一类具有双靶点降糖功能的三肽及其应用的制作方法

1.本发明涉及药物及医学领域，特别涉及二型糖尿病的预防和治疗领域，具体涉及一类具有双靶点降糖功能的三肽及其应用。


背景技术：

2.糖尿病的发病率逐年升高，已经成为第三位严重威胁人类健康的慢性病。临床药物常伴有体重增加、低血糖及胃肠道不良反应等副作用，且其长期服用安全性还有待进一步证实。活性肽安全，易吸收，无副作用，是开发降血糖功能产品的优良候选物质。
3.二肽基肽酶-iv(dipeptidyl peptidase iv，dpp-iv)抑制剂是治疗二型糖尿病的新靶点之一。内源性肠促胰岛素激素可以促进胰岛素的分泌，进而降低血糖。然而，内源性肠促激素会被dpp
‑ⅳ
降解而失去其生理活性。因此，抑制dpp
‑ⅳ
活性，可以促进胰岛素的产生，降低糖尿病的高血糖。已有dpp
‑ⅳ
抑制肽的构效研究表明：dpp-iv抑制肽通常在n端含有支链氨基酸(ile、leu及val)，并在p2位置含有一个pro残基。
4.肝脏是维持体内血糖平衡的重要器官之一。肝脏通过抑制糖异生，促进葡萄糖摄取和糖原合成，增加葡萄糖消耗，降低血液中的葡萄糖含量。现有研究表明氨基酸不仅在体内发挥营养价值，同时可以作为信号因子调控体内的代谢平衡，比如糖代谢平衡。酰胺类氨基酸是影响细胞代谢的关键营养物。谷氨酰胺和天冬酰胺不仅作为细胞氮源的重要提供者，同时也是三羧酸循环中关键中间代谢物的提供者，保证了三羧酸循环的正常运行，促进细胞的线粒体能量代谢，为葡萄糖的代谢提供动力。因此，含有酰胺类氨基酸的肽具有促进葡萄糖能量代谢的效果。
5.不同降糖途径的药物联合使用是临床上二型糖尿病治疗的常用策略，其中最为常见给药方式是dpp
‑ⅳ
抑制剂和二甲双胍的联合使用。dpp
‑ⅳ
抑制剂主要具有抑制dpp
‑ⅳ
的活性，二甲双胍主要通过调控肝脏糖代谢平衡，从而降糖的效果。这两种药物的联合使用已在临床上取得较好的结果。然而药物的联合使用不仅增加了成本，同时患者依从性差(单玲；鲁丽；李延彬；杨榕,二肽基肽酶4抑制剂联合二甲双胍治疗2型糖尿病的临床疗效.实用药物与临床2016,19,(09),1094-1097.)。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一类具有双靶点降糖功能的三肽及其应用。
7.本发明提供的具有双靶点降糖功能的三肽是一类具有双靶点功能的降糖肽，该降糖肽不仅可以抑制dpp
‑ⅳ
活性，还可以促进肝脏葡萄糖消耗，从而有效的预防和治疗二型糖尿病。
8.本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
9.本发明提供的具有双靶点降糖功能的三肽，其序列为xaa1-pro-xaa2。xaa1表示为支链氨基酸，xaa2表示为酰胺类氨基酸。
10.本发明提供的一类具有双靶点降糖功能的三肽，其氨基酸序列n端的第二位为pro残基；氨基酸序列n端的第三位为酰胺类氨基酸。
11.进一步地，该具有双靶点降糖功能的三肽，其氨基酸序列n端的第一位为支链氨基酸；所述支链氨基酸为ile、val或leu。
12.进一步地，所述酰胺类氨基酸为gln或asn。
13.进一步地，该具有双靶点降糖功能的三肽，如seq id no.1所示，氨基酸序列可以为ile-pro-gln。
14.进一步地，该具有双靶点降糖功能的三肽，如seq id no.2所示，氨基酸序列还可以为leu-pro-gln。
15.进一步地，该具有双靶点降糖功能的三肽，如seq id no.3所示，氨基酸序列还可以为val-pro-gln。
16.进一步地，该具有双靶点降糖功能的三肽，如seq id no.4所示，氨基酸序列还可以为ile-pro-asn。
17.进一步地，该具有双靶点降糖功能的三肽，如seq id no.5所示，氨基酸序列还可以为leu-pro-asn。
