一种肌酐竞争抗原及其制备方法以及检测肌酐竞争抗原稳定性的方法与流程

1.本发明涉及肌酐衍生物制备技术领域，具体涉及一种肌酐竞争抗原及其制备方法以及检测肌酐竞争抗原稳定性的方法。


背景技术：

2.肌酐是一种低分子量的含氮化合物，是人体内肌酸代谢的终产物。肌酐是临床常规肾功能指标之一，临床上主要用于严重肾小球病变引起的肾功能不全、肾炎、尿毒症等肾脏疾病的诊断和疗效观察等。血清肌酐升高意味着肾功能的损害，是了解肾脏功能的重要指标，同时对冠状动脉病变程度、高血压、糖尿病等有可靠的诊断价值；尿肌酐排出量可作为肌肉量的指标，肌酐的产生量比较恒定，当肾功能损伤不严重时，尿中肌酐的排泄量少受尿液浓缩和稀释的影响，故尿中肌酐浓度的测定常用作尿中其他物质排泄浓度的参照物。肌酐作为重要的肾功能指标，其含量检测为体外诊断，与供体无接触，无不良、致死报告，操作简单、快速，可广泛应用于临床，其临床应用的安全性和可靠性已得到验证。
3.cn201410799524.1公布了肌酐衍生物、肌酐免疫原及其特异性抗体与肌酐检测试剂盒，其特点在于肌酐衍生物具有如式(ⅰ)示结构：
[0004][0005]
其中r为-(ch2)n-coo-,n为1至20之间的整数。肌酐免疫原通过酯键与特定载体连接，具有高免疫原性，且免疫诱导动物所产生的抗体特异性高，与肌酐的特异性结合能力强，通过均相酶免疫检测技术能够实现全自动生化分析仪上对肌酐的高通量、快速化检测。但是这种依靠酯键相连的肌酐免疫原不够稳定，容易在水溶液中水解。
[0006]
2、现有技术中还有通过九步的合成，合成了一种肌酐免疫原及其制备方法以及检测肌酐免疫原稳定性的方法，该肌酐衍生物具有如式(ⅱ)所示结构：
[0007][0008]
作者将该化合物与蛋白偶联，得到了肌酐免疫原，进行活兔免疫实验，获得了肌酐
的特异性抗体，并将偶联后的蛋白作为竞争抗原，应用elisa法制作了肌酐的检测试剂盒。但是通过该肌酐免疫原获得的抗体滴度低，进一步应用的可能性较低。同时该化合物的合成步骤较长，过程中需要nan3、h2等危化品，工业化难度较大。
[0009]
3、在2000年发表了文章，合成了一种肌酐免疫原及其制备方法以及检测肌酐免疫原稳定性的方法，该肌酐衍生物结构如式(ⅲ)所示：
[0010][0011]
并将该肌酐衍生物与蛋白偶联，获得了一种肌酐免疫原，进行小鼠的活体免疫实验，获得了高特异性的肌酐抗体。文中提到，将肌酐衍生物通过化学键将亲水酰肼膜改性，作为竞争抗原，与获得的肌酐抗体以及抗igg葡萄糖氧化酶组成肌酐检测传感器。但是这种肌酐检测传感器在使用过程中操作繁琐，等待时间较长，搭配使用的仪器不是市场常见的仪器，不利于产品上市推广。
[0012]
cn201410799524.1公布的发明中，肌酐免疫原是通过酯键将肌酐衍生物和特定载体连接，通过这种方法获得的肌酐免疫原结构不稳定容易在水溶液中水解，使后续的反应效率低，造成原料的浪费，成本的提高。
[0013]
通过九步合成的肌酐衍生物步骤较长，合成条件苛刻，过程中需使用nan3、h2等危化品，工业化难度较大，不利于量产。且该结构与蛋白偶联后获得的肌酐免疫原在进行活兔试验后获得的抗体滴度低，不利于进一步应用。
[0014]
在2000年发表了文章中制造了一种新的肌酐检测的传感器，但是该装置操作繁琐，等待时间长，且搭配使用的仪器为实验室自制，不是市场常见的仪器，不利于产品的上市推广。为此，我们提出一种肌酐竞争抗原及其制备方法。由于肌酐是一个分子量为113g/mol的小分子，它必须与载体蛋白偶联才能产生免疫原性。因此，我们提出了一种肌酐改性后与蛋白偶联的新结构，以期该结构可作为竞争抗原，应用现有常见方法，可以用市场常见仪器测试肌酐含量。


