一种筛选人类LncROR基因含量多态性的引物组及检测方法与流程

一种筛选人类lncror基因含量多态性的引物组及检测方法
技术领域
1.本发明涉及筛选人类lncror基因技术领域，具体地说就是一种筛选人类lncror基因含量多态性的引物组及检测方法。


背景技术：

2.快速、准确并且简便的基因多态性筛查方法一直受到广泛的重视。人类基因组是一个十分稳定的体系，不同的民族、群体和个体都有46条染色体，有相同数目的基因和基因分布，也有基本相同的核苷酸序列。正是基因组结构的这种稳定性保证了人类作为一个物种的共同性和稳定性，也决定了目前基因组测定是有意义的，即有代表性的。
3.长链非编码rna(longnon-codingrna，lncrna)是长度大于200个核苷酸的非编码rna。研究表明，lncrna在剂量补偿效应(dosagecompensationeffect)、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用，成为遗传学研究热点。
4.其中，lncror1被认为是个非常有潜力的靶点，因为它作为酪氨酸激酶受体，具有可药性；其次，它在细胞表面表达；更重要的是，它在肿瘤细胞中高度表达，而在成人健康组织中表达量很低。目前有多家公司在开发靶向ror1的抗癌疗法，其中包括单克隆抗体、抗体偶联药物(adc)、双特异性抗体、以及car-t疗法等多种治疗模式。到目前为止，基于聚合酶链反应(pcr)扩增dna的测序技术已成为一个标准技术，然而，由于该标准技术需要大型的设备和复杂的实验步骤，包括热循环设备和dna测序设备等，目前的分子筛选方法仍然大大阻碍该基因多态性检测的效果。


