultraviolet-visiblespectroscopy/spectrophotometry，uv-vis)、质谱法(massspectrometry，ms)和核磁共振光谱法(nuclearmagneticresonancespectroscopy，nmr)。[0097]如本文所使用的，术语“或”和“和/或”用于描述多种成分的组合或彼此排除。例如，“x、y和/或z”可以单独指“x”，单独指“y”，单独指“z”，“x、y和z”，“(x和y)或z”，“x或(y和z)”或“x或y或z”。在一些实施方案中，“和/或”用于指重组细胞包含的外源核酸，其中重组细胞包含选自一组的一种或更多种外源核酸。在一些实施方案中，“和/或”用于指甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体的生产。在一些实施方案中，“和/或”用于指甜菊醇糖苷的生产，其中生产一种或更多种甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，“和/或”用于指甜菊醇糖苷的生产，其中通过以下步骤中的一个或更多个生产一种或更多种甜菊醇糖苷：培养重组微生物，在重组微生物中合成一种或更多种甜菊醇糖苷，和/或分离一种或更多种甜菊醇糖苷。[0098]转运蛋白和转录因子表达[0099]本文描述了可用于有效生产甜菊醇糖苷组合物的试剂和方法。在重组宿主中修饰参与将甜菊醇糖苷转运到培养基中的转运系统可以允许在重组宿主中更有效地生产甜菊醇糖苷。[0100]如本文所述，对细胞转运具有修饰的重组细胞能够生产甜菊醇。本文描述的重组宿主可以生产甜菊醇并且已经改变至少一种内源转运蛋白基因的表达。本文所述的重组宿主可以生产甜菊醇并且已经改变转录因子的表达，所述转录因子调节至少一种内源性转运蛋白基因表达。改变内源转运蛋白基因的表达可用于增加甜菊醇的生产和/或甜菊醇分泌到培养基中。[0101]如本文所述，对细胞转运具有修饰的重组细胞能够生产至少一种甜菊醇糖苷，其包括但不限于reba、rebb、rebd和/或rebm。本文所述的重组宿主可以生产至少一种甜菊醇糖苷，例如reba、rebb、rebd和/或rebm，并且已经改变至少一种内源转运蛋白基因的表达。本文所述的重组宿主可以生产至少一种甜菊醇糖苷，例如reba、rebb、rebd和/或rebm，并且已经改变转录因子的表达，所述转录因子调节至少一种内源转运蛋白基因表达。本文所述的重组宿主可以生产至少一种甜菊醇糖苷，例如reba、rebb、rebd和/或rebm，并且已经改变多个内源转运蛋白基因和/或调节多个内源转运蛋白基因之表达的多个转录因子基因的表达。改变内源转运蛋白基因和/或调节至少一种转运蛋白基因表达的转录因子之表达可用于增加甜菊醇糖苷的生产和/或甜菊醇糖苷分泌到培养基中。[0102]本文公开的重组宿主可以包括一个或更多个生物合成基因，例如：编码蔗糖转运蛋白和蔗糖合酶的一种或更多种基因；编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(ggpps)多肽的基因；编码内部-柯巴基二磷酸合酶(cdps)多肽的基因；编码贝壳杉烯合酶(ks)多肽的基因；编码贝壳杉烯氧化酶(ko)多肽的基因；编码甜菊醇合酶(kah)多肽的基因；编码细胞色素p450还原酶(cpr)多肽的基因；编码ugt85c2多肽的基因；编码ugt76g1多肽的基因；编码ugt74g1多肽的基因；编码ugt91d2功能同源物的基因；和/或编码eugt11多肽的基因；其中这些基因中的一个或更多个的表达导致生产甜菊醇糖苷，例如reba、rebb、rebd和/或rebm。[0103]如本文所使用的术语“甜菊醇糖苷的转运”、“甜菊醇糖苷转运”、“甜菊醇糖苷的分泌”和“甜菊醇糖苷分泌”可以互换使用。[0104]如本文所用，术语“转运蛋白”(也称为膜转运蛋白)是指参与小分子、大分子(例如碳水化合物)和离子穿过生物膜的运动的膜蛋白。转运蛋白跨越它们定位在其中的膜并且它们跨越膜来转运物质。转运蛋白可以帮助物质从细胞内空间向培养基的运动(即转运或分泌)。已知转运蛋白用作被动运输系统，携带分子向其较低的浓度梯度移动，或作为主动运输系统，使用能量携带分子克服其浓度梯度向较高浓度梯度移动。主动运输通过这样的运载体介导，其将转运直接与源自atp分子水解之能量的使用相偶联；或通过这样的载质介导，其利用预先建立的电化学离子梯度来驱动营养分子和共转运离子的共转运。后一类包括分别在相同或相反方向携带离子作为被运输底物的同向转运体和反向转运蛋白。[0105]转运蛋白已根据转运蛋白分类数据库中的多种标准进行分类(在万维网tcdsb.org中)。参见，saierjr.等，nucl.acidsres.，42(1)：d251-258(2014)。其非限制性实例包括被认为在活生物体中普遍存在的多药耐药性(multipledrugresistance，mdr)质膜转运蛋白家族。mdr转运蛋白超家族可以根据将底物从膜的一侧转运到另一侧的操作模式进一步细分。转运蛋白可以响应于化学渗透离子梯度或通过主动运输来实现物质跨膜移动。atp结合盒转运蛋白(abc转运蛋白)是跨膜蛋白，其利用三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate，atp)水解的能量来进行多种底物的跨膜移动。它们可以运输多种底物穿过质膜和细胞内膜，包括代谢产物、脂质和固醇以及药物。内源abc转运蛋白基因的具体非限制性实例包括pdr5、ydr061w、pdr15、snq2、yor1、yol075c、mdl2、adp1、caf16、vmr1和ste6(或其功能同源物)。在一些方面中，abc转运蛋白转运甜菊醇糖苷。[0106]基于促进转运的化学渗透梯度的性质将第二组mdr进一步细分。saier，jr.等，j.mol.microbiol.biotechnol.1：257-279(1999)。在一些方面，mdr转运蛋白转运甜菊醇糖苷。[0107]另一个转运蛋白家族，主要促进子超家族(mfs)转运蛋白是可响应于质子梯度转运小溶质的单体多肽。mfs转运蛋白家族有时被称为单向转运蛋白-同向转运体-反向转运蛋白(uniporter-symporter-antiporter)家族。mfs转运蛋白尤其在糖摄取和药物外排系统(drugeffluxsystem)中起作用。mfs转运蛋白通常包含保守的mfs特异性基序。内源mfs转运蛋白基因的非限制性实例包括dtr1、seo1、ybr241c、vba3、fen2、snf3、stl1、hxt10、azr1、mph3、vba5、gex2、snq1、aqr1、mch1、mch5、atg22、hxt15、mph2、itr1、sit1、vps73、hxt5、qdr1、qdr2、qdr3、soa1、hxt9、ymr279c、yil166c、hol1、enb1、tpo4和flr1(或其功能类似物)。在一些方面，mfs转运蛋白转运甜菊醇糖苷。[0108]其他转运蛋白家族包括smr(小多药耐药性，smallmultidrugresistant)家族，rnd(抗性-结瘤-细胞分裂，resistance-nodulation-celldivision)家族和mate(多药和毒性化合物排出，multidrugandtoxiccompoundextrusion)家族。smr家族成员是以四个α螺旋跨膜链为特征的整体膜蛋白，其在细菌中赋予对宽范围的抗菌剂、亲脂性季铵化合物(quaternaryammoniumcompound，qac)的抗性和氨基糖苷抗性。参见bay和turner，2009，bmcevolbiol.，9：140。在一些方面，smr转运蛋白转运甜菊醇糖苷。[0109]mate家族成员包含12个跨膜(transmembrane，tm)结构域。已经在原核生物、酵母(如酿酒酵母和粟酒裂殖酵母)和植物中鉴定到mate家族的成员。参见diener等，2001，plantcell.13(7)：1625-8。mate家族成员是钠或质子反向转运蛋白。在一些方面中，mate转运蛋白转运甜菊醇糖苷。[0110]另外的转运蛋白家族包括氨基酸/生长素通透酶(aaap)家族(例如ykl146w/avt3、ybl089w/avt5、yer119c/avt6和yil088c/avt7)、atp酶家族(例如ybl099w/atp1、ydl185w/vma1、ylr447c/vma6、yol077w/atp19、ypl078c/atp4、yel027w/vma3、ykl016c/atp7和yor332w/vma4)、硫酸盐通透酶(sulp)家族(例如ybr294w/sul1、ygr125w和ypr003c)、溶酶体胱氨酸转运蛋白(lct)家族(例如ycr075c/ers1)、ca2+：阳离子反向转运蛋白(caca)家族(例如ydl128w/vcx1和yjr106w/ecm27)、氨基酸-多胺-有机阳离子(apc)超家族(例如ydl210w/uga4、yol020w/tat2、ypl274w/sam3、ynl268w/lyp1、yhl036w/mup3、ykr039w/gap1和yor348c/put4)、多药/寡糖基脂质/多糖(mop)(例如ydr338c)、zrt/irt样蛋白(zip)金属转运蛋白家族(例如ygl225w/zrt1和yor079c/atx2)、线粒体蛋白移位酶(mpt)家族(例如ygr181w/tim13、ynl070w/tom7、ynl121c/tom70)、电压门控离子通道(vic)家族(例如ygr217w/cch1和yjl093c/tok1)、单价阳离子：质子反向转运蛋白-2(cpa2)家族(例如yjl094c/kha1)、推定的跨膜氨基酸外排转运蛋白thre家族(例如yjl108c/prm10)、寡肽转运蛋白(opt)家族(例如yjl212c/opt1和ygl114w)、k+转运蛋白(trk)家族(例如tkr050w/trk2)、胆汁酸：na同向转运体(bass)家族(例如ymr034c)、药物/代谢物转运蛋白(dmt)超家族(例如ymr253c、yml038c/ymd8和yor307c/sly41)、线粒体运载体(mc)家族(例如ymr056c/aac1、ynl083w/sal1、yor130c/ort1、yor222w/odc2、ypr011c、ypr058w/ymc1、ypr128c/ant1、yel006w/yea6、yer053c/pic2、yfr045w、ygr257c/mtm1、yhr002w/leu5、yil006w/yia6、yjl133w/mrs3、ykl120w/oac1、ymr166c、ynl003c/pet8和yor100c/crc1)、生长素外排运载体(aec)家族(例如ynl095c、yor092w/ecm3和ybr287w)、氨通道转运蛋白(amt)家族(例如ynl142w/mep2)、金属离子(mn2+-铁)转运蛋白(nramp)家族(例如yol122c/smf1)、瞬时受体电位ca2+通道(trp-cc)家族(例如yor087w/yvc1)、耐砷-3(acr3)家族(例如ypr201w/arr3)、核碱基：阳离子同向转运体-1(ncs1)家族(例如ybr021w/fur4)、无机磷酸转运蛋白(pit)家族(例如ybr296c/pho89)、亚砷酸-亚锑酸盐(arsab)外排家族(例如ydl100c/get3)、转运蛋白iisp家族、甘油摄取(gup)家族(例如ygl084c/gup1)、金属离子转运(mit)家族(例如ykl064w/mnr2、ykl050c和yor334w/mrs2)、铜转运(ctr)家族(例如ylr411w/ctr3)或阳离子扩散促进子(cdf)家族(例如yor316c/cot1)。这些转运蛋白家族中的任何一个的特定成员包括在所公开发明的范围内，其程度为，在能够生产甜菊醇糖苷的细胞中，其表达的改变增加所述甜菊醇糖苷从细胞的生产；示例性成员在上面以及表5、6和14中公开。[0111]如本文所用，术语“转录因子”是指调节基因表达的dna结合蛋白。优选地，转录因子调节至少一种转运蛋白基因的表达。[0112]本文公开了用于鉴定影响甜菊醇糖苷和甜菊醇糖苷途径中间体之生产或转运的基因的方法。