恒温核酸扩增反应管的制作方法

1.本实用新型涉及医学检测工具技术领域，尤其涉及一种恒温核酸扩增反应管。


背景技术：

2.重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，rpa)是基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟体内dna复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合(重组酶、单链结合蛋白和dna聚合酶)对dna模板进行特异性扩增，是一种恒温核酸扩增技术，可在接近体温条件下实现快速特异性扩增(25℃-42℃，5-30min)，作为一种等温技术减少了对高精度昂贵仪器、稳定电力供应设施及高级别实验室的依赖，只需要一个恒温装置就可完成，且可通过荧光分析装置判别是否存在扩增产物，具有对设施和操作要求均较为简单的特点，已广泛应用于生命科学研究、医学检测、农业、食品安全、转基因检测等多个领域。
3.为了进一步提高rpa的检测灵敏度，有研究者提出了巢式rpa检测方法(nestrpa)(wanqiu huang,dachuan lin,cuini wang,chaohui bao,zhaoqi zhang,xinchun chen,zheng zhang,jian huang#.the determination of release from isolation of covid-19patients requires ultra-high sensitivity nucleic acid test technology.j infect.2020jul 2；s0163-4453(20)30456-4.doi:10.1016/j.jinf.2020.06.075.)，nestrpa的基本原理是：先用外引物扩增目的基因第一片段，然后用内引物扩增完全位于第一扩增片段内的目的基因第二片段。为了消除酶的荧光信号影响，在第一次的rpa反应体系中不包含荧光探针。在第二次rpa反应中，加入荧光探针。经实验证实nestrpa具有超高灵敏度，将为新冠病毒、流感病毒、猪瘟病毒等各种病毒的尽早发现提供有力的技术支撑。但是，nestrpa要经两次rpa反应，第一次rpa反应完之后，需打开反应管盖子，加入第二次rpa反应所需的内引物和探针等，再盖上反应管盖子进行第二次rpa反应，直至反应结束检测结果。其中，在第一次rpa反应完之后打开反应管盖子的过程中，容易产生核酸气溶胶污染，导致假阳性结果。因此，急需开发一种可以“一管法”完成nestrpa的反应管，在第一次rpa反应完之后无需打开反应管盖子，就可进行第二次rpa反应。


