一种贝莱斯芽孢杆菌、悬浮液及制备方法和应用

1.本发明属于微生物技术领域，涉及一种贝莱斯芽孢杆菌、悬浮液及制 备方法和应用。


背景技术：

2.随着工业和矿业的快速发展，以及污灌和污泥滥用，农药化肥不合理 施用，化石类燃料和农用薄膜的不完全燃烧等一系列原因，使得重金属污 染已呈日趋严重，对生态环境和人体健康造成了极大的威胁。此外，重金 属污染还将导致土壤退化，农作物歉收，并且可能通过食物链影响人类的 生命安全。因此，对重金属污染土壤的治理和修复，任务十分紧迫。
3.植物根际促生菌株(plant growth promoting rhizobacteria，简称pgpr) 是指存在于植物根际环境中，通过产生植物激素、溶解无机磷等直接作用 和竞争生态位、诱导植物系统抗性等间接作用促进植物生长的一类有益菌 株。近年来大量研究表明，pgpr菌株能在植物根系及根际土壤有效定殖， 具有显著的促生、防病和增产效果、同时调节植物根际土壤微生态环境、 缓解生态污染等特性，成为有机生态农业可持续发展的有效途径之一，应 用前景十分广阔。而利用植物根际有益pgpr菌株缓解土壤次生盐渍化和 重金属污染，提高产量和品质，提高植物免疫能力，并调节土壤微生态是 农业可持续发展的新途径。


技术实现要素：

4.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种贝莱斯芽孢杆菌， 它为贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis bv-hr6-1，保藏于“中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为cgmcc no.14469。保藏日期 为2017年07月27日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国 科学院微生物研究所，邮政编码：100101。
5.基于上述，所述贝莱斯芽孢杆菌是由水稻根际分离、筛分出来的革兰 式阳性菌菌种，经培养基发酵培养得到的。
6.基于上述，所述贝莱斯芽孢杆菌的生长温度范围为4℃～50℃，所述 贝莱斯芽孢杆菌的生长ph值为6.5～7.5。
7.基于上述，所述培养基为蛋白胨培养基。
8.本发明还提供一种贝莱斯芽孢杆菌悬浮液，包括无菌硫酸镁溶液和均匀 分散在该无菌硫酸镁溶液中贝莱斯芽孢杆菌的菌体。
9.基于上述，所述贝莱斯芽孢杆菌悬浮液的浓度为2
×
107cfu/ml～ 2
×
109cfu/ml。
10.本发明还提供一种制备贝莱斯芽孢杆菌悬浮液的方法，其步骤包括：
11.从水稻根际分离、筛分出来的革兰式阳性菌作为菌种，经培养基培养得 到贝莱斯芽孢杆菌菌种；
12.将贝莱斯芽孢杆菌菌种接种到培养基上，并在28℃～32℃发酵培养 36h～50h，得到贝莱斯芽孢杆菌发酵液；对所述贝莱斯芽孢杆菌发酵液进 行离心处理，得到贝莱斯芽孢
杆菌的菌体；采用0.05mol/l～0.1mol/l的无 菌硫酸镁溶液分散所述贝莱斯芽孢杆菌的菌体，获得所述贝莱斯芽孢杆菌 悬浮液。
13.本发明还提供一种所述的贝莱斯芽孢杆菌悬浮液的应用，所述贝莱斯芽 孢杆菌悬浮液可用于治理土壤次生盐渍化和重金属污染。
14.本发明还提供一种所述的贝莱斯芽孢杆菌悬浮液的使用方法，包括植 物移栽时利用所述贝莱斯芽孢杆菌悬浮液进行浸根处理，和/或在植物移栽 后20天之内利用所述贝莱斯芽孢杆菌悬浮液对植物进行灌注处理。
15.本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis bv-hr6-1菌株具有以 下生物学特性：
16.如图11和图12所示，本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensisbv-hr6-1菌株是从水稻根际分离的革兰式阳性菌。菌体直杆状，na培养基 上菌落呈不规则形，表面扁平干燥，边缘呈小锯齿状，不透明，不产生色素。 该菌株的生长温度范围为4℃～50℃，最适生长温度为30℃，最适宜的ph值 为6.5-7.5，最高耐盐度为10％。明胶液化、淀粉水解、柠檬酸盐利用、过氧 化氢酶、硫化氢产生试验、硝酸盐还原和v-p测定为阳性，葡糖糖氧化发酵 为发酵型。该菌16s rdna序列全长为1428bp，与bacillus velezensis(贝莱 斯芽孢杆菌)的16s rdna序列相似性达到99％。