这样的方法可包括失活至少一种内源转运蛋白基因或修饰至少一种转运蛋白基因的表达。通常，制备突变体微生物文库，文库中的每个突变体具有不同的内源转运蛋白基因失活。使基因失活并确定其在微生物中之效果的方法是本领域普通技术人员已知的；在wo2014/122328中公开了另外的方法，其公开内容通过引用整体并入本文。在合成甜菊醇或甜菊醇糖苷的条件下，在培养基中培养包含一种或更多种甜菊醇糖苷途径基因的突变体微生物，并且如本文所述测量(例如，使用lc-ms)由所述微生物生产的总的、上清液和/或细胞内甜菊醇糖苷的量。[0113]本公开内容涉及重组宿主细胞，其中内源转运蛋白或转录因子基因的表达被修饰。在一些实施方案中，转运蛋白或转录因子基因相对酿酒酵母是内源的，所述酿酒酵母包括但不限于酿酒酵母菌株s288c。在一些实施方案中，内源转运蛋白或转录因子的表达可以通过用不同的启动子代替内源启动子来修饰，所述不同的启动子导致转运蛋白的表达增加(例如表达增加至少5％，如表达增加至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％、100％、200％或更多)。例如，内源启动子可以用导致转运蛋白表达增加的组成型或诱导型启动子替换。同源重组可用于以导致转运蛋白表达增加的不同启动子替代内源基因的启动子。在另一些实施方案中，可以使用同源重组将诱导型或组成型启动子和内源转运蛋白或转录因子整合到基因组的另一基因座中。在另一些实施方案中，可以使用具有启动子的外源质粒将转运蛋白或转录因子基因导入微生物中，所述启动子导致微生物中的转运蛋白或转录因子的过表达。在另一个实施方案中，外源质粒还可以包含转运蛋白或转录因子基因的多个拷贝。在另一个实施方案中，可以使用针对重组微生物的天然机制(例如热休克、应激、重金属或抗生素暴露)诱导内源转运蛋白或转录因子过表达。在另一个实施方案中，内源基因产物的活性被增强或增加(例如，通过突变)。在另一个实施方案中，内源酵母转运蛋白或转录因子基因的同源或直系同源基因过表达。[0114]在某些其他实施方案中，靶基因在重组微生物中的经修饰表达包括过表达转运蛋白基因和/或参与所述转运蛋白基因表达的转录因子基因。在另一些实施方案中，在所述重组微生物中过表达多个内源转运蛋白基因或转录因子基因。[0115]转录因子表达的修饰可用于增加转运蛋白表达。例如，酵母转录因子pdr1调节编码abc转运蛋白pdr5、snq2和yor1之基因的表达。因此，在一些实施方案中，可以用导致转录因子表达增加的不同启动子替换内源pdr1基因座的启动子，这可以增加内源转运蛋白的产量。[0116]在一些实施方案中，转运蛋白基因或转录因子基因为(使用各自的uniprot排序基因座名称(uniprotorderedlocusname))：yal067c、ybl089w、ybl099w、ybr008c、ybr021w、ybr043c、ybr180w、ybr241c、ybr287w、ybr294w、ybr295w、ybr296c、ycl038c、ycl069w、ycr011c、ycr028c、ycr075c、ydl054c、ydl100c、ydl128w、ydl185w、ydl194w、ydl210w、ydl245c、ydl247w、ydr011w、ydr061w、ydr093w、ydr292c、ydr338c、ydr406w、ydr497c、ydr536w、yel006w、yel027w、yel031w、yel065w、yer019c-a、yer053c、yer119c、yer166w、yfl011w、yfl028c、yfr045w、ygl006w、ygl013c、ygl084c、ygl104c、ygl114w、ygl167c、ygl255w、ygr125w、ygr181w、ygr217w、ygr224w、ygr257c、ygr281w、yhl016c、yhl035c、yhl036w、yhr002w、yhr096c、yil006w、yil088c、yil120w、yil121w、yil166c、yjl093c、yjl094c、yjl108c、yjl133w、yjl212c、yjl219w、yjr106w、yjr160c、ykl016c、ykl050c、ykl064w、ykl120w、ykl146w、ykl209c、ykr039w、ykr050w、ykr105c、ykr106w、ylr411w、ylr447c、yml038c、yml116w、ymr034c、ymr056c、ymr166c、ymr253c、ymr279c、ynl003c、ynl065w、ynl070w、ynl083w、ynl095c、ynl121c、ynl142w、ynl268w、ynr055c、yol020w、yol075c、yol077w-a、yol122c、yol158c、yor079c、yor087w、yor092w、yor100c、yor130c、yor153w、yor222w、yor271c、yor273c、yor291w、yor306c、yor307c、yor316c、yor332w、yor334w、yor348c、ypl036w、ypl078c、ypl270w、ypl274w、ypr003c、ypr011c、ypr058w、ypr128c和/或ypr201w。每个排序基因座的seqidno、uniprot登录号和基因名称可以在表5、6和14中找到。在一些实施方案中，上述转运蛋白基因和转录因子基因调节甜菊醇糖苷的分泌。[0117]在一些实施方案中，在甜菊醇糖苷生产菌株中缺失ydl128w(seqidno：22)、ydl194w(seqidno：24)、ydl210w(seqidno：25)、ydr536w(seqidno：30)、yfl011w(seqidno：33)、ygl006w(seqidno：34)、ygl013c(seqidno：35)、ygl255w(seqidno：36)、ygr181w(seqidno：38)、ygr217w(seqidno：39)、yhl016c(seqidno：42)、yil088c(seqidno：43)、yjl094c(seqidno：45)、yjr106w(seqidno：48)、ykr050w(seqidno：51)、ynl065w(seqidno：59)、ynl083w(seqidno：61)、ynl121c(seqidno：63)、ynl142w(seqidno：64)、yor291w(seqidno：74)、yor306c(seqidno：75)、yor334w(seqidno：77)、ypl270w(seqidno：79)、ypr011c(seqidno：82)、ypr128c(seqidno：84)导致分泌到培养基中的rebd的可测量的减少，表明各自均在rebd分泌中起作用。参见实施例3和表7-10。[0118]在一些实施方案中，在甜菊醇糖苷生产菌株中缺失ybr180w(seqidno：13)、yal067c(seqidno：14)、ybr241c(seqidno：17)、ycl069w(seqidno：19)、ycr075c(seqidno：21)、ydl128w(seqidno：22)、ydl194w(seqidno：24)、ydr093w(seqidno：27)、ydr338c(seqidno：28)、ydr406w(seqidno：29)、yer166w(seqidno：32)、yfl011w(seqidno：33)、ygl006w(seqidno：34)、ygl013c(seqidno：35)、ygl255w(seqidno：36)、ygr217w(seqidno：39)、yhl016c(seqidno：42)、yjl094c(seqidno：45)、yjl212c(seqidno：47)、yjr106w(seqidno：48)、yjr160c(seqidno：49)、ykr050w(seqidno：51)、ykr106w(seqidno：53)、yml116w(seqidno：55)、ymr034c(seqidno：56)、ymr056c(seqidno：57)、ymr253c(seqidno：58)、ynl070w(seqidno：60)、ynl083w(seqidno：61)、ynl095c(seqidno：62)、ynl121c(seqidno：63)、yol075c(seqidno：66)、yol122c(seqidno：68)、yor087w(seqidno：70)、yor222w(seqidno：73)、yor291w(seqidno：74)、yor306c(seqidno：75)、ypl274w(seqidno：80)、ypr003c(seqidno：81)、ypr011c(seqidno：82)或ypr201w(seqidno：85)导致rebm的可测量的减少，表明各自均在rebm分泌中起作用。参见实施例3和表7-10。[0119]在一些实施方案中，ygr181w(seqidno：38)或ydr061w(seqidno：26)的过表达将rebd和rebm向培养基中的转运提高约2倍(在ygr181w(seqidno：38)和ydr061w(seqidno：26)过表达菌株中约400-500mg/l的上清液rebd和rebm，相比于在对照甜菊醇糖苷生产菌株中约250mg/l的上清液rebd和rebm)。参见实施例4、图2和图3a-3b。[0120]在一些实施方案中，表11的转运蛋白的过表达将reba、rebb、rebd和/或rebm的分泌增加至少20％。在一些实施方案中，表12的转运蛋白的过表达将reba、rebb、rebd和/或rebm的产量增加至少40％。参见实施例5。[0121]在一些实施方案中，将转运蛋白基因整合到甜菊醇糖苷生产宿主的基因组中。在一些实施方案中，整合的转运蛋白是ybr043c(seqidno：88)、yel027w(seqidno：102)、yjl093c(seqidno：44)、yjr106w(seqidno：48)、ymr166c(seqidno：132)、yil166c(seqidno：121)、ykl120w(seqidno：126)、ydl054c(seqidno：94)、ydl128w(seqidno：22)、ydr536w(seqidno：30)、ygl167c(seqidno：112)、ykl146w(seqidno：127)、ykr039w(seqidno：129)、yol122c(seqidno：68)或ypr011c(seqidno：82)。在一些实施方案中，整合ybr043c(seqidno：88)、yel027w(seqidno：102)、yjl093c(seqidno：44)、yjr106w(seqidno：48)、ykl120w(seqidno：126)或ymr166c(seqidno：132)提高13-smg的分泌和/或总产量。在一些实施方案中，整合ybr043c(seqidno：88)、yel027w(seqidno：102)或ymr166c(seqidno：132)提高reba的分泌和/或总产量。在一些实施方案中，整合ybr043c(seqidno：88)、yel027w(seqidno：102)或ymr166c(seqidno：132)提高rebb的分泌和/或总产量。在一些实施方案中，整合seqidno：88的ybr043c、seqidno：102的yel027w、seqidno：44的yjl093c、seqidno：48的yjr106w和seqidno：132的ymr166c提高rebd的分泌和/或总产量，以及整合seqidno：88的ybr043c、seqidno：102的yel027w、yil166c(seqidno：121)、seqidno：44的yjl093c、seqidno：48的yjr106w和seqidno：132的ymr166c提高rebm的分泌和/或总产量，如通过与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比上清液中rebd和rebm水平的增加所测量的。参见实施例6。