SMN1基因拷贝数变异检测试剂盒的制作方法

smn1基因拷贝数变异检测试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种smn1基因拷贝数变异检测试剂盒。


背景技术：

2.脊髓肌萎缩症(sma)是一种常染色体隐性、渐进性神经退行性疾病，主要表现为脊髓腹侧灰角的神经元细胞变性导致的对称性肌无力和肌萎缩。sma的发病率约为万分之一，是导致婴儿遗传死亡的最常见原因之一，而中国人群sma致病基因的携带者频率是1/42。根据发病年龄和临床表现的严重程度，sma可分为三种类型：ⅰ型病称为严重型，出生后6个月内发病，患儿无法坐立，通常在两岁以内死亡；ⅱ型又称为中间型，出生后6-18个月内发病，患儿无法站立和行走，存活期视呼吸道并发症的情况而定；ⅲ型病于出生18个月后发病，患儿能独立行走，病情进展缓慢，可存活至成年。
3.运动神经元存活基因smn1和smn2是与sma相关的两个重要基因。其中smn1是合成运动神经蛋白的关键基因，其7号外显子纯合及杂合缺失是sma的主要病因。两位sma携带者(杂合缺失)的结合是诞生sma患者可能性最大的情况，因此婚前或孕前检查是非常必要的。对smn1基因拷贝数的检测是预防及诊断sma最准确的方法之一。
4.目前smn1基因常用的检测包括限制性片段长度多态性分析(pcr-rlfp)、多重探针连接扩增技术(mlpa)、实时荧光定量pcr、变性高效液相色谱(dhplc)等检测方法。这些方法虽然能定性检测出smn1基因的缺失，但不能对拷贝数进行绝对定量。
5.(1)限制性片段长度多态性分析(pcr-rlfp)，首先对smn1基因进行pcr扩增，然后对扩增产物进行酶切处理。smn1和smn2基因间的碱基差导致其限制性酶切位点不同，根据酶切后电泳条带的位置变化即可判断smn1基因是否存在缺失。该方法简单易行，因而一直沿用，但由于该方法通过电泳位置进行诊断，无法检测基因拷贝数变化，因此无法检出仅含有1个smn1基因的sma携带者。
6.(2)多重探针连接扩增技术(mlpa)，针对靶序列设计一对特异性探针，当dna双链变性解旋后，两探针与单链靶基因上相邻位点互补杂交，并通过特定的dna连接酶结合探针，保证探针分子可以发生特异性扩增并相互连接成一条完整的核酸单链。通过毛细管电泳结合软件分析峰形图即可判断靶基因的拷贝数异常或突变。该技术特异性强、灵敏度高，检测的同时还可实现定量分析。但其操作繁琐，耗时较长，成本高昂，同时对技术人员的操作能力和分析水平均有较高要求。
7.(3)实时荧光定量pcr，pcr扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭剂。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭剂吸收；pcr扩增时，根据fret原理，taq酶的5’端-3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭剂分离，荧光监测系统可接收到荧光信号，荧光信号的累积与基因模板的拷贝数相关。该方法与mlpa结果的准确性和灵敏度相近且操作更简单，但定量检测时依赖标准曲线，定量准确性较差且容易出现假阳性。
8.(4)变性高效液相色谱(dhplc)，有两种常用的检测模式。一是半变性模式检测基因突变，半变性突变检测原理是基于未解链的和部分解链的双链在部分失活条件下具有不同保留时间的性质，即由于同源双链和异源双链在其解链特征的差异，使得它们在色谱柱中的保留时间不同而得以区分。二是非变性模式检测片段大小，检测原理是在不变性温度条件下，高效液相色谱仪类似于凝胶电泳仪，可分离分子量不同的双链分子，但其灵敏度远远高于凝胶电泳，这种模式下的检测类似于限制性长度多态性分析。dhplc的灵敏度和通量较高，且通过峰形图借助内标基因可以进行准确定量，但由于实验流程同时涉及了dna变性和复性的pcr扩增和液相检测，流程时间过长，且对pcr的循环数要求进行精确的控制。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于提供了一种基于数字pcr平台，快速定性检测人脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，sma)关键致病基因，运动神经元存活基因smn1第7外显子缺失的方法、引物、探针及其试剂盒。
10.在本发明的第一方面，提供了一种用于检测smn1基因拷贝数变异的引物对集，所述引物对集包括：
11.第一引物对，所述第一引物对包括如seq id no.1所示的正向引物；以及，如seq id no.2所示的反向引物。
12.在另一优选例中，所述引物对集还包括：