17.本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis bv-hr6-1悬浮液在番 茄等蔬菜生长过程中在植物根际具有良好的定殖能力，能对土壤中的镉、 铅、铜等具有降解功效。
18.通过试验对比表明，添加了该贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensisbv-hr6-1悬浮液的育苗基质进行蔬菜育苗时，在叶片数、spad值(叶绿素 含量相对值)、茎粗、株高等指标均大于添加镉、铅、铜胁迫的对照组。
19.因此，本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis bv-hr6-1悬浮 液具有良好的缓解蔬菜根际土壤中的镉、铅、铜的危害程度，调节蔬菜根 际土壤微生态以促进植株生长，并显著提高根系活力，有利于提高产量。
20.另外，通过实验表明，添加了2
×
109cfu/ml的bv-hr6-1菌悬液的 番茄幼苗，在植株鲜重和植株干重均大于只添加清水的空白对照。
21.而同时添加bv-hr6-1悬浮液和nacl的试验组中的番茄幼苗，无论是 在株高、生物量、spad值、qy(最大光量子效率)、mda(丙二醛)、相 对电导率以及sod(超氧化物歧化酶)、pod(过氧化物酶)、cat(过氧 化氢酶)等抗氧化保护酶活性均比只添加nacl的试验组明显得到了改善。 由此说明，该贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis bv-hr6-1悬浮液对土壤中 的盐胁迫具有缓解功效。
附图说明
22.图1为镉胁迫及加菌对番茄幼苗生长趋势茎粗、叶片及株高影响结果。
23.图2为铅胁迫及加菌对番茄幼苗生长趋势茎粗、叶片及株高影响结果。
24.图3为铜胁迫及加菌对番茄幼苗生长趋势茎粗、叶片及株高影响结果。
25.图4为施菌处理对镉胁迫下不同时期番茄叶绿素含量的影响。
26.图5为施菌处理对铅胁迫下不同时期番茄叶绿素含量的影响。
27.图6为施菌处理对铜胁迫下不同时期番茄叶绿素含量的影响。
28.图7为施菌处理对铜、铅、镉等胁迫下番茄茎粗的影响。
29.图8为施菌处理对铜、铅、镉等胁迫下番茄叶片的影响。
30.图9为施菌处理对铜、铅、镉等胁迫下番茄株高的影响。
31.图10为盐胁迫及加菌对番茄幼苗生长影响。
32.图11为bv-hr6-1的系统发育树。
33.图12为本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis bv-hr6-1菌落 图。
具体实施方式
34.下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
35.本实施例提供一种贝莱斯芽孢杆菌，它为贝莱斯芽孢杆菌bacillusvelezensis bv-hr6-1，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心”，保藏号为cgmcc no.14469。
36.所述贝莱斯芽孢杆菌是由水稻根际分离、筛分出来的革兰式阳性菌菌 种，经蛋白胨培养基发酵培养得到的。
37.所述贝莱斯芽孢杆菌的生长温度范围为4℃～50℃，所述贝莱斯芽孢 杆菌的生长ph值为6.5～7.5。
38.本实施例提供一种贝莱斯芽孢杆菌悬浮液，包括无菌硫酸镁溶液和均 匀分散在该无菌硫酸镁溶液中的所述贝莱斯芽孢杆菌的菌体。
39.本实施例中，所述贝莱斯芽孢杆菌悬浮液的浓度为2
×
107cfu/ml～ 2
×
109cfu/ml。
40.本实施例还提供一种所述的贝莱斯芽孢杆菌悬浮液的制备方法，其步 骤包括：
41.从水稻根际分离、筛分出来的革兰式阳性菌作为菌种，经培养基培养得 到贝莱斯芽孢杆菌菌种；
42.将贝莱斯芽孢杆菌菌种接种到培养基上，并在28℃～32℃发酵培养36 h～50h，得到贝莱斯芽孢杆菌发酵液；对所述贝莱斯芽孢杆菌发酵液进行 离心处理，得到贝莱斯芽孢杆菌的菌体；采用0.05mol/l～0.1mol/l的无菌 硫酸镁溶液溶解所述贝莱斯芽孢杆菌的菌体，获得所述贝莱斯芽孢杆菌悬 浮液。
43.本实施例还提供一种所述的贝莱斯芽孢杆菌悬浮液的应用，所述贝莱斯 芽孢杆菌悬浮液可用于治理土壤次生盐渍化和重金属污染。
44.本实施例还提供一种所述的贝莱斯芽孢杆菌悬浮液的使用方法，包括 植物移栽时利用该贝莱斯芽孢杆菌悬浮液进行浸根处理，和/或在植物移栽 后20天之内利用该贝莱斯芽孢杆菌悬浮液进行灌注处理。