[0122]在一些实施方案中，与不过表达yjl093c或ybr043c的生产甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株相比，过表达yjl093c(seqidno：44)或ybr043c(seqidno：88)的生产甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株生产更高水平的rebd+rebm。参见实施例7。[0123]在一些实施方案中，被敲除的转运蛋白还可具有转运较大分子量甜菊醇糖苷的特异性(例如，rebd以及敲除seqidno：38的ygr181w或seqidno：74的yor291w)，并因此可用于在需要将rebd转运到培养基中的菌株中过表达。通过通路ugt的表达来适当平衡糖基化活性速率，使得较小分子量的甜菊醇糖苷在被转移到培养基中之前被进一步糖基化。例如，与ugt74g1和ugt85c2酶相比，ugt76g1和ugt91d2e和/或eugt11的更高表达水平可以防止更容易转运的甜菊醇单葡糖苷的积累。如果ugt活性水平比转运速率更高(因此糖基化速率更快)，则将生产更大量的较大分子量的甜菊醇糖苷。[0124]甜菊醇和甜菊醇糖苷生物合成核酸[0125]编码本文所述的多肽的重组基因包含所述多肽的编码序列，该序列与适合表达所述多肽之一个或更多个调控区按照有义方向有效连接。因为许多微生物能够由多顺反子mrna表达多种基因产物，因此如果期望的话，可以在这些微生物的单一调控区的控制下表达多个多肽。当调控区和编码序列被定位成使得调控区能够有效地调节所述序列的转录或翻译时，认为该编码序列和调控区有效连接。通常来说，对于单顺反子基因，编码序列的翻译阅读框的翻译起始位点位于调控区下游1到约50个核苷酸之间。[0126]在许多情况下，本文所述的多肽之编码序列是在重组宿主以外的物种中鉴定到的，即编码序列是异源核酸。因此，如果重组宿主是微生物，则编码序列可以来自其它原核或真核微生物、植物或动物。然而在一些情况下，编码序列是宿主先天具有的且被重新引入该生物体的序列。天然序列(nativesequence)与天然存在的序列(naturallyoccurringsequence)的区别通常在于存在与外源核酸连接的非天然序列，例如例如位于重组核酸构建体中天然序列侧翼的非天然调节序列。此外，稳定转化的外源核酸通常整合到发现天然序列的位置之外的位置。“调控区”是指含有影响转录或翻译的起始和速率、以及转录或翻译产物的稳定性和/或移动性之核苷酸序列的核酸。调控区包括但不限于，启动子序列、增强子序列、反应元件、蛋白质识别位点、诱导型元件、蛋白质结合序列、5’和3’非翻译区(utr)、转录起始位点、终止序列、多腺苷酸化序列、内含子、及其组合。调控区通常包含至少一个核心(基本)启动子。调控区还可以包含至少一个控制元件，例如增强子序列、上游元件或者上游激活区(upstreamactivationregion，uar)。通过将调控区与编码序列定位成使得调控区有效地调节序列的转录或翻译来使得调控区与编码序列有效连接。例如，为了有效连接编码序列和启动子序列，编码序列的翻译阅读框的翻译起始位点通常定位于启动子下游的1到约50个核苷酸之间。但调控区也可能被定位在翻译起始位点上游多达约5000个核苷酸或者转录起始位点上游约2000核苷酸的位置。[0127]对要包含的调控区的选择取决于几个因素，包括但不限于效率、可选择性、可诱导性、期望的表达水平，以及在某些培养阶段期间优先表达。对于本领域技术人员而言，通过相对编码序列适当选择和定位调控区来调整编码序列的表达是常规问题。应理解可能存在多于一个调控区，例如内含子、增强子、上游激活区、转录终止子和诱导型元件。[0128]可以将一个或更多个基因以“模块(modules)”组合在重组核酸构建体中，可用于甜菊醇和/或甜菊醇糖苷生产的一个独立方面。以模块组合多个基因，特别是多顺反子模块，便于在多种物种中使用所述模块。例如，可以以多顺反子模块组合甜菊醇生物合成基因簇或者ugt基因簇，从而使得在插入合适的调控区后，可以将模块引入众多的物种中。作为另一个实例，可以将ugt基因簇组合，以使得每个ugt编码序列有效连接独立的调控区从而形成ugt模块。这样的模块可以用在那些必须或者期望单顺反子表达的物种中。除了对甜菊醇或甜菊醇糖苷生产有用的基因以外，重组构建体通常还含有复制起点和使构建体保持在合适的物种中的一个或更多个可选择标志物。[0129]应理解，由于遗传密码的简并性，许多核酸可以编码特定多肽，即对于许多氨基酸，有多于一个核苷酸三联体充当该氨基酸的密码子。因此，使用针对宿主(例如，微生物)的合适密码子偏向性表格，可以将给定多肽的编码序列中的密码子进行修饰，从而获得在所述特定宿主中的最佳表达。作为经分离的核酸，这些经修饰的序列可以作为经纯化分子存在，也可以整合到载体或病毒中用于构建重组核酸构建体的模块。[0130]在一些情况下，期望抑制内源多肽的一种或更多种功能，以将代谢中间体转向甜菊醇或甜菊醇糖苷生物合成。例如，可能期望下调菌株中固醇的合成，以例如通过下调角鲨烯环氧酶来进一步增加甜菊醇或甜菊醇糖苷的产量。作为另一个实例，可能需要抑制某些内源基因产物(例如，从次级代谢物中除去葡萄糖部分的糖基水解酶或如本文所讨论的磷酸酶)的降解功能。作为另一个实例，可以激活参与甜菊醇糖苷转运的膜转运蛋白的表达，使得甜菊醇糖苷的转运增加。这种调节可以是有益的，因为在微生物培养期间可以将甜菊醇糖苷的转运增加期望的时间段，从而增加收获时糖苷产物的产量。在这种情况下，可以在转化入菌株的重组构建体中包括过表达所述多肽或基因产物的核酸。或者，可使用诱变来生成期望增加或增强其功能的基因的突变体。[0131]重组宿主[0132]重组宿主可用于表达生产甜菊醇糖苷的多肽，其包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和藻类细胞。许多原核生物和真核生物也适合用于构建本文所述的重组微生物，例如革兰氏阴性细菌、酵母和真菌。首先分析选择用作甜菊醇糖苷生产菌株的物种和菌株，以确定哪些生产基因对于菌株是内源的，哪些基因不存在。对于其内源对应物不存在于菌株中的基因，其有利地装配在一个或更多个重组构建体中，然后将其转化入菌株以提供丧失的功能。[0133]通常，使重组微生物在发酵罐中在限定的温度下生长期望的一段时间。本发明提utilis)、光滑念珠菌(candidaglabrata)、白色念珠菌和解脂耶氏酵母。[0139]在一些实施方案中，微生物可以是原核生物例如大肠杆菌(escherichiacoli)。[0140]在一些实施方案中，微生物可以是子囊菌(ascomycete)，例如腾仓赤霉、乳酸克鲁维酵母、粟酒裂殖酵母、黑曲霉、解脂耶氏酵母、棉阿舒囊霉、或酿酒酵母。[0141]在一些实施方案中，微生物可以是藻类细胞、例如三孢布拉氏霉菌(blakesleatrispora)、杜氏盐藻(dunaliellasalina)、雨生红球藻(haematococcuspluvialis)、小球藻(chlorellasp.)、裙带菜(undariapinnatifida)、马尾藻(sargassum)、海带(laminariajaponica)、almeriensis栅藻(scenedesmusalmeriensis)物种。[0142]在一些实施方案中，微生物可以是蓝细菌细胞，例如三孢布拉氏霉菌、杜氏盐藻、雨生红球藻、小球藻、裙带菜、马尾藻、海带、almeriensis栅藻。[0143]酵母属[0144]酵母是合成生物学中广泛使用的经典生物体，并且可以用作重组微生物平台。例如，存在可用于酿酒酵母的突变体、质粒、代谢的详细计算机模型和其他信息的文库，允许各种模块的合理设计以提高产物产量。用于制备重组微生物的方法是已知的。[0145]曲霉属[0146]曲霉属物种(例如米曲霉(a.oryzae)、黑曲霉(a.niger)和酱油曲霉(a.sojae))是食品生产中广泛使用的微生物，并且还可用作重组微生物平台。构巢曲霉(a.nidulans)、烟曲霉(a.fumigatus)、米曲霉、棒曲霉(a.clavatus)、黄曲霉(a.flavus)、黑曲霉和土曲霉(a.terreus)的基因组核苷酸序列是均是可获得的，从而允许合理设计和修饰内源途径以提高通量和提高产物产率。已经开发了用于曲霉属的代谢模型，以及转录组学研究和蛋白组学研究。黑曲霉被培养用于工业化生产多种食品成分，例如柠檬酸和葡糖酸，并且因此例如黑曲霉的物种通常适用于生产甜菊醇糖苷。[0147]大肠杆菌[0148]大肠杆菌，合成生物学中另一种广泛使用的平台生物体，也可以用作重组微生物平台。与酵母相似，大肠杆菌拥有可供使用的突变体文库、质粒、代谢的详细计算机模型以及其他信息，从而允许合理设计多种模块以提高产物的产率。可使用与上文针对酵母属所述的那些类似的方法来制备重组大肠杆菌微生物。[0149]伞菌属、赤霉属和平革菌属[0150]伞菌属、赤霉属和平革菌属是可用的，因为已知它们在培养物中生产大量类异戊二烯。因此用于大量生产甜菊醇糖苷的萜前体已由内源基因产生。因此，可将包含甜菊醇糖苷生物合成多肽的重组基因的模块引入来自这些属的物种中，而无需引入甲羟戊酸或mep途径基因。[0151]arxulaadeninivorans(blastobotrysadeninivorans)[0152]arxulaadeninivorans是具有独特生化特征的二态酵母(其在高至42℃的温度下生长为类似于面包酵母的出芽酵母，高于该阈值时，其以丝状形式生长)。其可在多种底物上生长，并且可同化硝酸盐。其已成功地应用于产生可以生产天然塑料的菌株或者应用于开发用于环境样品中之雌激素的生物传感器。[0153]解脂耶氏酵母[0154]解脂耶氏酵母是二态酵母(参见arxulaadeninivorans)并且属于半子囊菌科(familyhemiascomycetes)。解脂耶氏酵母的整个基因组是已知的。耶氏酵母属物种是需氧的并且被认为是非致病性的。耶氏酵母在使用疏水性底物(例如烷烃、脂肪酸、油)方面是高效的，并且可以在糖上生长。它具有很高的工业应用潜力，是一种产油微生物。解脂耶氏酵母可以将脂质含量累积到其干细胞重量的约40％，并且是用于脂质累积和再活化的模式生物体。参见例如nicaud，2012，yeast29(10)：409-18；beopoulos等，2009，biohimie91(6)：692-6；bankar等，2009，applmicrobiolbiotechnol.84(5)：847-65。[0155]红酵母属(rhodotorulasp.)[0156]红酵母是单细胞的、含色素的酵母。产油的红酵母，粘红酵母(rhodotorulaglutinis)已经显示从粗甘油生产脂质和类胡萝卜素(saenge等，2011，processbiochemistry46(1)：210-8)。圆红冬孢酵母(rhodotorulatoruloides)菌株已经显示为用于改善生物质和脂质生产力的高效补料分批发酵系统(li等，2007，enzymeandmicrobialtechnology41：312-7)[0157]圆红冬孢酵母[0158]圆红冬孢酵母是产油酵母，并且可用于工程化脂质生产途径(参见例如zhu等，2013，naturecommun.3：1112；ageitos等，2011，appliedmicrobiologyandbiotechnology90(4)：1219-27)。[0159]博伊丁念珠菌[0160]博伊丁念珠菌是甲基营养型酵母(其可在甲醇上生长)。与其他的甲基营养型物种(例如多形汉逊酵母(hansenulapolymorpha)和巴斯德毕赤酵母)类似，博伊丁念珠菌为生产异源蛋白质提供优异的平台。已报道了分泌型外来蛋白的多克级范围的产率。最近，计算方法ipro预测了在实验上将博伊丁念珠菌木糖还原酶的辅因子特异性从nadph转化至nadh的突变。参见例如mattanovich等，2012，methodsmolbiol.824：329-58；khoury等，2009，proteinsci.18(10)：2125-38。[0161]多形汉逊酵母(安格斯毕赤酵母，pichiaangusta)[0162]多形汉逊酵母是甲基营养型酵母(参见，博伊丁念珠菌)。