技术实现要素：

4.本实用新型要解决目前用于巢式rpa检测的反应管容易产生核酸气溶胶污染的技术问题，提供一种恒温核酸扩增反应管，该反应管能有效避免巢式rpa检测过程中的开盖操作，防止污染，使检测结果更加精准。
5.为了解决上述技术问题，本实用新型通过如下技术方案实现:
6.在本实用新型的一个方面，提供了一种恒温核酸扩增反应管，所述反应管包括管体、管盖、和穿刺部件，该穿刺部件设置于管体入口处内侧。
7.优选的，所述穿刺部件为空心圆锥体形状，在其圆锥侧面上设有多个孔洞，以利于液体离心后下沉管底。
8.所述管盖的开口可用封口膜密封，所述封口膜包括耐热薄膜型封口膜。
9.所述管盖的顶端可开设有加样口。
10.所述管盖在其底部预先密封可刺破封口膜的前提下，管盖内部可通过管盖顶端的加样口加入反应液体。
11.在本实用新型的另一个方面，提供了另一种实施方式的恒温核酸扩增反应管，所述反应管包括管体、管盖、和穿刺部件，该穿刺部件设置于管盖的顶端。
12.优选的，所述穿刺部件为穿透管盖顶端的钉子形部件，可于管盖顶端外侧推动该穿刺部件。
13.所述管盖内可加入液体如pcr反应体系等，管盖的开口可用封口膜封住。
14.本实用新型恒温核酸扩增反应管，通过独特的结构设计，使巢式rpa检测在第一次rpa反应完之后无需打开反应管盖子，就可进行第二次rpa反应，有效避免了气溶胶污染，显著增加了检测结果的精准性。
附图说明
15.下面结合附图和具体实施方式对本实用新型作进一步详细的说明。
16.图1是本实用新型恒温核酸扩增反应管的立体结构示意图；
17.图2是本实用新型恒温核酸扩增反应管的分解示意图；
18.图3是本实用新型恒温核酸扩增反应管的外观示意图；
19.图4是本实用新型恒温核酸扩增反应管另一种实施方式的立体结构示意图；
20.其中，在图1-4中：
21.1-管体，2-管盖，3-穿刺部件，4-穿刺部件圆锥侧面上的孔。
具体实施方式
22.如图1-2所示，本实用新型恒温核酸扩增反应管，包括管体1、管盖2、和穿刺部件3，该穿刺部件3设置于管体1入口处内侧。在本实用新型的一个具体实施方式中，穿刺部件3为空心圆锥体形状，在其圆锥侧面上设有多个孔4(见图3)。使用本实用新型反应管进行巢式rpa检测时，第一次rpa反应的反应体系加在管盖2内，并用封口膜(parafilm)封住管盖2开口，然后将其置于恒温扩增仪中39℃条件下进行第一次rpa反应。当第一次rpa反应结束，在管体1中预先加入第二次rpa反应所需的除反应模板外的成分，再将封有封口膜的管盖2盖入管体1中，此时设置于管体1入口处内侧的穿刺部件3会刺破管盖2开口处的封口膜，使管盖2内的第一次rpa反应产物通过穿刺部件3圆锥侧面上的孔4全部流入管体1中，作为第二次rpa反应的模板，然后，混合、离心，在荧光-等温扩增仪中39℃条件下进行第二次rpa反应，最后检测荧光结果。由于采用本实用新型恒温核酸扩增反应管，巢式rpa检测在第一次rpa反应结束之后，无需打开反应管盖子即可进行第二次rpa反应，有效避免了因开盖操作引起的气溶胶污染，显著增加了检测结果的精准性。
23.在本实用新型的另一个具体实施方式中，管盖2的顶端开设有加样口。使用本实用新型反应管进行巢式rpa检测时，先将管盖2下面开口用封口膜密封，再从管盖2顶端的加样口加入第一次rpa反应的反应体系，封上加样口，然后将其置于恒温扩增仪中39℃条件下进行第一次rpa反应。当第一次rpa反应结束，在管体1中预先加入第二次rpa反应所需的除反
应模板外的成分，再将封有封口膜的管盖2盖入管体1中，此时设置于管体1入口处内侧的穿刺部件3会刺破管盖2开口处的封口膜，使管盖2内的第一次rpa反应产物通过穿刺部件3圆锥侧面上的孔洞4全部流入管体1中，作为第二次rpa反应的模板，然后，混合、离心，在荧光-恒温扩增仪中39℃条件下进行第二次rpa反应，最后检测荧光结果。由于采用本实用新型恒温核酸扩增反应管，巢式rpa检测在第一次rpa反应结束之后，无需打开反应管盖子即可进行第二次rpa反应，有效避免了因开盖操作引起的气溶胶污染，显著增加了检测结果的精准性。
24.如图4所示，在本实用新型的另一种实施方式中，恒温核酸扩增反应管包括管体1、管盖2、和穿刺部件3，该穿刺部件3设置于管盖2的顶端。具体实施例中，穿刺部件3为穿透管盖2顶端的钉子形部件，可于管盖2顶端外侧推动该穿刺部件3。使用该反应管进行巢式rpa检测时，第一次rpa反应的反应体系加在管盖2内，并用封口膜(parafilm)封住管盖2开口，然后将其置于恒温扩增仪中39℃条件下进行第一次rpa反应。当第一次rpa反应结束，在管体1中预先加入第二次rpa反应所需的除反应模板外的成分，再将封有封口膜的管盖2盖入管体1中，然后推动管盖2顶端外侧的穿刺部件3尾端，使穿刺部件3的尖锐头部往前运动，刺破管盖2开口处的封口膜，使管盖2内的第一次rpa反应产物全部流入管体1中，作为第二次rpa反应的模板，然后，混合、离心，在荧光-等温扩增仪中39℃条件下进行第二次rpa反应，最后检测荧光结果。该实施例的恒温核酸扩增反应管，也使巢式rpa检测在第一次rpa反应结束之后，无需打开反应管盖子即可进行第二次rpa反应，有效避免了因开盖操作引起的气溶胶污染，显著增加了检测结果的精准性。
25.以上所述的几种实施方式较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本实用新型专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本实用新型的保护范围。因此，本实用新型专利的保护范围应以所附权利要求为准。