18.进一步地，该具有双靶点降糖功能的三肽，如seq id no.5所示，氨基酸序列还可以为val-pro-asn。
19.本发明提供的一类具有双靶点降糖功能的三肽在制备预防和治疗二型糖尿病药物中的应用。
20.本发明提供的一类具有双靶点降糖功能的三肽是根据dpp
‑ⅳ
抑制肽的构效关系和特殊氨基酸在肝脏葡萄糖消耗中的活性作用进行合理设计所得；其中，第二位为pro残基的多肽具有较强的dpp
‑ⅳ
抑制活性，其中n端的第一位为支链氨基酸，尤其是ile和val的肽的dpp
‑ⅳ
活性相对于其他肽活性更强；同时，酰胺类氨基酸，asn和gln具有较强的促进肝脏葡萄糖消耗的活性。因此本发明设计了一类具有xaa1-pro-xaa2序列特征的三肽(可参照图3所示)，其中xaa1为ile，leu，val，xaa2为asn和gln。该类型三肽同时具有抑制dpp
‑ⅳ
活性和促进葡萄糖消耗活性，能够通过双靶点有效的治疗和预防二型糖尿病。
21.与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
22.本发明提供的一类具有双靶点降糖功能的三肽同时具备抑制dpp
‑ⅳ
活性和促进肝脏葡萄糖消耗两种降糖作用；不仅可以抑制dpp
‑ⅳ
活性，从而抑制内源性肠促胰岛素激素的降解，进而促进胰岛素分泌，达到降血糖的效果，同时可以促进肝脏对葡萄糖的消耗和代谢，降低糖尿病患者的高血糖，且安全，易吸收，无副作用，可应用于制备预防和治疗二型糖尿病的药物。
附图说明
23.图1为实施例中具有双靶点降糖功能的三肽的dpp
‑ⅳ
抑制活性图；
24.图2为实施例中具有双靶点降糖功能的三肽的促进hepg2细胞葡萄糖消耗活性图；
25.图3为实施例中具有双靶点降糖功能的三肽的序列结构示意图。
具体实施方式
26.以下实施例采用的具有双靶点降糖功能的三肽，是由本发明设计并由吉尔生化有限公司进行人工合成得到的。所述具有双靶点降糖功能的三肽的氨基酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5及seq id no.6所示；这6种具有双靶点降糖功能的三肽分别在实施例中标记为具有双靶点降糖功能的三肽1、具有双靶点降糖功能的三肽2、具有双靶点降糖功能的三肽3、具有双靶点降糖功能的三肽4、具有双靶点降糖功能的三肽5、具有双靶点降糖功能的三肽6。
27.以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
28.实施例1：具有双靶点降糖功能的三肽1(其序列如seq id no.1所示的ipq)的dpp
‑ⅳ
抑制活性
29.dpp
‑ⅳ
抑制活性测定方法如下：在96孔板中，加入80μl样品(具有双靶点降糖功能的三肽1，序列如seq id no.1所示)与80μl 0.5mm底物gly-pro-pna，混匀，置于酶标仪中37℃下孵育10min后，加入40μl浓度为12.5mu/ml的dpp-iv酶液(37℃预热3min)，振荡30s，并于405nm处读数，每2min读一次，共读120min，从而监测pna的释放情况。将同等体积的100mm ph 8.0tris-hcl缓冲液替代样品作为对照组。上述试剂或样品均采用该tris-hcl缓冲液配置或稀释。将吸光度值(作为纵坐标)与时间(作为横坐标)绘制曲线，在线性范围内(r2》0.995)获得曲线的斜率，然后按照下列公式计算样品的dpp-iv抑制活性。
30.dpp-iv抑制率(％)＝(1-slope
sample
/slope
control
)*100％；
31.其中slope
sample
代表样品组的斜率，slope
control
代表对照组的斜率。
32.实施例2：具有双靶点降糖功能的三肽2(其序列如seq id no.2所示的lpq)的dpp
‑ⅳ
抑制活性
33.dpp
‑ⅳ