其还可在多种其他底物上生长；其耐热并且可以同化硝酸盐(另参见乳酸克鲁维酵母)。多形汉逊酵母已被应用于生产乙型肝炎疫苗、胰岛素和用于治疗丙型肝炎的干扰素α-2a，还用于一系列技术酶。参见例如xu等，2014，virolsin.29(6)：403-9。[0163]乳酸克鲁维酵母[0164]乳酸克鲁维酵母是常规地应用于生产克非尔(kefir)的酵母。其可在数种糖上生长，最重要的是可在存在于乳和乳清中的乳糖上生长。乳酸克鲁维酵母已被成功地应用于生产凝乳酶(通常存在于牛的胃中的一种酶)等以生产奶酪。生产以40,000l的规模在发酵罐中进行。参见例如vanooyen等，2006，femsyeastres.6(3)：381-92。[0165]巴斯德毕赤酵母[0166]巴斯德毕赤酵母是甲基营养型酵母(参见博伊丁念珠菌和多形汉逊酵母)。巴斯德毕赤酵母为外来蛋白质的生产提供有效的平台。平台元件可作为试剂盒获得并且在世界范围内在学术界中被用于生产蛋白质。已将菌株改造成可生产复杂的人n-多糖(酵母多糖与在人中发现的那些类似但不相同)。参见例如piirainen等，2014，nbiotechnol.31(6)：532-7。[0167]小立碗藓属(physcomitrellaspp.)[0168]小立碗藓苔藓(physcomitrellamosse)在悬浮培养物中生长时具有与酵母或其他真菌培养物相似的特征。该属可用于生产可能难以在其他类型的细胞中生产的植物次级代谢物。[0169]甜菊醇糖苷组合物[0170]甜菊醇糖苷在不同的食品系统中不一定具有等同的性能。因此，期望其具有将合成引导至所选择的甜菊醇糖苷组合物的能力。本文描述的重组宿主可以生产选择性富集特定甜菊醇糖苷(例如rebd)并具有一致的味道特性的组合物。因此，本文所述的重组宿主可以促进这样的组合物的生产，所述组合物被调整以满足给定食品所需的甜味特性，并且每批之间具有每种甜菊醇糖苷的一致比例。本文所述的宿主不产生在甜菊提取物中发现的不期望的植物副产物。因此，由本文所述的重组宿主产生的甜菊醇糖苷组合物与源自甜叶菊植物的组合物是不同的。[0171]生产的单一甜菊醇糖苷(例如，reba、rebb、rebd或rebm)的量可以为约1mg/l至约2,800mg/l，例如，约1至约10mg/l，约3至约10mg/l，约5至约20mg/l，约10至约50mg/l，约10至约100mg/l，约25至约500mg/l，约100至约1,500mg/l，或约200至约1,000mg/l，至少约1,000mg/l，至少约1,200mg/l，至少约至少1,400mg/l，至少约1,600mg/l，至少约1,800mg/l，或至少约2,800mg/l。在一些方面中，单一甜菊醇糖苷的量可以超过2,800mg/l。所生产的甜菊醇糖苷(例如，reba、rebb、rebd或rebm)的组合的量可以为约1mg/l至约6,000mg/l，例如约200至约1,500，至少约2,000mg/l，至少约3,000mg/l，至少约4,000mg/l，至少约5,000mg/l，或至少约6,000mg/l。在一些方面中，甜菊醇糖苷的组合的量可以超过6,000mg/l。一般来说，更长的培养时间将导致更大量的产品。因此，重组微生物可以培养1天至7天，1天至5天，3天至5天，约3天，约4天或约5天。[0172]应当理解，本文所讨论的多种基因和模块可以存在于两种或更多种重组微生物中，而不是单一微生物中。当使用多种重组微生物时，它们可以在混合培养物中生长以生产甜菊醇和/或甜菊醇糖苷。例如，第一微生物可以包含用于生产甜菊醇的一种或更多种生物合成基因和在第一组内源转运蛋白中的无效突变，而第二微生物包含甜菊醇糖苷生物合成基因和第二组内源转运蛋白中的无效突变。然后回收由第二或最终微生物生产的产物。还将理解，在一些实施方案中，使用除培养基之外的营养源并利用除发酵罐之外的系统来培养重组微生物。[0173]或者，两种或更多种微生物各自可在单独的培养基中生长，并且第一培养基的产物例如甜菊醇可以被引入第二培养基中以转化为随后的中间体，或转化为最终产品例如reba。然后回收由第二或最终微生物生产的产物。微生物可以在内源转运蛋白中具有相同或不同的突变组。还将理解，在一些实施方案中，使用除培养基之外的营养源并利用除发酵罐之外的系统来培养重组微生物。[0174]甜菊醇糖苷在不同的食品系统中不一定具有等同的性能。因此，期望其具有将合成引导至所选择的甜菊醇糖苷组合物的能力。本文描述的重组宿主可以生产选择性富集特定甜菊醇糖苷(例如rebd)并具有一致的味道特征的组合物。因此，本文所述的重组微生物可以促进这样的组合物的生产，所述组合物被调整以满足给定食品所需的甜味特征，并且每批之间具有每种甜菊醇糖苷的一致比例。本文所述的微生物不产生在甜菊提取物中发现的不期望的植物副产物。因此，由本文所述的重组微生物生产的甜菊醇糖苷组合物与源自甜叶菊植物的组合物是不同的。[0175]通过本文公开的方法获得的甜菊醇糖苷和组合物可用于制备食品、膳食补充剂和甜味剂组合物。参见例如wo2011/153378、wo2013/022989、wo2014/122227和wo2014/122328，其各自通过引用整体并入本文。[0176]例如，基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷例如rebm或rebd可以包含在食品中，例如冰淇淋、碳酸饮料、果汁、酸奶、烘焙食品、口香糖、硬糖和软糖和调味汁(sauce)。基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷也可以包含在非食品产品例如药品、医药产品、膳食补充剂和营养补充剂中。基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷也可以包含在用于农业工业和伴侣动物工业的动物饲料产品中。或者，可以通过分别培养重组微生物来制备甜菊醇和/或甜菊醇糖苷的混合物，每种重组微生物生产特定的甜菊醇或甜菊醇糖苷，从每种微生物中回收基本上纯的形式的甜菊醇或甜菊醇糖苷，然后合并这些化合物以获得包含所需比例的每种化合物的混合物。与目前的甜菊产品相比，本文所述的重组微生物允许获得更精确和一致的混合物。例如，本文描述的重组微生物可以表达特异性转运特定莱鲍迪苷至培养基中的转运蛋白。当转运蛋白特异性针对特定的莱鲍迪苷时，它将富集发酵液中该化合物的浓度，防止其进一步反应成不同的化合物，并通过选择性地将这种莱鲍迪苷转运到发酵液中，它将使得更容易从其他莱鲍迪苷中回收，并因此使该方法更有效。[0177]在另一替代方案中，可将基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷与其他甜味剂一起并入食品中，所述其他甜味剂例如糖精、右旋糖、蔗糖、果糖、赤藓糖醇、阿斯巴甜、三氯蔗糖、莫纳甜(monatin)或乙酰磺胺酸钾。甜菊醇或甜菊醇糖苷相对于其他甜味剂的重量比可以根据需要改变以在最终食品中达到令人满意的味道。参见例如，u.s.2007/0128311。在一些实施方案中，甜菊醇或甜菊醇糖苷可以与风味剂(例如柑橘)一起提供，以作为风味调节剂。[0178]由本文所述的重组微生物所生产的组合物可以并入食品中。例如，取决于甜菊醇糖苷和食品的类型，由重组微生物生产的甜菊醇糖苷组合物可以基于干重以约20mg甜菊醇糖苷/kg食品至约1800mg甜菊醇糖苷/kg食品的量并入食品中。例如，由重组微生物生产的甜菊醇糖苷组合物可以并入甜点、冷的糖食(例如冰淇淋)、乳制品(例如酸奶)或饮料(例如碳酸饮料)中，以使得食品基于干重具有最多500mg甜菊醇糖苷/kg食品。由重组微生物生产的甜菊醇糖苷组合物可以并入烘焙食品(例如饼干)中，以使得食品基于干重具有最多300mg甜菊醇糖苷/kg食品。由重组微生物生产的甜菊醇糖苷组合物可以并入到调味汁(例如巧克力糖浆)或蔬菜产品(例如腌菜)中，以使得食品基于干重具有最多1000mg甜菊醇糖苷/kg食品。由重组微生物生产的甜菊醇糖苷组合物可以掺入面包中以使得食品基于干重具有最多160mg甜菊醇糖苷/kg食品。由重组微生物、植物或植物细胞生产的甜菊醇糖苷组合物可以并入硬糖或软糖中，以使得食品基于干重具有最多1600mg甜菊醇糖苷/kg食品。由重组微生物、植物或植物细胞生产的甜菊醇糖苷组合物可以并入加工的水果产品(例如果汁、水果馅、果酱和果冻)中，以使得食品基于干重具有最多1000mg甜菊醇糖苷/kg食品。[0179]例如，这样的甜菊醇糖苷组合物可具有90-99％的reba和不可检测量的甜叶菊植物衍生的污染物，并基于干重以25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg并入食品中。[0180]这样的甜菊醇糖苷组合物可以是富含rebb的组合物，其具有大于3％的rebb并被并入食品中，以使得产物中rebb的量基于干重为25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含rebb的组合物具有不可检测量的源自甜叶菊植物的污染物。[0181]这样的甜菊醇糖苷组合物可以是富含rebd的组合物，其具有大于3％的rebb并被并入食品中，以使得产物中rebd的量基于干重为25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含rebd的组合物具有不可检测量的源自甜叶菊植物的污染物。[0182]这样的甜菊醇糖苷组合物可以是富含rebe的组合物，其具有大于3％的rebe并被并入食品中，以使得产物中rebe的量基于干重为25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含rebe的组合物具有不可检测量的源自甜叶菊植物的污染物。[0183]这样的甜菊醇糖苷组合物可以是富含rebm的组合物，其具有大于3％的rebm并被并入食品中，以使得产物中rebm的量基于干重为25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含rebm的组合物具有不可检测量的源自甜叶菊植物的污染物。[0184]在一些实施方案中，将基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷并入到佐餐甜味剂或“杯对杯(“cup-for-cup”)”产品中。这样的产品通常用本领域技术人员已知的一种或更多种填充剂例如麦芽糖糊精稀释至适当的甜味水平。富含reba、rebb、rebd、rebe或rebm的甜菊醇糖苷组合物可包装在小袋中，例如，以基于干重的10,000至30,000mg甜菊醇糖苷/kg产品用于佐餐使用。[0185]将在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。[0186]实施例[0187]以下实施例说明本发明的具体实施方案及其多种用途。它们仅出于说明的目的而列出，并且不被认为是限制本发明。[0188]实施例1.lc-ms分析方法[0189]本文描述的lc-ms方法取向为在混合物(即培养基)存在下分离、一般检测和潜在鉴定特定质量的化学品(即甜菊醇糖苷)。在(a)3000-tsq(thermofisherscientific)；(b)1290infitity-6130sq(agilent)；或(c)acquity-xevotqd(waters)系统上进行lc-ms分析。下面描述用于每个系统的具体方法。[0190]方法a：除非另有说明，使用配有watersacquitybehshieldrp18柱(2.1×50mm，1.7μm颗粒，孔径)的3000uplc系统(dionex)进行lc-ms分析，所述柱连接到具有加热电喷雾离子(hesi)源的tsqaccess(thermofisherscientific)三重四极杆质谱仪。使用洗脱液b(含0.1％甲酸的mecn)和洗脱液a(含0.1％甲酸的水)的流动相，通过逐渐增加梯度来进行洗脱，所述梯度为：0.0至4.0分钟25％增加至47％b；4.0至5.0分钟47％增加至100％b；5.0至6.5分钟保持100％b再平衡。流量为0.4ml/分钟，柱温度为35℃。