45.试验验证
46.对本实施例制得的贝莱斯芽孢杆菌悬浮液进行缓解铜、铅、镉重金属 试验和耐盐试验，试验效果如下：
47.缓解铜、铅、镉重金属试验：
48.试验原材料：
49.供试番茄(粉都热美)购于河南豫艺种业科技发展有限公司，试验在 河南农业大
学科教园区试验大棚进行。
50.供试土壤取自南农业大学科教园区，土壤类型为潮土。土壤基本理化 性质如表1。
51.表1、土壤基本理化性质
[0052][0053]
土壤处理：将所取土壤样品风干，充分搅拌混匀，过2mm筛，向供试 土壤添加外源cu、pb、cd，处理浓度分别为150mg
·
kg-1
、500mg
·
kg-1
、8 mg
·
kg-1
。
[0054]
溶解后均匀施于土壤，风干装入pvc盆(直径10cm，高度15cm)， 每盆装土1.5kg，加水至田间持水量的80％，将塑料盆埋至3/4处，培养2 周。其中，cu、pb、cd分别由cucl2·
2h2o、pb(ch3coo)2·
3h2o和cdcl2·
2.5 h2o提供。
[0055]
试验方法：
[0056]
将番茄种子进行穴盘育苗，选择生长一致的两叶一心幼苗移植到装有蛭 石的试验盆中。将幼苗在气候室中培养，温度为28℃/18℃(白天/黑夜)， 光周期为14h/10h(白天/黑夜)。待番茄幼苗长至4片真叶时，选出长势一 致的番茄幼苗进行移栽，每盆1株。
[0057]
试验共设计6个试验组，分别为铜、铅、镉、悬浮液(bv-hr6-1)+铜、 悬浮液(bv-hr6-1)+铅、悬浮液(bv-hr6-1)+镉。
[0058]
其中每个试验组30株番茄幼苗，悬浮液(bv-hr6-1)浓度为2
×
10
9 cfu/ml，带菌处理的营养钵每个浇灌15ml。
[0059]
栽培后第6天(6月17号)、8天(6月19号)、10天(6月21号)、 12天(6月23号)、14天(6月25号)测一次叶绿素(叶绿素生长点下数 第三片叶)，14天(6月25号)测一次株高、茎粗、叶片数。
[0060]
其中，试验过程中，追肥采用霍格兰营养液配方：硝酸钾404克、四水 硝酸钙590克、七水硫酸镁246克、磷酸二氢钾136克、鳌合铁edta
‑‑
2nafe20克、硼酸2.86克、硫酸锰2.13克、硫酸锌0.22克、硫酸铜0.08克、钼酸 铵0.02克，追肥4天一次。
[0061]
番茄幼苗生长结果如图1至图3所示，从图中可以看出：添加了贝莱斯 芽孢杆菌bv-hr6-1悬浮液的番茄幼苗无论是在株高、叶片数、茎粗等方面 均大于只添加清水的空白对照组。
[0062]
具体地，从图1、图4、图7、图8、图9中可以看出，添加了贝莱斯芽 孢杆菌bv-hr6-1悬浮液+镉的试验组中，番茄幼苗无论是在株高、叶片数、 茎粗、spad值等方面均大于只添加镉的试验组。由此可以说明，该贝莱斯芽 孢杆菌bv-hr6-1悬浮液对土壤中的镉具有降解功效。
[0063]
从图2、图5、图8、图9中可以看出，添加了贝莱斯芽孢杆菌bv-hr6-1 悬浮液+铅的试验组中，番茄幼苗无论是在株高、叶片数、spad值等方面均 大于只添加铅的试验组。由此可以说明，该贝莱斯芽孢杆菌bv-hr6-1悬浮 液对土壤中的铅具有降解功效。
[0064]
从图3、图6、图7、图8、图9中可以看出，添加了贝莱斯芽孢杆菌bv-hr6-1 悬浮液+铜的试验组中，番茄幼苗无论是在株高、叶片数、spad值、茎粗等 方面均大于只添加铜的试验组。由此可以说明，该贝莱斯芽孢杆菌bv-hr6-1 悬浮液对土壤中的铜具有降解功效。
[0065]
耐盐试验：
[0066]
利用盆栽实验研究贝莱斯芽孢杆菌bv-hr6-1悬浮液对盐胁迫下植物 幼苗的生长的影响。
[0067]
从未施加过bv-hr6-1菌剂的大田中取土，加入营养钵中，每个营养 钵杯中加入基质约130g。播种番茄种子，进行施加贝莱斯芽孢杆菌 bv-hr6-1悬浮液处理和nacl胁迫处理，分别设置对照组。nacl处理2 周后，检测番茄幼苗的存活率、株高、鲜重等。
[0068]
盆栽试验具体设计如下。
[0069]
(1)bv-hr6-1菌的施加方法。
[0070]
耐盐试验中，bv-hr6-1菌使用浇灌方式进行施加。
[0071]
具体地，播种相同数量的番茄种子，番茄幼苗长出2个真叶后，分别 向营养钵中加入15ml利用稀释至不同浓度的bv-hr6-1悬浮液进行浇灌 处理，每营养钵1株，共60株，分别用于仅添加bv-hr6-1悬浮液试验组 和同时添加bv-hr6-1悬浮液与nacl胁迫处理的试验组。