抑制活性测定方法如下：在96孔板中，加入80μl样品(具有双靶点降糖功能的三肽2，序列如seq id no.2所示)与80μl 0.5mm底物gly-pro-pna，混匀，置于酶标仪中37℃下孵育10min后，加入40μl浓度为12.5mu/ml dpp-iv酶液(37℃预热3min)，振荡30s，并于405nm处读数，每2min读一次，共读120min，从而监测pna的释放情况。将同等体积的100mm ph 8.0tris-hcl缓冲液替代样品作为对照组。上述试剂或样品均采用该tris-hcl缓冲液配置或稀释。将吸光度值(作为纵坐标)与时间(作为横坐标)绘制曲线，在线性范围内(r2》0.995)获得曲线的斜率，然后按照下列公式计算样品的dpp-iv抑制活性。
34.dpp-iv抑制率(％)＝(1-slope
sample
/slope
control
)*100％；
35.其中slope
sample
代表样品组的斜率，slope
control
代表对照组的斜率。
36.实施例3：具有双靶点降糖功能的三肽3(其序列如seq id no.3所示的vpq)的dpp
‑ⅳ
抑制活性
37.dpp
‑ⅳ
抑制活性测定方法如下：在96孔板中，加入80μl样品(具有双靶点降糖功能的三肽3，序列如seq id no.3所示)与80μl 0.5mm底物gly-pro-pna，混匀，置于酶标仪中37℃下孵育10min后，加入40μl浓度为12.5mu/ml dpp-iv酶液(37℃预热3min)，振荡30s，并于405nm处读数，每2min读一次，共读120min，从而监测pna的释放情况。将同等体积的100mm ph 8.0tris-hcl缓冲液替代样品作为对照组。上述试剂或样品均采用该tris-hcl缓冲液配
置或稀释。将吸光度值(作为纵坐标)与时间(作为横坐标)绘制曲线，在线性范围内(r2》0.995)获得曲线的斜率，然后按照下列公式计算样品的dpp-iv抑制活性。
38.dpp-iv抑制率(％)＝(1-slope
sample
/slope
control
)*100％；
39.其中slope
sample
代表样品组的斜率，slope
control
代表对照组的斜率。
40.实施例4：具有双靶点降糖功能的三肽4(其序列如seq id no.4所示的ipn)的dpp
‑ⅳ
抑制活性
41.dpp
‑ⅳ
抑制活性测定方法如下：在96孔板中，加入80μl样品(具有双靶点降糖功能的三肽4，序列如seq id no.4所示)与80μl 0.5mm底物gly-pro-pna，混匀，置于酶标仪中37℃下孵育10min后，加入40μl浓度为12.5mu/ml dpp-iv酶液(37℃预热3min)，振荡30s，并于405nm处读数，每2min读一次，共读120min，从而监测pna的释放情况。将同等体积的100mm ph 8.0tris-hcl缓冲液替代样品作为对照组。上述试剂或样品均采用该tris-hcl缓冲液配置或稀释。将吸光度值(作为纵坐标)与时间(作为横坐标)绘制曲线，在线性范围内(r2》0.995)获得曲线的斜率，然后按照下列公式计算样品的dpp-iv抑制活性。
42.dpp-iv抑制率(％)＝(1-slope
sample
/slope
control
)*100％；
43.其中slope
sample
代表样品组的斜率，slope
control
代表对照组的斜率。
44.实施例5：具有双靶点降糖功能的三肽5(其序列如seq id no.5所示的lpn)的dpp
‑ⅳ
抑制活性
45.dpp
‑ⅳ