13.第二引物对，所述第二引物对组包括如seq id no.3所示的正向引物；和，如seq id no.4所示的反向引物。
14.本发明的第二方面，提供了一种检测smn1基因拷贝数变异的探针集，所述探针集包括：seq id no.5所示的第一探针。
15.在另一优选例中，所述探针集还包括：seq id no.6所示的第二探针。
16.在另一优选例中，所述第一探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述第一探针的3’端包含有荧光淬灭基团。
17.在另一优选例中，所述第二探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述第二探针的3’端包含有荧光淬灭基团。
18.在另一优选例中，所述第一探针标记的荧光报告基团不同于所述第二探针标记的荧光报告基团。
19.本发明的第三方面，提供了一种用于检测smn1基因拷贝数变异的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对集。
20.在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针集。
21.在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、和seq id no.6所示的多核苷酸序列。
22.在另一优选例中，所述试剂盒包括第二容器，所述第二容器内包含数字pcr预混液；优选地，所述数字pcr预混液包含选自下组的一种或多种组分：dntp混合物、热启动taq酶、rnase抑制剂。
23.在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含阳性对照。
24.在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含阴性对照。优选地，所述阴性对照为正常人全血dna。
25.本发明的第四方面，提供了一种检测smn1基因拷贝数变异的方法，所述方法包括步骤：
26.(1)提供待检测对象的核酸样本；
27.(2)制备数字pcr反应体系并进行数字pcr检测：
28.其中，所述数字pcr反应体系包括：步骤(1)制备的核酸样本、本发明第一方面所述的引物对集、和本发明第二方面所述的探针集。
29.在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的检测方法，例如针对实验室培养的突变细胞细胞株或动物模型进行检测分析，以供新药研发使用。
30.在另一优选例中，所述数字pcr反应体系还包括阳性质控品，和/或阴性质控品。
31.本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对集、和/或本发明第二方面所述的探针集的用途，用于制备数字pcr检测试剂盒，所述数字pcr检测试剂盒用于检测smn1基因拷贝数变异。
32.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
33.图1：本发明检测sma阴性对照的dpcr结果示意图；
34.图2：本发明检测sma阳性对照的dpcr结果示意图；
35.图3：本发明检测sma携带者样本dna模板的dpcr结果示意图；
36.图4：本发明检测sma患者样本dna模板的dpcr结果示意图。
具体实施方式
37.本发明人通过广泛而深入的研究，开发了一种基于数字pcr平台，快速定性检测人脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，sma)关键致病基因，运动神经元存活基因smn1第7外显子缺失的方法、引物、探针及其试剂盒，实验结果表明本发明的检测体系具有极高的灵敏度和准确性。
38.在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
39.除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
40.虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
41.数字pcr(digital pcr，dpcr)
42.数字pcr(digital pcr，dpcr)，dpcr能实现核酸分子的绝对定量，在检测核酸时具有较高的灵敏度、特异性及准确度。其通过物理或化学分割的方式，将一个荧光pcr反应体系分配到上万个微小的反应器中，在每个微反应器中包含或不包含1个或多个拷贝的目标核酸分子，进行“单分子模板pcr扩增”。扩增结束后，通过阳性反应单元的数目和统计学方法计算原始样本中靶基因的拷贝数。该方法具有灵敏度高，抗干扰能力强，检测结果稳定，不依赖标准曲线进行绝对定量等优点。