采用sim(单离子监测，singleionmonitoring)用下述m/z迹线来检测甜菊醇糖苷。[0191]表1.甜菊醇糖苷的ms分析信息[0192][0193]通过与用来源于lgcstandards的可信标准品所获得的校准曲线进行比较来定量甜菊醇糖苷的水平。例如，通常使用0.5至100μmreba的标准溶液来构建校准曲线。[0194]方法b：在配有watersacquitybehshieldrp18柱(2.1×50mm，1.7μm颗粒，孔径，waters)的agilent系统1290infinity上进行第二分析方法，所述柱连接到具有apci离子源的6130单四极杆质量检测器(agilent)。使用洗脱液b(含0.1％甲酸的mecn)和洗脱液a(含0.1％甲酸的水)的流动相，通过逐渐增加梯度来进行洗脱，所述梯度为：0.0至4.0分钟25％增加至47％b；4.0至5.0分钟47％增加至100％b；5.0至6.5分钟保持100％b再平衡。流量为0.6ml/分钟，柱温度为50℃。采用sim(单离子监测)用下述m/z迹线来检测甜菊醇糖苷。[0195]表2.甜菊醇糖苷的ms分析信息[0196][0197]通过与用来源于lgcstandards的可信标准品所获得的校准曲线进行比较来定量甜菊醇糖苷的水平。例如，通常使用0.3至25μmreba的标准溶液来构建校准曲线。[0198]方法c：所使用的第三种分析方法是使用带有watersacquitybehc18柱(2.1×50mm，1.7μm颗粒，孔径)的watersacquityuplc(waterscorporation，milford，ma)进行lc-ms分析，所述柱偶连到具有电喷雾电离(esi)的处于负模式的watersacquitytqd三重四极杆质谱仪。通过两个流动相a(含0.1％甲酸的水)和b(含0.1％甲酸的mecn)的逐渐增加的梯度来实现化合物分离，所述梯度为：0.3至2.0分钟20％增加至50％b；在2.01分钟时增加至100％b，保持100％b经0.6分钟并再平衡另外0.6分钟。流量为0.6ml/分钟，柱温度为55℃。使用sim(单离子监测)监测rebd(m/z1127.5)、rebm(m/z1289.5)、莱鲍迪苷a(m/z965.4)和rebb(m/z803.4)，并通过与可信标准品比较进行定量。[0199]实施例2.构建甜菊醇糖苷生产酵母菌株[0200]如wo2011/153378、wo2013/022989、wo2014/122227和wo2014/122328中所述构建生产甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株，其各自通过引用整体并入本文。例如，包含以下基因的酵母菌株生产甜菊醇糖苷：编码聚球藻属(synechococcussp.)ggpps多肽的重组基因(seqidno：1，seqidno：149)；编码截短的玉蜀黍(zeamays)的cdps多肽的重组基因(seqidno：2，seqidno：150)；编码拟南芥(a.thaliana)ks多肽的重组基因(seqidno：3，seqidno：151)；编码重组的甜叶菊(s.rebaudiana)ko1多肽的重组基因(seqidno：4，seqidno：152)；编码拟南芥atr2多肽的重组基因(seqidno：5，seqidno：153)；编码稻(o.sativa)eugt11多肽的重组基因(seqidno：12；seqidno：148)；编码srkahe1多肽的重组基因(seqidno：6，seqidno：154)；编码甜叶菊cpr8多肽的重组基因(seqidno：7，seqidno：155)；编码甜叶菊ugt85c2多肽的重组基因(seqidno：8，seqidno：156)；编码甜叶菊ugt74g1多肽的重组基因(seqidno：9，seqidno：157)；编码甜叶菊ugt76g1多肽的重组基因(seqidno：10，seqidno：158)；和编码甜叶菊ugt91d2变体(或功能同源物)，ugt91d2e-b多肽的重组基因(seqidno：11，seqidno：159)。如在从全细胞和培养混合物(总产物)中经dmso提取总甜菊醇糖苷之后通过lc-ms(方法c)分析，在30℃，在深孔板中以400rpm振荡，在1mlsc(syntheticcomplete，合成完全)培养基中生长5天后，菌株生产了18-21μg/ml或1-1.5μg/ml/od600的rebm。参见表3。[0201]表3.在代表性酿酒酵母菌株中的甜菊醇糖苷生产，所述菌株包含编码ggpps、截短的cdps、ks、ko、atr2、eugt11、srkahe1、cpr8、ugt85c2、ugt74g1、ugt76g1和eugt11多肽的基因[0202][0203]分析包含第一菌株的基因的额外拷贝的第二菌株的甜菊醇糖苷生产。第二菌株生产rebd和rebm作为主要甜菊醇糖苷，但是水平比第一菌株更高。[0204]如在从全细胞和培养混合物(总产物)中经dmso提取总甜菊醇糖苷之后通过lc-ms(方法c)分析，在30℃，在深孔板中以400rpm振荡，在1mlsc培养基中生长5天后，第二菌株生产了60-80μg/ml或4-6μg/ml/od600的rebm。由第二菌株生产的reba、rebb、rebd和rebm示于表4中。[0205]表4.在酿酒酵母菌株中的甜菊醇糖苷生产，所述菌株包含编码ggpps、截短的cdps、ks、ko、atr2、eugt11、srkahe1、cpr8、ugt85c2、ugt74g1、ugt76g1和eugt11多肽的基因的额外拷贝。[0206][0207]实施例3.酵母内源转运基因和转运相关基因的敲除[0208]来自实施例2和类似菌株的深孔研究的观察结果表明，上清液中reba、rebb、rebd或rebm的级分(fraction)随时间而变化，并且已确定该效应不是细胞裂解的结果。为了确定多种转运蛋白对酿酒酵母中甜菊醇糖苷分泌的影响，通过以下获得用于同源重组的缺失盒：设计在开放阅读框(orf)上游和下游约200bp处退火的引物，然后从酿酒酵母缺失集合中扩增orf特异性缺失盒。所选择的候选基因包括鉴定为与转运相关或包含跨膜结构域而无论亚细胞定位的orf。在所得菌落中，通过菌落pcr确认在正确基因座处存在缺失盒。将每个缺失的最多6个克隆作为冷库储存物(freezerstock)冷冻。将用于分析的所有样品从冷库储存物中开始并在sc培养基中培养5天(30℃，400rpm振荡)，然后收获并提取用于lc-ms的样品。分析样品中缺乏细胞的培养液(上清液)以及全细胞和培养混合物(总产物)中reba、rebb、rebd和rebm的存在。[0209]将总的和上清液reba、rebb、rebd和rebm的浓度与对照甜菊醇糖苷生产菌株中的水平进行比较。通过将特定甜菊醇糖苷的值除以对照菌株的相应值，将每个样品中reba、rebb、rebd和rebm的量相对于对照菌株归一化，从而计算相对于对照菌株的百分比，其中1等于100％。与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，“理想候选物”在不降低reba、rebb、rebd和/或rebm总产量的情况下，将显示上清液中reba、rebb、rebd和/或rebm水平的降低。[0210]在甜菊醇糖苷生产菌株(例如实施例2中所述的菌株)中测试酵母基因敲除对较高分子量甜菊醇糖苷转运到培养基中的作用。通过同源重组进行对每个特异性转运蛋白基因的破坏。在1mlsc培养基中在30℃和400rpm下生长5天后，收获细胞。将50μl等分试样的培养物与等体积的100％dmso混合，涡旋，并加热至80℃持续10分钟。然后将悬浮液离心以除去细胞碎片。通过lc-ms分析作为“总”样品的60μl混合物。然后将剩余的培养物离心以沉淀细胞。从上清液(即培养基)中取出50μl的等分试样，并与等体积的100％dmso混合。将悬浮液加热至80℃持续10分钟并离心。通过lc-ms分析作为“上清液”样品的60μl混合物。如实施例1所述，通过lc-ms(方法c)测量较高分子量甜菊醇糖苷(包括reba、rebb、rebd、rebm)的量。[0211]数据证明在甜菊醇糖苷生产菌株中单一内源酵母转运蛋白基因的破坏导致培养基上清液中多种甜菊醇糖苷水平的降低，如通过转运到上清液中的经归一化量所评估的(参见表5-10)。表5-10包含在甜菊醇糖苷生产菌株中敲除的转运相关基因的列表。更具体地，表5包含按排序基因座名称汇编的基因列表，发现所述基因影响甜菊醇糖苷生产菌株中的甜菊醇糖苷分泌，并因此鉴定为在甜菊醇糖苷分泌中具有作用。当敲除指定的基因时，观察到在单独的上清液中或在上清液/总产量的比例中，reba、rebb、rebd和/或rebm减少超过40％。这大致相当于从对照甜菊醇糖苷生产菌株的平均值减掉大于2个标准差(值1等于对照菌株的100％，而值0.5表示降低50％)。[0212]表6包含按排序基因座名称汇编的基因列表，发现所述基因影响甜菊醇糖苷生产菌株中的甜菊醇糖苷分泌，并因此鉴定为在甜菊醇糖苷分泌中具有作用。当敲除时，这些基因导致在单独的上清液中或在上清液/总产量的比例中的平均值降低20-40％。这大致相当于从对照菌株的平均值减掉大约1至2个标准差(值1等于对照菌株的100％，而值0.5表示降低50％)。[0213]表5a.与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，reba、rebb、rebd或rebm水平降低超过40％的转运相关基因。[0214][0215]表5b.与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，reba、rebb、rebd或rebm水平降低超过40％的转运相关基因续表。[0216][0217]表6a.与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，reba、rebb、rebd或rebm水平降低20-40％的转运相关基因。[0218][0219]表6b.与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，reba、rebb、rebd或rebm水平降低20-40％的转运相关基因续表。[0220][0221]基于对所测量的每种甜菊醇糖苷的两个选择标准(即，两种归一化表达的方法)，从数据中选择甜菊醇糖苷输出蛋白候选物。[0222]转运蛋白选择标准1对应于基于上清液中可用的高分子量甜菊醇糖苷(reba、rebb、rebd或rebm)水平以及所述甜菊醇糖苷的总产量的选择。两个值均对相应的甜菊醇糖苷生产对照菌株的值进行归一化。将对照水平设定为1，并将相应的甜菊醇糖苷水平计算为对照的百分比。对于目的排序基因座名称(即基因)，上清液中可用的甜菊醇糖苷应低于0.6(低于对照的60％)或0.8-0.6(对照的80-60％)。为了避免假阳性或对一般减少产量的转运蛋白的偏向，该计算具有另外的要求，即总产量必须与对照相似。在目前的计算中，当对照设置为1时，则产量设置为在对照的0.85至1.15之间。在这一点上，甜菊醇糖苷生产水平不影响结果。表7显示了满足选择标准的每个候选物的上清液/总量比例。[0223]转运蛋白选择标准2对应于基于上清液中高分子量甜菊醇糖苷(reba、rebb、rebd或rebm)相对于所述甜菊醇糖苷总产量之比例的选择。将上清液与总产量的比例(supernatant-to-total-productionratio)相对于相应的甜菊醇糖苷生产菌株对照的比例归一化。将对照水平设定为1，并将相应的甜菊醇糖苷比例计算为对照的百分比。对于目的排序基因座名称(即基因)，给定甜菊醇糖苷的上清液与总产量的比例应当低于0.6(低于对照的60％)或0.8-0.6(对照的80-60％)。为了避免假阳性或对一般减少产量的转运蛋白的偏向，该计算具有另外的要求，即总产量必须与对照相似。在目前的计算中，当对照设置为1时，则产量设置为在对照的0.85至1.15之间。在这一点上，甜菊醇糖苷生产水平不影响结果。表8显示了满足选择标准的每个候选物的上清液/总量比例。