抑制活性测定方法如下：在96孔板中，加入80μl样品(具有双靶点降糖功能的三肽5，序列如seq id no.5所示)与80μl 0.5mm底物gly-pro-pna，混匀，置于酶标仪中37℃下孵育10min后，加入40μl浓度为12.5mu/ml dpp-iv酶液(37℃预热3min)，振荡30s，并于405nm处读数，每2min读一次，共读120min，从而监测pna的释放情况。将同等体积的100mm ph 8.0tris-hcl缓冲液替代样品作为对照组。上述试剂或样品均采用该tris-hcl缓冲液配置或稀释。将吸光度值(作为纵坐标)与时间(作为横坐标)绘制曲线，在线性范围内(r2》0.995)获得曲线的斜率，然后按照下列公式计算样品的dpp-iv抑制活性。
46.dpp-iv抑制率(％)＝(1-slope
sample
/slope
control
)*100％；
47.其中slope
sample
代表样品组的斜率，slope
control
代表对照组的斜率。
48.实施例6：具有双靶点降糖功能的三肽6(其序列如seq id no.6所示的vpn)的dpp
‑ⅳ
抑制活性
49.dpp
‑ⅳ
抑制活性测定方法如下：在96孔板中，加入80μl样品(具有双靶点降糖功能的三肽6，序列如seq id no.1所示)与80μl 0.5mm底物gly-pro-pna，混匀，置于酶标仪中37℃下孵育10min后，加入40μl浓度为12.5mu/ml dpp-iv酶液(37℃预热3min)，振荡30s，并于405nm处读数，每2min读一次，共读120min，从而监测pna的释放情况。将同等体积的100mm ph 8.0tris-hcl缓冲液替代样品作为对照组。上述试剂或样品均采用该tris-hcl缓冲液配置或稀释。将吸光度值(作为纵坐标)与时间(作为横坐标)绘制曲线，在线性范围内(r2》0.995)获得曲线的斜率，然后按照下列公式计算样品的dpp-iv抑制活性。
50.dpp-iv抑制率(％)＝(1-slope
sample
/slope
control
)*100％；
51.其中slope
sample
代表样品组的斜率，slope
control
代表对照组的斜率。
52.由实施例1-实施例6的检测得知，终浓度200μm的肽的dpp
‑ⅳ
抑制活性分别为：ipq＝71.64％；lpq＝50.75％；vpq＝64.21％；ipn＝60.55％；lpn＝40.69％；vpn＝61.97％，可
参照图1所示。检测结果表明，具有xaa1-pro-xaa2特征序列的三肽具有较强的dpp
‑ⅳ
抑制活性。
53.实施例7：具有双靶点降糖功能的三肽1(其序列如seq id no.1所示的ipq)促进hepg2细胞葡萄糖消耗活性
54.hepg2细胞葡萄糖消耗活性测定方法如下：取对数生长期细胞，以1
×
105个/孔接种于96孔板，于37℃，5％co2的培养箱中培养24h。去除培养基，空白对照组加入100μl的基础培养基mem(含5mm葡萄糖)，样品组加入100μl基础培养基mem(含5mm葡萄糖，而且含终浓度为400μm的具有双靶点降糖功能的三肽1)，孵育18h。取细胞培养上清液，使用葡萄糖氧化酶试剂盒测定细胞培养基中剩余葡萄糖含量。使用mtt法测定细胞浓度。用原始培养基中葡萄糖浓度减去孵育18h后细胞培养基中的葡萄糖浓度，从而计算葡萄糖消耗。每组细胞的葡萄糖消耗量采用每组的细胞浓度进行校正。
55.实施例8：具有双靶点降糖功能的三肽2(其序列如seq id no.2所示的lpq)促进hepg2细胞葡萄糖消耗活性
56.hepg2细胞葡萄糖消耗活性测定方法如下：取对数生长期细胞，以1
×
105个/孔接种于96孔板，于37℃，5％co2的培养箱中培养24h。去除培养基，空白对照组加入100μl的基础培养基mem(含5mm葡萄糖)，样品组加入100μl基础培养基mem(含5mm葡萄糖，而且含终浓度为400μm的具有双靶点降糖功能的三肽2)，孵育18h。取细胞培养上清液，使用葡萄糖氧化酶试剂盒测定细胞培养基中剩余葡萄糖含量。使用mtt法测定细胞浓度。用原始培养基中葡萄糖浓度减去孵育18h后细胞培养基中的葡萄糖浓度，从而计算葡萄糖消耗。每组细胞的葡萄糖消耗量采用每组的细胞浓度进行校正。