43.但是，由于数字pcr的灵敏度极高，因此对检测体系中引物探针组合的特异性要求很高，引物探针组合的设计难度较大。
44.多重pcr
45.多重pcr(multiplex pcr)，又称多重引物pcr或复合pcr，它是在同一pcr反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的pcr反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般pcr相同。
46.影响多重pcr反应的因素有很多，比如：
47.(1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是dna聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。
48.(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。
49.(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行pcr反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。
50.(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方dna介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。
51.虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。
52.本发明提供了一种基于数字pcr平台，快速定性检测人脊髓性肌萎缩症(sma)相关基因，运动神经元存活基因smn1第7外显子的纯合及杂合缺失的方法、引物、探针及其试剂盒，具有实验过程简单、时间短、通量大等优点。
53.在本发明的一个优选地实施方式中，本发明公开了一种定性检测人脊髓性肌萎缩症(sma)关键致病基因，运动神经元存活基因smn1第7外显子的纯合及杂合缺失的多重引物组，包括：
54.检测smn1的上游引物核苷酸序列如seq id no.1所示，检测smn1的下游引物核苷酸序列如seq id no.2所示；检测krit1内控基因的上游引物核苷酸序列如seq id no.3所示，检测krit1内控基因的下游引物核苷酸序列如seq id no.4所示。
55.本发明公开了一种定性检测人脊髓性肌萎缩症(sma)关键致病基因，运动神经元存活基因smn1第7外显子的纯合及杂合缺失的探针：
56.包括检测smn1基因的探针和检测内控基因krit1的探针；所述检测smn1基因的探
针的核苷酸序列如seq id no.5；检测内控基因krit1的探针核苷酸序列如seq id no.6所示。
57.进一步，所述seq id no.5核苷酸序列的5’端标记有fam、3’端标记有bhq1；所述seq id no.6核苷酸序列的5’端标记有vic、3’端标记有mgb。
58.优选地，所述上游引物在反应体系中的终浓度为1.0μmol/l，所述下游引物在反应体系中的终浓度为1.0μmol/l，所述smn1基因探针在反应体系中的终浓度为0.13μmol/l；所述内控上游引物在反应体系中的终浓度为1.0μmol/l，所述内控下游引物在反应体系中的终浓度为1.0μmol/l，所述内控探针在反应体系中的终浓度为0.17μmol/l。
59.所述smn1基因及内控的引物探针序列如下表1，
60.表1检测smn1基因的引物探针核苷酸序列信息：
[0061][0062]
上述pcr引物和标有不同类型荧光的探针可用于对smn1基因以及内控krit1基因进行检测，根据结果显示的荧光信号有无、smn1基因与内控krit1的拷贝数比例，能够准确检测smn1基因是否发生缺失，判断是否为sma患者或携带者。
[0063]
对样本是否为sma患者或携带者以拷贝数比值c判断:
[0064]
c(smn1)＝smn1基因拷贝数/(krit1内参基因拷贝数/2)。
[0065]
其中，c(smn1)为0时，代表为sma患者；c(smn1)为1时，代表为sma携带者；c(smn1)为2时，代表为正常人。
[0066]
利用上述特异性引物和探针所制备的试剂盒，可对smn1基因进行检测。
[0067]
因此，在本发明的一个优选地实施方式中，本发明还公开了一种smn1基因检测的试剂盒，所述试剂盒包括用于配制反应液的试剂：引物探针混合液、pcr反应预混液和对照品。其中，引物探针混合液包括如下成分，如表2。