[0224]数据证明，如通过转运到上清液中的经归一化量所评价的，在甜菊醇糖苷生产菌株中单个内源酵母转运蛋白基因的破坏导致培养基上清液中多种甜菊醇糖苷水平的降低(参见表5-10)，因此被鉴定为在甜菊醇糖苷分泌中具有作用。[0225]例如，在甜菊醇糖苷生产菌株中缺失ydl128w(seqidno：22)，ydl194w(seqidno：24)，ydl210w(seqidno：25)，yfl011w(seqidno：33)，ygl006w(seqidno：34)，ygl013c(seqidno：35)，ygl255w(seqidno：36)，ygr181w(seqidno：38)，ygr217w(seqidno：39)，yil088c(seqidno：43)，yjl094c(seqidno：45)，yjr106w(seqidno：48)，ynl065w(seqidno：59)，ynl083w(seqidno：61)，ynl121c(seqidno：63)，ynl142w(seqidno：64)，yor306c(seqidno：75)或ypr011c(seqidno：82)导致分泌到培养基中的rebd的可检测的减少，表明各自均在rebd分泌中起作用。这由转运蛋白选择标准1和2证实(参见表7和8，rebd列)。[0226]此外，例如，在甜菊醇糖苷生产菌株中缺失ybr180w(seqidno：13)，ybr241c(seqidno：17)，ycl069w(seqidno：19)，ycr075c(seqidno：21)，ydl128w(seqidno：22)，ydl194w(seqidno：24)，ydr093w(seqidno：27)，ydr338c(seqidno：28)，yer166w(seqidno：32)，yfl011w(seqidno：33)，ygl006w(seqidno：34)，ygl013c(seqidno：35)，ygl255w(seqidno：36)，ygr217w(seqidno：39)，yjl094c(seqidno：45)，yjr106w(seqidno：48)，yjr160c(seqidno：49)，ykr106w(seqidno：53)，yml116w(seqidno：55)，ymr056c(seqidno：57)，ynl070w(seqidno：60)，ynl083w(seqidno：61)，ynl095c(seqidno：62)，ynl121c(seqidno：63)，yor087w(seqidno：70)，yor291w(seqidno：74)，yor306c(seqidno：75)，ypl274w(seqidno：80)或ypr011c(seqidno：82)导致rebm的可检测的降低，表明各自均在rebm分泌中起作用。这由转运蛋白选择标准1和2证实(参见表7和8，rebm列)。[0227]表7表示在甜菊醇糖苷生产菌株中缺失了每种基因(按排序基因座名称)的上清液/总产量的计算比例，其对于包含编码ggpps、截短的cdps、ks、ko、atr2、eugt11、srkahe1、cpr8、ugt85c2、ugt74g1、ugt76g1和eugt11多肽之基因的甜菊醇糖苷生产菌株归一化。小于0.6的上清液或上清液/总量的比例表示在单独的上清液中或在上清液/总产量的比例中reba、rebb、rebd或rebm下降超过40％，其相当于从对照甜菊醇糖苷生产菌株的平均值减掉超过2个标准差，并且表明该基因在甜菊醇糖苷转运中具有作用(表7)。0.6至0.8的上清液或上清液/总量的比例表示在单独的上清液中或在上清液/总产量的比例中reba、rebb、rebd或rebm下降40-20％，其相当于从对照甜菊醇糖苷生产菌株的平均值减掉大约1至2个标准差，并且表明该基因在甜菊醇糖苷转运和/或生产中具有作用(表8)。与甜菊醇糖苷生产菌株相比，每种甜菊醇糖苷的总产量在0.85和1.15之间。表8显示了满足选择标准的每个候选物的上清液/总量的比例。[0228]表7.与包含编码ggpps、截短的cdps、ks、ko、atr2、eugt11、srkahe1、cpr8、ugt85c2、ugt74g1、ugt76g1和eugt11多肽之基因的对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，reba、rebb、rebd或rebm减少超过40％的转运相关基因。[0229][0230]表8.与包含编码ggpps、截短的cdps、ks、ko、atr2、eugt11、srkahe1、cpr8、ugt85c2、ugt74g1、ugt76g1和eugt11多肽之基因的对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，reba、rebb、rebd或rebm减少20-40％的转运相关基因。[0231][0232][0233]还在包含编码ggpps、截短的cdps、ks、ko、atr2、eugt11、srkahe1、cpr8、ugt85c2、ugt74g1、ugt76g1和eugt11多肽之基因的额外拷贝的甜菊醇糖苷生产菌株中测试了酵母基因敲除对较高分子量甜菊醇糖苷转运到培养基(即上清液)中的作用，其描述于实施例2中。数据表明，在甜菊醇糖苷生产菌株中单一内源酵母转运蛋白基因的破坏导致培养基上清液中多种甜菊醇糖苷水平的降低，如通过归一化的转运量或通过上清液与总产量的比例所评价(参见表9和10，rebd列)。例如，在甜菊醇糖苷生产菌株中缺失ydr536w(seqidno：30)，yhl016c(seqidno：42)，ykr050w(seqidno：51)，yor291w(seqidno：74)，yor334w(seqidno：77)，ypl270w(seqidno：79)，ypr058w(seqidno：83)，或ypr128c(seqidno：84)导致转运到上清液中的rebd的可检测的减少，表明它们在rebd分泌中起作用。这由转运蛋白选择标准1和2证实(参见表9和10，rebd列)。[0234]另外，例如缺失yal067c(seqidno：14)，ydr406w(seqidno：29)，yhl016c(seqidno：42)，yjl212c(seqidno：47)，ykr050w(seqidno：51)，ymr034c(seqidno：56)，ymr253c(seqidno：58)，yol075c(seqidno：66)，yol122c(seqidno：68)，yor222w(seqidno：73)，ypr003c(seqidno：81)或ypr201w(seqidno：85)导致转运到上清液中的rebm的可检测的减少，表明它们在rebm分泌中起作用。这通过转运蛋白选择标准1和2证实(参见表9和10，rebm列)。[0235]表9表示在甜菊醇糖苷生产菌株中缺失的每个基因(按排序基因座名称)的上清液/总产量的计算比例，其对于包含编码ggpps、截短的cdps、ks、ko、atr2、eugt11、srkahe1、cpr8、ugt85c2、ugt74g1、ugt76g1和eugt11多肽之基因的额外拷贝的甜菊醇糖苷生产菌株进行归一化。小于0.6的上清液或上清液/总量的比例表示在单独的上清液中或在上清液/总产量的比例中reba、rebb、rebd或rebm降低超过40％，其相当于从对照甜菊醇糖苷生产菌株的平均值减掉大于2个标准差，并表明该基因在甜菊醇糖苷转运和/或生产中具有作用(表9)。0.6至0.8的上清液或上清液/总量的比例表示在单独的上清液中或在上清液/总产量的比例中reba、rebb、rebd或rebm降低40-20％，其相当于从对照菌株的平均值减掉大约1至2个标准差，并表明该基因在甜菊醇糖苷转运和/或生产中具有作用，并表明该基因在甜菊醇糖苷转运和/或生产中具有作用(表10)。与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，每种甜菊醇糖苷的总产量在0.85和1.15之间。表10显示了满足选择标准的每种候选物的上清液/总量比例。[0236]表9.与包含编码ggpps、截短的cdps、ks、ko、atr2、eugt11、srkahe1、cpr8、ugt85c2、ugt74g1、ugt76g1和eugt11多肽之基因的额外拷贝的对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，reba、rebb、rebd或rebm减少超过40％的转运相关基因。[0237][0238][0239]表10.与包含编码ggpps、截短的cdps、ks、ko、atr2、eugt11、srkahe1、cpr8、ugt85c2、ugt74g1、ugt76g1和eugt11多肽之基因的额外拷贝的对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，reba、rebb、rebd或rebm减少20-40％的转运相关基因。[0240][0241]ydl210w(seqidno：25)和ypl270w(seqidno：79)的敲除导致在包含编码ggpps、截短的cdps、ks、ko、atr2、eugt11、srkahe1、cpr8、ugt85c2、ugt74g1、ugt76g1和eugt11多肽之基因的对照甜菊醇糖苷生产菌株和包含编码ggpps、截短的cdps、ks、ko、atr2、eugt11、srkahe1、cpr8、ugt85c2、ugt74g1、ugt76g1和eugt11多肽之基因的额外拷贝的甜菊醇糖苷生产菌株中rebd分泌降低。同样的，yjl212c(seqidno：47)和yol122c(seqidno：68)的敲除导致在这两种菌株中rebm转运降低。[0242]实施例4.通过在rebd/m生产菌株中过表达确认酵母内源转运基因的敲除[0243]使用基于质粒的表达和整合盒二者进行来自实施例3的初始候选转运蛋白的亚组的过表达。首先，进行深孔微量滴定板培养实验。使用质粒在rebd/m生产菌株中过表达两个转运基因以确认敲除实验的结果。过表达ygr181w(seqidno：38)，其是tim复合物，插入线粒体内膜蛋白的辅助蛋白；以及过表达ydr061w(seqidno：26)，其是abc样转运蛋白。图2中所示的数据证明，用深孔板中的ygr181w(seqidno：38)和ydr061w(seqidno：26)的基于质粒的过表达表型证实了基于敲除研究的表型。[0244]接下来，在另外的甜菊醇糖苷生产菌株中进行发酵罐中的表型确认，所述菌株通过染色体xii上的ygr181w(seqidno：38)或ydr061w(seqidno：26)的整合来表征。在30℃下使甜菊醇糖苷生产菌株在限定培养基上在葡萄糖受限条件下在补料分批发酵中生长约5天，并使用lc-ms(方法b，实施例1)测量reba、rebb、rebd和rebm的水平。图3a-3b中所示的图表显示了在新的整合构建体的培养基中转运的rebd和rebm大约增加2倍，并且reba和rebb转运几乎没有变化。ygr181w(seqidno：38)或ydr061w(seqidno：26)的过表达导致rebd和rebm向培养基中转运的提高(约2倍)(在ygr181w(seqidno：38)和ydr061w(seqidno：26)过表达菌株中约400-500mg/l的上清液rebd和rebm，相对于对照甜菊醇糖苷生产菌株中约250mg/l的上清液rebd和rebm)。参见图3a。转运的rebd相比于总rebd的比例从对照菌株中的0.158增加至在候选基因过表达时的0.21-0.25。rebm向培养基中的转运也同时改善。参见图3b。[0245]实施例5.所选酵母内源转运基因的过表达[0246]使用具有表11中所示的转运蛋白基因的组成型启动子的质粒在甜菊醇糖苷生产菌株(如实施例2所述)中的过表达导致reba、rebb、rebd和/或rebm的分泌增加超过20％。使用实施例3中描述的标准2分析结果。另外，表12中所示的转运蛋白基因的过表达导致reba、rebb、rebd和/或rebm产量提高超过40％。表11显示了满足选择标准的每个候选物的上清液/总量比例。