技术实现要素：

5.为解决上述lncror1检测方法需要大型设备并且操作复杂的问题，本发明提供了一种筛选人类lncror基因含量多态性的引物组及检测方法。
6.本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：一种筛选人类lncror基因含量多态性的引物组及检测方法，其核苷酸序列如idno.1～3所示，所述引组物用于筛选人类血清外泌体中都含有的长链非编码rnalncror基因含量阈值多态性。
7.一种筛选人类lncror基因含量多态性的检测方法，包括上述引物组，核苷酸序列为idno.1～3所示的引组物，以检测时间15或20min的检测线测定需求阈值。
8.作为优化，包括如下步骤：
9.s1.准备浓度分别为300ng/μl、200ng/μl、100ng/μl、50ng/μl、25ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl、0.01ng/μl、0.001ng/μl、0.0001ng/μl、0.00001ng/μl的逆转录样本ctdna各2μl；
10.s2.将11.5μl双蒸水、2μl的浓度为10μm的正向引物idno.1、2μl的浓度为10μm的反向引物idno.2、0.5μl的浓度为10μm的探针引物idno.3、步骤s1的逆转录样本ctdna、和29.5μl重泡胀缓冲液依次加入到含有冻干扩增酶的ep管中，混匀；
11.s3.向混匀后的步骤s2所得溶液中加入2.5μl浓度为280mm的醋酸镁溶液，混匀；
12.s4.步骤s3所得的混合溶液扩增20min；
13.s5.步骤s4扩增后的溶液按照每20μl产物加入到80μl的测试试纸条缓冲液静置1分钟，静置后插入试纸条检测。
14.作为优化，包括如下步骤：
15.s1.准备浓度分别为300ng/μl、200ng/μl、100ng/μl、50ng/μl、25ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl、0.01ng/μl、0.001ng/μl、0.0001ng/μl、0.00001ng/μl的逆转录样本ctdna各2μl；
16.s2.将11.5μl双蒸水、2μl的浓度为10μm的正向引物idno.1、2μl的浓度为10μm的反向引物idno.2、0.5μl的浓度为10μm的探针引物idno.3、步骤s1的逆转录样本ctdna、和29.5μl重泡胀缓冲液依次加入到含有冻干扩增酶的ep管中，混匀；
17.s3.向混匀后的步骤s2所得溶液中加入2.5μl浓度为280mm的醋酸镁溶液，混匀；
18.s4.步骤s3所得的混合溶液扩增15min；
19.s5.步骤s4扩增后的溶液按照每20μl产物加入到80μl的测试试纸条缓冲液静置1分钟，静置后插入试纸条检测。
20.作为优化，重组酶聚合酶扩增所用试剂与酶均来源于英国twistdx商品试剂盒。
21.本方案的有益效果是，一种筛选人类lncror基因含量多态性的引物组及检测方法，具有以下有益之处：
22.本技术采用核苷酸序列如idno.1～3所示的引组物，将试剂盒中肽核酸(pna)预先与引组物dna结合，然后利用重组酶聚合酶扩增(rpa)极为快速的扩增技术，并结合等位基因特异性扩增(asa)在15min和20min(样本中无干扰组织的理想情况下)筛选出lncror1基因含量多态性，且检测出的阈值极低；
23.发现rpa主要扩增酶gp32和bsu无法区别含量低于0.0001ng/μl和0.01ng/μl的待测样本，即含量低于此值可排除lncror基因含量超标的情况。
24.通过本技术的检测方法筛选血液标本时，以阳性质控dna和阴性质控为对照品，白色背景为筛选环境，筛选血液样本中基因含量多态性情况，结果显示阳性质控dna产生阳性条带并且阴性质控未显示阳性条带，因此本技术的引组物及检测方法能够对血液样本中lncror1基因含量多态性进行快速检测，无需大型设备，并且操作简便，能够大大减少lncror1基因含量多态性的检测时间和工作量，提高检测效率。
附图说明
25.附图1为本发明idno.1序列表示意图。
26.附图2为本发明idno.2序列表示意图。
27.附图3为本发明idno.3序列表示意图。
28.附图4表示筛选lncror基因含量多态性检测结果，从左至右依次显示了阳性对照组(试剂盒自带)、阴性对照组(无样本dna)、2μl的浓度分别为300ng/μl、200ng/μl、100ng/μl、50ng/μl、25ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl、0.01ng/μl、0.001ng/μl、0.0001ng/μl、0.00001ng/μl的逆转录样本ctdna测试结果，扩增时间为20min。
29.附图5表示筛选lncror基因含量多态性检测结果，从左至右依次显示了阳性对照组(试剂盒自带)、阴性对照组(无样本dna)、2μl的浓度分别为300ng/μl、200ng/μl、100ng/μ
l、50ng/μl、25ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl、0.01ng/μl、0.001ng/μl的逆转录样本ctdna测试结果，扩增时间为15min。
30.附图6：a为引组物筛选的实时定量pcr荧光曲线；b引组物筛选的琼脂糖凝胶电泳结果；c为扩增后测序结果。
具体实施方式
31.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
33.在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，或者是该发明产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
34.实施例1：
35.在筛选目的基因片段多态性之前，先根据相应碱基位置寻找一对合适(考虑特异性和敏感性)的引物，即利用ncbi网站中的blast工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)，检查引物的理论特异性。利用含有此多态性的质粒进行扩增筛选并且利用测序和琼脂糖凝胶电泳再次确定筛选引物的特异性和敏感性。
36.在本实施例中，试剂及样本加入量及顺序：将11.5μl双蒸水、2μl正向引物、2μl反向引物、0.5μl探针引物(引物浓度均为10μm)、2μl样本dna(和29.5μl重泡胀缓冲液(rehydrationbuffer)加入到含有冻干扩增酶(twistdx,cambridge,uk)的ep管中，混匀后再向其中加入2.5μl醋酸镁溶液(280mm)混匀、扩增。最合适的扩增时间为20min，再按照每扩增后20μl产物加入到80μl的测试试纸条缓冲液静置1分钟，插入试纸条检测。以上均考虑到敏感性和特异性的平衡。
37.实施例2：
38.本实施中试剂及样本加入量及顺序如实施例1。
39.实施例1和实施例2的检测结果如下表：
40.表1：
[0041][0042]
实施例1和实施例2以阳性质控dna和阴性质控为对照品，白色背景为筛选环境，筛选血液样本中基因含量多态性情况，结果显示阳性质控dna产生阳性条带并且阴性质控未显示阳性条带。
[0043]
由上述实施例结果可知，rpa主要扩增酶gp32和bsu无法区别含量低于0.0001ng/μl和0.01ng/μl的待测样本，即含量低于此值可排除lncror基因含量超标的情况。
[0044]
因此本技术的引组物及检测方法能够对血液样本中lncror1基因含量多态性进行快速检测，无需大型设备，并且操作简便，能够大大减少lncror1基因含量多态性的检测时间和工作量，提高检测效率。
[0045]
上述具体实施方式仅是本发明的具体个案，本发明的专利保护范围包括但不限于上述具体实施方式的产品形态和式样，任何符合本发明权利要求书的一种筛选人类lncror基因含量多态性的引物组且任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应落入本发明的专利保护范围。