[0068]
表2引物探针混合液
[0069][0070]
其中，所述用于检测smn1基因以及内控基因的引物与探针分别如下：
[0071]
所述检测smn1的上游引物核苷酸序列如seq id no.1所示，所述smn1的下游引物
核苷酸序列如seq id no.2所示；所述检测krit1内控基因的上游引物核苷酸序列如seq id no.3所示，所述检测krit1内控基因的下游引物核苷酸序列如seq id no.4所示；
[0072]
所述探针包括检测smn1基因的探针和内控基因krit1探针；所述检测smn1基因的探针的核苷酸序列如seq id no.5；所述内控基因krit1的探针核苷酸序列如seq id no.6所示。
[0073]
进一步，所述seq id no.5核苷酸序列的5’端标记有fam、3’端标记有bhq1；所述seq id no.6核苷酸序列的5’端标记有vic、3’端标记有mgb。
[0074]
检测smn1基因时，smn1基因的探针与上下游引物分别与所扩增的目的片段结合，释放fam荧光信号；内控基因的探针与上下游引物是根据人管家基因保守片段设计并合成的，与目的片段结合后释放vic荧光信号，用于smn1基因的检测；
[0075]
所述pcr反应预混液包括如下成分，如表3：
[0076]
表3 pcr反应预混液
[0077][0078]
所述对照品包括如下成分，如表4：
[0079]
表4对照品
[0080][0081]
所述阳性对照中含有：
[0082]
smn1基因的人工合成的dna片段1：
[0083]
aaagtacattaaaagactatcaacttaatttctgatcatattttgttgaataaaataagtaaaatgtcttgtgaaacaaaatgctttttaacatccatataaagctatctatatatagctatctatgtctatatagctattttttttaacttcctttattttccttacagggtttcagacaaaatcaaaaagaaggaaggtgctcacattccttaaattaaggagtaagtctgccagcattatgaaagtgaatcttacttttgtaaaactttatggtttgtggaaaacaaatgtttttgaacattt(seq id no.11)
[0084]
krit1内控基因的人工合成的dna片段2：
[0085]
aaattcttcttattccccttaaattcacttttctttttccacacctactttcttctttccctcaaacatgcatgattctcttccttcttgaaagttgctttcacctgaacctacttcttttagctaccatcctgtttctttccttcctttcacagccagatttcaaaggtgagtgggagacacactctgctttctctttttcactcttcataaaccttaactttttctgagtttttgatctgtttccctgctctgcagcatttaattcttgactacttttcattttaagaacaaat
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[0086]
本发明所述试剂盒适用样本为人全血、口腔拭子核酸。
[0087]
本发明所述试剂盒用于判定检测有效性的标准为：每次检测均设置阴性对照组和阳性对照组，当检测结果的阳性对照组为阳性，且阴性对照组为阴性时，表明实验结果有效。
[0088]
本发明所述试剂盒的检测灵敏度可以达到0.1ng/μl。
[0089]
在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提出一种smn1基因7号外显子缺失的快速定性检测的方法，该试剂盒基于数字pcr平台，使得检测体系可以直接对人全血、口腔拭子核酸样本进行检测，具体实施步骤包括：
[0090]
步骤一：待测样本dna模板提取及质量检测
[0091]
采集患者口腔拭子，或抽取患者全血不少于1ml置于edta或枸橼纳抗凝剂的采血管中，做好标记确保标签信息无误后，4℃保存。使用中山大学达安基因股份有限公司的核酸提取或纯化试剂(粤穗械备20170583号)，按照试剂盒说明书进行核酸提取；采用微量分光光度计(如nanodrop2000超微量分光光度计或其他分光光度计仪器)对提取后的核酸进行检测，核酸的纯度应满足a260/a280比值范围在1.8-2.2之间，浓度应不低于1ng/μl，模板核酸可直接用于后续实验或置于-80℃保存备用，避免反复冻融。
[0092]
步骤二：数字pcr反应体系制备