[0247]表11.与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，reba、rebb、rebd或rebm分泌增加超过20％的转运相关基因。[0248][0249][0250]表12.与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，reba、rebb、rebd或rebm产量增加超过40％的转运相关基因。[0251][0252][0253]实施例6.转运蛋白基因的基因组整合[0254]通过pcr从s288c背景中扩增所选择的用于整合到生产rebd/m的酿酒酵母菌株(参见实施例2)之基因组中的转运蛋白基因dna，并使用user克隆系统克隆到具有用于整合位点的同源区和用于过表达的pgk1启动子的质粒中。参见例如，nour-eldi等，2010，methodsmolbiol.643：185-200。使用限制酶从质粒中切出包含同源区域和转运蛋白的user克隆构建体，并通过标准liac方法将线性片段dna整合到生产菌株的接受rebd/m的基因组中。在添加生长培养基后从聚合物释放葡萄糖的平板中测试基因组上整合的转运蛋白。使用在3天内释放20g/l葡萄糖的聚合物来模拟发酵期间的进料特征。通过lc-ms(参见实施例1)测量甜菊醇糖苷水平，并在perkinelmer2104multilabel读数器上测量od600。ybr043c(seqidno：88)、yel027w(seqidno：102)、yjl093c(seqidno：44)、yjr106w(seqidno：48)、ykl120w(seqidno：126)和ymr166c(seqidno：132)表现出13-sg分泌提高。(图4a)。ybr043c(seqidno：88)、yel027w(seqidno：102)和ymr166c(seqidno：132)表现出reba分泌提高(图4b)。ybr043c(seqidno：88)、yel027w(seqidno：102)和ymr166c(seqidno：132)表现出rebb分泌提高(图4c)。seqidno：88的ybr043c、seqidno：102的yel027w、seqidno：44的yjl093c、seqidno：48的yjr106w和seqidno：132的ymr166c表现出rebd产量提高，并且seqidno：88的ybr043c、seqidno：102的yel027w、yil166c(seqidno：121)、seqidno：44的yjl093c、seqidno：48的yjr106w和seqidno：132的ymr166c表现出rebm产量提高，如通过与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比上清液中rebd和rebm水平的增加所测量。参见图4d和4e。具有ura标志物的对照也显示在图4a-4e中。[0255]图5a显示通过user克隆系统过表达ymr166c(seqidno：132)、yel027w(seqidno：102)、ykl120w(seqidno：126)、yjr106w(seqidno：48)、yjl093c(seqidno：44)和ybr043c(seqidno：88)的另外的甜菊醇糖苷生产菌株的reba、rebb、rebd和rebm的上清液水平。图5a-5b的菌株包含：编码聚球藻属ggpps多肽的重组基因(seqidno：1，seqidno：149)；编码截短的玉蜀黍(zeamays)的cdps多肽的重组基因(seqidno：2，seqidno：150)；编码拟南芥ks多肽的重组基因(seqidno：3，seqidno：151)；编码重组的甜叶菊ko1多肽的重组基因(seqidno：4，seqidno：152)；编码ko多肽的重组基因(seqidno：xx，seqidno：xx)；编码拟南芥atr2多肽的重组基因(seqidno：5，seqidno：153)；编码稻eugt11多肽的重组基因(seqidno：12；seqidno：148)；编码srkahe1多肽的重组基因(seqidno：6，seqidno：154)；编码甜叶菊cpr8多肽的重组基因(seqidno：7，seqidno：155)；编码甜叶菊ugt85c2多肽的重组基因(seqidno：8，seqidno：156)；编码甜叶菊ugt74g1多肽的重组基因(seqidno：9，seqidno：157)；编码甜叶菊ugt76g1多肽的重组基因(seqidno：10，seqidno：158)；和编码甜叶菊ugt91d2变体(或功能同源物)，ugt91d2e-b多肽的重组基因(seqidno：11，seqidno：159)。图5b显示通过user克隆系统过表达ymr166c(seqidno：132)、yel027w(seqidno：102)、ykl120w(seqidno：126)、yil166c(seqidno：132)、yjr106w(seqidno：48)、yjl093c(seqidno：44)和ybr043c(seqidno：88)的上述甜菊醇糖苷生产菌株的reba、rebb、rebd和rebm的总水平。[0256]实施例7.通过过表达yjl093c或ybr043c的生产甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株的发酵生产rebd和rebm[0257]在实施例3中所述的甜菊醇糖苷生产菌株中单独过表达yjl093c(seqidno：44)和ybr043c(seqidno：88)。通过发酵(补料分批，基本培养基，葡萄糖限制)培养菌株约130小时。通过lc-ms测量rebd和rebm的产量。如表13中所示，与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，过表达yjl093c或ybr043c的菌株生产更高水平的rebd和rebd+rebm。[0258]表13.过表达yjl093c和ybr043c的酿酒酵母菌株中rebd和rebm的产量。[0259][0260]表14.本文中公开的序列。[0261]seqidno：1[0262]聚球藻属ggpps(genbankabc98596.1)[0263][0264]seqidno：2[0265]玉蜀黍截短的cdps[0266][0267]seqidno：3[0268]拟南芥(arabidopsisthaliana)ks(与genbankaee36246.1相似)[0269][0270]seqidno：4[0271]甜叶菊ko1(密码子优化的)[0272][0273]seqidno：5[0274]拟南芥atr2(密码子优化的)[0275][0276]seqidno：6[0277]甜叶菊kahe1(密码子优化的)[0278][0279]seqidno：7[0280]甜叶菊cpr8[0281][0282][0283]seqidno：8[0284]甜叶菊ugt85c2(密码子优化的)[0285][0286]seqidno：9[0287]甜叶菊ugt74g1(genbankaar06920.1)[0288][0289]seqidno：10[0290]甜叶菊ugt76g1(密码子优化的)[0291][0292][0293]seqidno：11[0294]甜叶菊ugt91d2e-b(密码子优化的)[0295][0296]seqidno：12[0297]编码eugt11的稻(oryzasativa)序列(密码子优化的)[0298][0299]seqidno：13[0300]ybr180w[0301]＞sp|p38125|dtr1_yeast二酪氨酸转运蛋白1os＝酿酒酵母(菌株atcc204508/s288c)gn＝dtr1pe＝1sv＝1[0302][0303]seqidno：14[0304]yal067c[0305]＞sp|p39709|seo1_yeast可能的转运蛋白seo1os＝酿酒酵母(菌株atcc204508/s288c)gn＝seo1pe＝1sv＝1[0306][0307]seqidno：15[0308]ybld89w[0309]＞sp|p38176|avt5_yeast液泡氨基酸转运蛋白5os＝酿酒酵母(菌株atcc204508/s288c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r06920.1)[0872][0873]seqidno：158[0874]甜叶菊ugt76g1[0875][0876]seqidno：159[0877]甜叶菊ugt91d2e-b[0878][0879]seqidno：160[0880][0881]seqidno：161[0882][0883]已经详细地并通过参考其具体实施方案描述了本发明，明显的是，在不脱离所附权利要求中限定的本发明的范围的情况下，修改和变化是可能的。更具体地，尽管本发明的一些方面在本文中被认为是特别有利的，但是预期本发明不必限于本发明的这些特定方面。[0884]以下内容对应于母案申请中的原始权利要求书，现作为说明书的一部分并入此处：[0885]1.能够合成甜菊醇糖苷的重组宿主，其包含编码转运蛋白多肽的基因和/或编码调节至少一种转运蛋白基因表达的转录因子多肽的基因；[0886]其中所述编码转运蛋白多肽的基因和/或所述编码调节至少一种转运蛋白基因表达的转录因子多肽的基因之表达被修饰，并且所述重组宿主将至少一部分合成的甜菊醇糖苷从所述宿主转运到培养基中。[0887]2.项1所述的重组宿主，其中所述编码转运蛋白多肽的基因是内源基因。[0888]3.项1或2中任一项所述的重组宿主，其中所述转运蛋白多肽包括atp结合盒(abc)转运蛋白、主要促进子超家族(mfs)转运蛋白、氨基酸/生长素通透酶(aaap)家族转运蛋白、idno：111中所示的ygl114w，seqidno：112中所示的ygl167c，seqidno：36中所示的ygl255w，seqidno：37中所示的ygr125w，seqidno：38中所示的ygr181w，seqidno：39中所示的ygr217w，seqidno：40中所示的ygr224w，seqidno：113中所示的ygr257c，seqidno：41中所示的ygr281w，seqidno：42中所示的yhl016c，seqidno：114中所示的yhl035c，seqidno：115中所示的yhl036w，seqidno：116中所示的yhr002w，seqidno：117中所示的yhr096c，seqidno：118中所示的yil006w，seqidno：43中所示的yil088c，seqidno：119中所示的yil120w，seqidno：120中所示的yil121w，seqidno：121中所示的yil166c，seqidno：44中所示的yjl093c，seqidno：45中所示的yjl094c，seqidno：46中所示的yjl108c，seqidno：122中所示的yjl133w，seqidno：47中所示的yjl212c，seqidno：123中所示的yjl219w，seqidno：48中所示的yjr106w，seqidno：49中所示的yjr160c，seqidno：124中所示的ykl016c，seqidno：125中所示的ykl050c，seqidno：50中所示的ykl064w，seqidno：126中所示的ykl120w，seqidno：127中所示的ykl146w，seqidno：128中所示的ykl209c，seqidno：129中所示的ykr039w，seqidno：51中所示的ykr050w，seqidno：52中所示的ykr105c，seqidno：53中所示的ykr106w，seqidno：130中所示的ylr411w，seqidno：54中所示的ylr447c，seqidno：131中所示的yml038c，seqidno：55中所示的yml116w，seqidno：56中所示的ymr034c，seqidno：57中所示的ymr056c，seqidno：132中所示的ymr166c，seqidno