57.实施例9：具有双靶点降糖功能的三肽3(其序列如seq id no.3所示的vpq)促进hepg2细胞葡萄糖消耗活性
58.hepg2细胞葡萄糖消耗活性测定方法如下：取对数生长期细胞，以1
×
105个/孔接种于96孔板，于37℃，5％co2的培养箱中培养24h。去除培养基，空白对照组加入100μl的基础培养基mem(含5mm葡萄糖)，样品组加入100μl基础培养基mem(含5mm葡萄糖，而且含终浓度为400μm的具有双靶点降糖功能的三肽3)，孵育18h。取细胞培养上清液，使用葡萄糖氧化酶试剂盒测定细胞培养基中剩余葡萄糖含量。使用mtt法测定细胞浓度。用原始培养基中葡萄糖浓度减去孵育18h后细胞培养基中的葡萄糖浓度，从而计算葡萄糖消耗。每组细胞的葡萄糖消耗量采用每组的细胞浓度进行校正。
59.实施例10：具有双靶点降糖功能的三肽4(其序列如seq id no.4所示的ipn)促进hepg2细胞葡萄糖消耗活性
60.hepg2细胞葡萄糖消耗活性测定方法如下：取对数生长期细胞，以1
×
105个/孔接种于96孔板，于37℃，5％co2的培养箱中培养24h。去除培养基，空白对照组加入100μl的基础培养基mem(含5mm葡萄糖)，样品组加入100μl基础培养基mem(含5mm葡萄糖，而且含终浓度为400μm的具有双靶点降糖功能的三肽4)，孵育18h。取细胞培养上清液，使用葡萄糖氧化酶试剂盒测定细胞培养基中剩余葡萄糖含量。使用mtt法测定细胞浓度。用原始培养基中葡萄糖浓度减去孵育18h后细胞培养基中的葡萄糖浓度，从而计算葡萄糖消耗。每组细胞的葡萄糖消耗量采用每组的细胞浓度进行校正。
61.实施例11：具有双靶点降糖功能的三肽5(其序列如seq id no.5所示的lpn)促进
hepg2细胞葡萄糖消耗活性
62.hepg2细胞葡萄糖消耗活性测定方法如下：取对数生长期细胞，以1
×
105个/孔接种于96孔板，于37℃，5％co2的培养箱中培养24h。去除培养基，空白对照组加入100μl的基础培养基mem(含5mm葡萄糖)，样品组加入100μl基础培养基mem(含5mm葡萄糖，而且含终浓度为400μm的具有双靶点降糖功能的三肽5)，孵育18h。取细胞培养上清液，使用葡萄糖氧化酶试剂盒测定细胞培养基中剩余葡萄糖含量。使用mtt法测定细胞浓度。用原始培养基中葡萄糖浓度减去孵育18h后细胞培养基中的葡萄糖浓度，从而计算葡萄糖消耗。每组细胞的葡萄糖消耗量采用每组的细胞浓度进行校正。
63.实施例12：具有双靶点降糖功能的三肽6(其序列如seq id no.6所示的vpn)促进hepg2细胞葡萄糖消耗活性
64.hepg2细胞葡萄糖消耗活性测定方法如下：取对数生长期细胞，以1
×
105个/孔接种于96孔板，于37℃，5％co2的培养箱中培养24h。去除培养基，空白对照组加入100μl的基础培养基mem(含5mm葡萄糖)，样品组加入100μl基础培养基mem(含5mm葡萄糖，而且含终浓度为400μm的具有双靶点降糖功能的三肽6)，孵育18h。取细胞培养上清液，使用葡萄糖氧化酶试剂盒测定细胞培养基中剩余葡萄糖含量。使用mtt法测定细胞浓度。用原始培养基中葡萄糖浓度减去孵育18h后细胞培养基中的葡萄糖浓度，从而计算葡萄糖消耗。每组细胞的葡萄糖消耗量采用每组的细胞浓度进行校正。
65.实施例7-12的实验结果如图2所示，与空白组相比，400μm的降糖肽的葡萄糖消耗量都显著增加，相比于空白组，降糖肽葡萄糖消耗量增加的效果分别为ipq＝14.23％；lpq＝12.88％；vpq＝16.42％；ipn＝16.50％；lpn＝12.18％；vpn＝22.85％。结果说明，本发明提供的xaa1-pro-xaa2特征序列的三肽可以显著促进肝脏细胞葡萄糖消耗。
66.以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。