[0093]
取出试剂盒中的pcr反应预混液和引物探针混合液，室温融化，涡旋震荡混匀后离心10秒，配制pcr体系。pcr体系构成如表5，
[0094]
表5 smn1基因pcr体系
[0095][0096][0097]
所述引物探针的核苷酸序列信息分别如下表6：
[0098]
表6检测smn1基因的引物探针核苷酸序列信息：
[0099][0100]
步骤三、加样
[0101]
取步骤一所制备的样本dna模板5μl及试剂盒中的各对照样本5μl，加样至步骤二
配制的pcr反应体系的八连管中，使每管dpcr反应液的总体积为15μl；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒，用于制备微反应；所述试剂盒的对照样本如表7：
[0102]
表7试剂盒的对照样本
[0103][0104]
所述阴性对照为正常人全血dna，所述阳性对照为人工合成的smn1基因和内控基因dna片段的混合液。
[0105]
步骤四、制备微反应和pcr扩增
[0106]
取15μl配制的dpcr反应液，借助自动上样仪和封闭优化仪将其自动、均匀地细分成10000个纳升级的反应单元并直接pcr反应扩增。pcr扩增的热盖温度设定为100℃，体积为100μl，扩增程序如表8，
[0107]
表8 pcr扩增程序
[0108][0109][0110]
步骤五、结果读取及分析
[0111]
将八联管芯片用daan starrysky 10k生物阅读仪软件对扩增结果进行分析，对实验命名、荧光染料和基因名称和样品名称等信息进行设置。结果检测完成后，在软件界面内打开“数据分析”对结果进行分析，查看fam通道和vic通道荧光信号的值；通过阴性对照样本、阳性对照样本的参照及荧光信号的分布，可调节微反应信号阈值，基于泊松分布统计原理计算出各样本中靶标分子的拷贝数；根据目的基因与内控基因的拷贝数比例，判定待测样本目的基因是否发生缺失。
[0112]
在本发明的一个优选地实施方式中，数字pcr(daan starrysky 10k数字pcr平台)示例性检测步骤包括：
[0113]
1.处理待测样本并dna模板提取；优选地，待测样本为全血/口腔拭子样本提取后的核酸，并对样本核酸进行质量检测；
[0114]
2.将待测dna模板与pcr反应预混液和引物探针混合液混合，制备得到数字pcr反应体系，数字反应体系构成如表9，
[0115]
表9数字pcr反应体系
[0116]
成分用量
smn1基因引物探针混合液a1μlpcr反应预混液b9μldna模板5μl
[0117]
3.打开自动上样仪，从数字pcr微反应制备通用试剂盒中取出八联管芯片及微反应制备辅助器；
[0118]
4.打开八联管芯片的盖子，将微反应制备辅助器中的梳样平板(白色透明)插入到八连管芯片中，然后固定至自动上样仪上；
[0119]
5.将微反应制备辅助器中的推样器安置在自动上样仪上，关紧闩锁；
[0120]
6.吸取15μl pcr反应混合液至推样器的三角形尖端，注意避免产生气泡；
[0121]
7.按“开始”按钮使推样器将pcr反应混合液轻轻推至芯片上；
[0122]
8.松开闩锁，取下推样器和梳样平板，取出八联管芯片，观察并确认pcr反应液是否已均匀的涂抹在八联管中的芯片上(此时大部分的pcr反应液已进入芯片上的微反应室中)；
[0123]
9.打开封闭优化仪，将制备的载有pcr反应液的八联管芯片插入封闭优化仪卡槽中，关闭仓门，按“开始”按钮使残留在芯片表面的pcr反应混合液完全进入微反应室中，完成芯片的制备；
[0124]
10.芯片制备完成后，取出八联管芯片，观察芯片表面是否存在液体残留，若存在残留重复步骤9一次；
[0125]
11.将制备的芯片取出，加入235μl封闭液(使用前应震荡混匀)，盖紧管盖，置入pcr仪中进行扩增；
[0126]
12.pcr扩增的热盖温度设定为：100℃，体积为100μl，扩增程序如表10，
[0127]
表10 pcr扩增程序
[0128][0129]
13.用生物芯片阅读仪(daan starrysky 10k)和软件对扩增后的八连管芯片进行结果分析，对实验命名、荧光染料和基因名称和样品名称等信息进行设置；
[0130]
14.结果检测完成后，在软件界面内打开“数据分析”对结果进行分析，查看fam通道和vic通道荧光信号的值；通过阴性对照样本、阳性对照样本的参照及荧光信号的分布，可调节微反应信号阈值，基于泊松分布统计原理计算出各样本中靶标分子的拷贝数；
[0131]
15.根据目的基因与内控基因的拷贝数比例，判定待测样本目的基因是否发生缺失。
[0132]