：58中所示的ymr253c，seqidno：133中所示的ymr279c，seqidno：134中所示的ynl003c，seqidno：59中所示的ynl065w，seqidno：60中所示的ynl070w，seqidno：61中所示的ynl083w，seqidno：62中所示的ynl095c，seqidno：63中所示的ynl121c，seqidno：64中所示的ynl142w，seqidno：135中所示的ynl268w，seqidno：136中所示的ynr055c，seqidno：65中所示的yol020w，seqidno：66中所示的yol075c，seqidno：67中所示的yol077w-a，seqidno：68中所示的yol122c，seqidno：137中所示的yol158c，seqidno：69中所示的yor079c，seqidno：70中所示的yor087w，seqidno：71中所示的yor092w，seqidno：138中所示的yor100c，seqidno：72中所示的yor130c，seqidno：139中所示的yor153w，seqidno：73中所示的yor222w，seqidno：140中所示的yor271c，seqidno：141中所示的yor273c，seqidno：74中所示的yor291w，seqidno：75中所示的yor306c，seqidno：142中所示的yor307c，seqidno：76中所示的yor316c，seqidno：143中所示的yor332w，seqidno：77中所示的yor334w，seqidno：144中所示的yor348c，seqidno：145中所示的ypl036w，seqidno：78中所示的ypl078c，seqidno：79中所示的ypl270w，seqidno：80中所示的ypl274w，seqidno：81中所示的ypr003c，seqidno：82中所示的ypr011c，seqidno：83中所示的ypr058w，seqidno：84中所示的ypr128c，或seqidno：85中所示的ypr201w。[0895]8.项1-7中任一项所述的重组宿主，其中以下序列得到过表达：seqidno：88中所示的ybr043c，seqidno：95中所示的ydl100c，seqidno：94中所示的ydl054c，seqidno：22中所示的ydl128w，seqidno：146中所示的ydl198c，seqidno：26中所示的ydr061w，seqidno：30中所示的ydr536w，seqidno：102中所示的yel027w，seqidno：147中所示的yfl054c，seqidno：112中所示的ygl167c，seqidno：38中所示的ygr181w，seqidno：42中所示的yhl016c，seqidno：121中所示的yil166c，seqidno：44中所示的yjl093c，seqidno：48中所示的yjr106w，seqidno：126中所示的ykl120w，seqidno：127中所示的ykl146w，seqidno：129中所示的ykr039w，seqidno：56中所示的ymr034c，seqidno：132中所示的ymr166c，seqidno：68中所示的yol122c，seqidno：69中所示的yor079c，seqidno：79中所示的ypl270w，和/或seqidno：82中所示的ypr011c。[0896]9.项1-8中任一项所述的重组宿主，其还包含：[0897](a)编码蔗糖转运蛋白和蔗糖合酶的一种或更多种基因；[0898](b)编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(ggpps)多肽的基因；[0899](c)编码e型-柯巴基二磷酸合酶(cdps)多肽的基因；[0900](d)编码贝壳杉烯合酶(ks)多肽的基因；[0901](e)编码贝壳杉烯氧化酶(ko)多肽的基因；[0902](f)编码甜菊醇合酶(kah)多肽的基因；[0903](g)编码细胞色素p450还原酶(cpr)多肽的基因；[0904](h)编码ugt85c2多肽的基因；[0905](i)编码ugt76g1多肽的基因；[0906](j)编码ugt74g1多肽的基因；[0907](k)编码ugt91d2功能同源物的基因；和/或[0908](l)编码eugt11多肽的基因；[0909]其中所述基因中的至少一个是重组基因；并且[0910]其中所述宿主能够生产reba、rebb、rebd和/或rebm中的一种或更多种。[0911]10.项9所述的重组宿主，其中所述基因中的至少一个被密码子优化以用于在所述宿主中表达。[0912]11.项10所述的重组宿主，其中所述基因中的至少一个被密码子优化以用于在酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)中表达。[0913]12.项9所述的重组宿主，其中：[0914](a)所述ggpps多肽包含与seqidno：149中所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；[0915](b)所述cdps多肽包含与seqidno：150中所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；[0916](c)所述ko多肽包含与seqidno：152中所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；[0917](d)所述ks多肽包含与seqidno：151中所示的氨基酸序列具有至少40％同一性的多肽；[0918](e)所述kah多肽包含与seqidno：154中所示的氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽；[0919](f)所述cpr多肽包含与seqidno：153中所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽和/或与seqidno：155中所示的氨基酸序列具有至少65％同一性的多肽；[0920](g)所述ugt85c2多肽包含与seqidno：156中所示的氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽；[0921](h)所述ugt76g1多肽包含与seqidno：158中所示的氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽；[0922](i)所述ugt74g1多肽包含与seqidno：157中所示的氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽；[0923](j)所述ugt91d2功能同源物包含与seqidno：159中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的ugt91d2e-b多肽；和[0924](k)所述eugt11多肽包含与seqidno：148中所示的氨基酸序列具有至少65％同一性的多肽。[0925]13.项1-12中任一项所述的重组宿主，其中所述重组宿主包含以下微生物：植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞或细菌细胞。[0926]14.项13所述的重组宿主，其中所述细菌细胞包含埃希氏菌属(escherichia)细菌细胞，乳杆菌属(lactobacillus)细菌细胞，乳球菌属(lactococcus)细菌细胞，棒状杆菌属(cornebacterium)细菌细胞，醋杆菌属(acetobacter)细菌细胞，不动杆菌属(acinetobacter)细菌细胞或假单胞菌属(pseudomonas)细菌细胞。[0927]15.项13所述的重组宿主，其中所述真菌细胞是酵母细胞。[0928]16.项15所述的重组宿主，其中所述酵母细胞是来自酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)、光滑念珠菌(candidaglabrata)、棉阿舒囊霉(ashbyagossypii)、产朊假丝酵母(cyberlindnerajadinii)、巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)、多形汉逊酵母(hansenulapolymorpha)、博伊丁念珠菌(candidaboidinii)、arxulaadeninivorans、红发夫酵母(xanthophyllomycesdendrorhous)或白色念珠菌(candidaalbicans)物种的细胞。[0929]17.项16所述的重组宿主，其中所述酵母细胞是酵母菌(saccharomycete)。[0930]18.项17所述的重组宿主，其中所述酵母细胞是来自酿酒酵母物种的细胞。[0931]19.生产甜菊醇糖苷的方法，其包括：[0932](a)在表达项1至18中任一项所讨论的基因的条件下，在培养基中培养项1-18中任一项所述的重组宿主，[0933]其中所述甜菊醇糖苷由所述宿主合成；以及[0934](b)任选地分离所述甜菊醇糖苷。[0935]20.项19所述的方法，其中所述甜菊醇糖苷是reba、rebb、rebd和/或rebm，并且其中：[0936](a)reba能够在表达ugt85c2、ugt76g1、ugt74g1和ugt91d2的项1-18中任一项所述的重组宿主中合成；[0937](b)rebb能够在表达ugt85c2、ugt76g1和ugt91d2的项1-18中任一项所述的重组宿主中合成；[0938](c)rebd能够在表达ugt85c2、ugt76g1、ugt74g1以及ugt91d2和/或eugt11的项1-18中任一项所述的重组宿主中合成；和(d)rebm能够在表达ugt85c2、ugt76g1、ugt74g1以及ugt91d2和/或eugt11的项1-18中任一项所述的重组宿主中合成。[0939]21.项19或20所述的方法，其中编码以下序列的基因过表达：seqidno：88中所示的ybr043c，seqidno：95中所示的ydl100c，seqidno：94中所示的ydl054c，seqidno：22中所示的ydl128w，seqidno：146中所示的ydl198c，seqidno：26中所示的ydr061w，seqidno：30中所示的ydr536w，seqidno：102中所示的yel027w，seqidno：147中所示的yfl054c，seqidno：112中所示的ygl167c，seqidno：38中所示的ygr181w，seqidno：42中所示的yhl016c，seqidno：121中所示的yil166c，seqidno：44中所示的yjl093c，seqidno：48中所示的yjr106w，seqidno：126中所示的ykl120w，seqidno：127中所示的ykl146w，seqidno：129中所示的ykr039w，seqidno：56中所示的ymr034c，seqidno：132中所示的ymr166c，seqidno：68中所示的yol122c，seqidno：69中所示的yor079c，seqidno：79中所示的ypl270w，和/或seqidno：82中所示的ypr011c。[0940]22.项19-21中任一项所述的方法，其中所述甜菊醇糖苷以约500mg/l至约10,000mg/l的浓度生产。[0941]23.使甜菊醇糖苷的生产或向培养基中的转运增加的方法，其包括：[0942](a)在表达项1至18中任一项所讨论的基因的条件下，在培养基中培养项1-18中任一项所述的重组宿主，[0943]其中所述甜菊醇糖苷由所述宿主合成；以及[0944](b)任选地分离所述甜菊醇糖苷。[0945]24.项23所述的方法，其中所述甜菊醇糖苷是reba、rebb、rebd和/或rebm。当前第1页12当前第1页12