[0072]
其中bv-hr6-1菌悬液的浓度为2
×
107cfu/ml、2
×
108cfu/ml、2
×ꢀ
109cfu/ml。
[0073]
(2)nacl胁迫处理方法。
[0074]
采用bv-hr6-1悬浮液处理后，番茄幼苗长至三四片真叶时，用15ml200mmol/l nacl处理番茄幼苗，2至3天处理1次，共处理3次，株高 和鲜重nacl处理完2周后，测定幼苗的株高和鲜重。
[0075]
上述盆栽番茄幼苗用nacl处理2周后，检测番茄幼苗的耐盐生理生 化反应，包括叶绿素含量相对值(spad)、最大光量子效率(qy)、相 对电导率、丙二醛(mda)和超氧化物歧化酶(sod)、过氧化物酶(pod) 和过氧化氢酶(cat)等抗氧化保护酶活性。
[0076]
试验结果如图10以及表2和表3所示。从图10中可以看出：添加了不 同浓度的bv-hr6-1悬浮液的番茄幼苗无论是在叶片数、株高、茎粗等方面 均大于只添加nacl的处理组。
[0077]
同时，从表2和表3中可以看出，不同浓度2
×
107cfu/ml、2
×
10
8 cfu/ml、2
×
109cfu/ml的bv-hr6-1菌悬液培养的番茄幼苗的株高、干 重和鲜重也存在区别。bv-hr6-1菌悬液的浓度越高，番茄幼苗的株高、干 重和鲜重越大。说明bv-hr6-1菌悬液能促进番茄幼苗的生长。
[0078]
进一步的，从试验结果中还可以看出，同时添加了bv-hr6-1悬浮液处 理和nacl的试验组中，番茄幼苗无论是在株高、植株鲜重、植株干重均比 只添加nacl的试验组显著增加；并且提高了spad值、qy以及抗氧化保 护酶(sod、pod、cat)活性，降低了mda、相对电导率，减轻了盐胁 迫下自由基对细胞膜伤害程度，促进了植株生长。
[0079]
由此说明，该贝莱斯芽孢杆菌bv-hr6-1悬浮液对土壤中的盐胁迫具有 缓解功效。
[0080]
表2、不同浓度bv-hr6-1悬浮液和nacl处理对番茄幼苗的生长影响
[0081]
处理株高(cm)鲜重(g)干重(g)spadqyck(水)29.23
±
1.05a27.70
±
1.48ab1.97
±
0.08b59.02
±
0.35a0.78j10723.97
±
0.73c24.50
±
1.86bcd2.02
±
0.17b54.27
±
1.23a0.77j10825.93
±
0.59bc25.49
±
0.91bc2.12
±
0.10b54.73
±
0.28a0.78j10927.8
±
0.87ab32.79
±
1.31a2.62
±
0.13a57.77
±
1.54a0.78
±
13.2
±
0.35f11.80
±
0.68f0.94
±
0.08d48.47
±
0.38b0.76
j107+盐16.3
±
0.25e15.88
±
0.95ef1.37
±
0.10cd54.23
±
3.21a0.76j108+盐19.93
±
0.70d19.37
±
1.32de1.61
±
0.11bc54.83
±
1.13a0.78j109+盐20.27
±
1.12d20.41
±
1.27cde1.83
±
0.03bc58.23
±
1.26a0.78
[0082]
其中，盐为200mmol/l nacl；j107、j108、j109分别为用2
×
10
7 cfu/ml、2
×
108cfu/ml、2
×
109cfu/ml的bv-hr6-1菌液进行浸种处 理。
[0083]
表3、不同浓度bv-hr6-1菌和nacl处理对番茄幼苗生理生化指标的影响
[0084][0085]
其中，盐为200mmol/l nacl；j107、j108、j109分别为用2
×
10
7 cfu/ml、2
×
108cfu/ml、2
×
109cfu/ml的bv-hr6-1菌液进行浸种处 理。
[0086]
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对 其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通 技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分 技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本 发明请求保护的技术方案范围当中。