本技术采用dpcr检测原理如下：数字pcr方法将dna样本分散到一个个独立分区中，使每个分区包含或不包含1个或多个模板分子，然后通过特异性引探对模板pcr扩增。数字pcr的探针含有荧光基团，在探针与特异性模板结合后即可根据fret原理放出荧光并被
仪器计入，最后根据泊松分布原理及荧光分区的数量与比例即可计算出目标模板的起始拷贝数或浓度。数字pcr可以对模板进行绝对定量，灵敏度和准确性很高，通量较大。由于数字pcr结果的判读仅判断有无扩增，不依赖ct值，对pcr反应抑制剂的耐受能力大大提高，不需要参考品和标准曲线就可以精确定量。
[0133]
本发明的有益效果在于：
[0134]
本发明提供了一种smn1基因定量检测的方法、引物、探针与试剂盒。
[0135]
本试剂盒优化了特异性引物探针，针对smn1基因第7外显子的缺失进行检测，并设计一套krit1内参基因检测系统。
[0136]
本发明具有过程优化简单、所需样本少、性能稳定高效、高准确性等优点，数据分析自动化，结果可实时观察。
[0137]
本发明适用于对sma的关键基因，smn1基因第7外显子的缺失进行检测，是sma疾病预防、诊断、治疗方案选择和预后分析最可靠的指标，是探索sma早期诊断的一条可行途径，值得推广应用。
[0138]
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国sambrook.j等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
[0139]
实施例1：试剂盒
[0140]
本实施例提供的一种smn1基因拷贝数变异检测试剂盒的组成成分、包装及数量(24反应/盒)，如表11：
[0141]
表11试剂盒的组成成分、包装及数量
[0142][0143][0144]
实施例2：灵敏度及最低检出率
[0145]
灵敏度参考品由smn1基因模板dna与krit1内控基因模板dna混合成c(smn1)为1的混合液，混合液的浓度分别为1ng/μl、0.5ng/μl、0.01ng/μl；其中，smn1基因模板dna和ktrit1基因模板dna分别来源于人工合成dna片段1、2；阳性对照为人工合成大片段1、2混合
成c(smn1)为1的混合液；阴性对照为正常人全血dna；
[0146]
取阴性对照、阳性对照各5μl、灵敏度参考品各15μl(3个平行反应孔)，加样至步骤二配制的dpcr反应体系的八连管中，使每管dpcr反应液总体积为15μl；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒，用于微反应制备；
[0147]
取15μl配制的dpcr反应液，借助自动上样仪和封闭优化仪将其自动、均匀地细分成10000个纳升级的反应单元并直接pcr反应扩增。
[0148]
pcr扩增的热盖温度设定为100℃，体积为100μl，反应条件如下：
[0149][0150]
将八联管芯片用daan starrysky 10k生物阅读仪软件对扩增结果进行分析，对实验命名、荧光染料和基因名称和样品名称等信息进行设置。结果检测完成后，在软件界面内打开“数据分析”对结果进行分析，查看fam通道和vic通道荧光信号的值；通过阴性对照样本、阳性对照样本的参照及荧光信号的分布，可调节微反应信号阈值，基于泊松分布统计原理计算出各样本中靶标分子的拷贝数；
[0151]
用dpcr系统对本发明的灵敏度和最低检出率进行检测，当上述灵敏度样本混合液浓度分别为1ng/μl、0.5ng/μl、0.01ng/μl时，理论c(smn1)为1，实际测得的c(smn1)如表12所示：
[0152]
表12灵敏度检测结果
[0153][0154]
试剂盒的灵敏度检测结果与理论值相符，表明引物与探针具有较高的灵敏度，灵敏度检测良好；当smn1基因模板与krit1基因模板混合的阳性样本浓度为0.1ng/μl时，dpcr系统可稳定检测出相应拷贝数比值c(smn1)，因此，本发明的可检出浓度为0.1ng/μl。
[0155]
实施例3：准确性
[0156]
根据所测得人工合成dna片段1、2的拷贝数，制备准确性参考品；
[0157]
将smn1基因模板dna与krit1基因dna按一定比例混合，制得拷贝数比值c(smn1)分别为1、0的混合液；其中，smn1基因模板dna和ktrit1基因模板dna分别来源于人工合成dna片段1、2；
[0158]
每种准确性参考品做2个重复实验，共4管；取smn1准确性参考品各5μl，加样至步骤二所配制的dpcr反应体系的八连管中，使得dpcr反应液的总体积为15μl；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒，用于微反应制备；
[0159]
取15μl配制的dpcr反应液，借助自动上样仪和封闭优化仪将其自动、均匀地细分成10000个纳升级的反应单元并直接pcr反应扩增。pcr扩增的热盖温度设定为100℃，体积为100μl，反应条件如下：
[0160][0161][0162]
将八联管芯片用daan starrysky 10k生物阅读仪软件对扩增结果进行分析，对实验命名、荧光染料和基因名称和样品名称等信息进行设置。结果检测完成后，在软件界面内打开“数据分析”对结果进行分析，查看fam通道和vic通道荧光信号的值；通过阴性对照样本、阳性对照样本的参照及荧光信号的分布，可调节微反应信号阈值，基于泊松分布统计原理计算出各样本中靶标分子的拷贝数；
[0163]
用dpcr系统对本发明试剂盒的准确性进行检测，得到结果如表13：
[0164]
表13准确性检测结果
[0165][0166]
根据上表所述结果，各质控品准确性的检测结果阳性率为100％，符合理论定性标准，表明本发明试剂盒的准确性检测符合要求。
[0167]
实施例4：临床应用
[0168]
采集50例健康人的口咽拭子，同时抽取这些健康人外周血不少于1ml置于edta或枸橼纳抗凝剂的采血管中，提供样本的50名健康人已进行一代测序检测，并且明确其sma基因型别；做好样本标记并确保标签信息无误，4℃保存。
[0169]
使用中山大学达安基因股份有限公司的核酸提取或纯化试剂(粤穗械备20170583号)，按照试剂盒说明书进行核酸提取；采用微量分光光度计(如nanodrop2000超微量分光光度计或其他分光光度计仪器)对提取后的核酸进行检测，核酸的纯度应满足a260/a280比值范围在1.8-2.2之间，浓度应不低于1ng/μl，模板核酸可直接用于后续实验或置于-80℃保存备用，避免反复冻融。
[0170]
取每个样本的dna模板5μl及试剂盒中对照样本各5μl，加样至步骤二配制的dpcr反应体系的八连管中，使每管dpcr反应液的总体积为15μl；盖紧八连管管盖，充分混匀，高
速离心10秒，用于微反应制备；
[0171]
取15μl配制的dpcr反应液，借助自动上样仪和封闭优化仪将其自动、均匀地细分成10000个纳升级的反应单元并直接pcr反应扩增。pcr扩增的热盖温度设定为100℃，体积为100μl，反应条件如下：
[0172][0173]
将八联管芯片用daan starrysky 10k生物阅读仪软件对扩增结果进行分析，对实验命名、荧光染料和基因名称和样品名称等信息进行设置。结果检测完成后，在软件界面内打开“数据分析”对结果进行分析，查看fam通道和vic通道荧光信号的值；通过阴性对照样本、阳性对照样本的参照及荧光信号的分布，可调节微反应信号阈值，基于泊松分布统计原理计算出各样本中靶标分子的拷贝数；
[0174]
检测结果为：50例口腔拭子、全血样本中，1例样本呈sma携带者，其余样本为正常人，所检结果与一代测序检测的结果一致性为100％。
[0175]
对比例1
[0176]
本发明人对运动神经元存活基因smn1第7外显子缺失的基因序列和内控基因序列，进行深入比对分析后，针对目标序列设计了数十对引物和数条探针，进行筛选验证。
[0177]
由于引物特异性差异、退火温度不一致、以及引物二聚体等原因，不同引物探针组的扩增效率差异较大，而且对于试剂盒检测灵敏度影响较大，很难获得较优的多重数字pcr扩增引物以及探针序列。
[0178]
本发明人通过大量的实验，对设计的引物和探针进行优化选择并验证，最终确定了可以用作检测smn1基因拷贝数变异的多重数字pcr扩增的引物、探针序列及其组合。
[0179]
实验中发现，即使在已经基本确定针对各目标核酸的引物对和探针序列的情况下，不同引物对组合进行多重扩增的效果也存在显著差异。
[0180]
例如，使用如下的对照引物对进行检测，其它检测步骤和条件同上述实施例：
[0181]
表14.对照引物探针组1：
[0182][0183]
表15.对照引物探针组2：
[0184][0185]
按照实施例2的方法进行灵敏度检测，对照引物探针组1检测结果如下：
[0186]
表16对照引物探针组1灵敏度检测结果
[0187][0188]
对照引物探针组2检测结果如下：
[0189]
表17对照引物探针组2灵敏度检测结果
[0190][0191]
结果表明对照引物探针组1中，针对smn1基因和内控krit1基因的扩增效率差异较大，计算的理论c(smn1)偏低，检测结果无法用于smn1基因拷贝数变异的判断。
[0192]
对照引物探针组2在高浓度核酸样本的检测中，可以用于smn1基因拷贝数变异的判断，但是在低浓度样本中，检测值和理论值差距较大。因此，检测灵敏度较差。
[0193]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。