技术实现要素：

[0015]
本发明的目的在于解决或者至少缓解现有技术中存在的问题。
[0016]
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
[0017]
一种肌酐竞争抗原，具有式(ⅳ)所示的结构式：
[0018][0019]
其中，r为-(ch2)n-co-nh-，n为4-20之间的整数，且载体为具有免疫原性的蛋白。
[0020]
可选地，r为-(ch2)n-co-nh-，优选n为4-10之间的整数。
[0021]
可选地，所述具有免疫原性的蛋白包括但不限于牛血清白蛋白(bsa)、鸡卵白蛋白(ova)、钥孔血蓝蛋白(klh)、甲状腺球蛋白、酪蛋白。
[0022]
一种肌酐竞争抗原的制备方法，包括：制备肌酐衍生物；以及将所述肌酐衍生物与载体连接，得到所述肌酐竞争抗原。
[0023]
可选地，所述肌酐衍生物的制备过程包括：
[0024]
步骤s1、将60-100mmol的肌酐悬浮到50ml的二甲基甲酰胺(dmf)中，在80-95℃下逐滴加入80-110mmol 5-溴戊酸乙酯，在80-95℃下反应5h；反应结束后，冷却到室温，加入300-600ml乙酸乙酯结晶，过滤，用丙酮清洗滤渣，得到出产物，用真空干燥箱除去残留溶剂，称量得到产物化合物1；
[0025]
步骤s2、将化合物1加入到50ml甲醇中，加入50mmol koh，室温搅拌1h，旋蒸去除甲醇，用乙醇溶解残渣，过滤析出的盐，旋蒸除去乙醇，得到化合物2；
[0026]
步骤s3、在100ml纯水中加入1.1eq的naoh以及化合物2，加热回流5h；反应结束后，蒸发掉乙醇，加入浓hcl溶液，将ph调至3左右，蒸发掉溶剂，得到淡黄色粘稠物质；
[0027]
步骤s4、通过硅胶柱提纯，得到所述肌酐衍生物。
[0028]
所述肌酐衍生物与载体蛋白的偶联包括如下步骤：
[0029]
步骤s1、在mes缓冲液中，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)、n-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)活化肌酐衍生物；
[0030]
步骤s2、向s1中制备好的混合液中加入牛血清白蛋白(bsa)的碳酸盐缓冲溶液(100mm，ph＝8.5,)，过夜；
[0031]
步骤s3、用超滤管离心反应液，收集下清液，在超滤管中加入50ml的pbs缓冲液，继续离心，重复以上步骤三次，获得蛋白浓缩液以及四次离心的下清收集液，该蛋白浓缩液即为所述肌酐竞争抗原。
[0032]
检验肌酐竞争抗原稳定性的方法，包括如下步骤：
[0033]
步骤s1、通过dnba法测试肌酐衍生物与蛋白的偶联效率；
[0034]
步骤s2、将肌酐衍生物与牛血清白蛋白(bsa)的偶联物加入到不同ph的缓冲液中；
[0035]
步骤s3、配制ph＝8.5的碳酸盐缓冲液和ph＝5.5的2-吗啉乙磺酸(mes)缓冲液，分别加入定量的合成抗原，配制成抗原溶液，4℃下静置4h；
[0036]
步骤s4、将溶液用超滤离心，用dnba法测试下清液中是否有游离的肌酐衍生物。
[0037]
本发明实施例提供了一种肌酐竞争抗原及其制备方法以及检测肌酐竞争抗原稳定性的方法。具备以下有益效果：
[0038]
1、本发明制备肌酐竞争抗原的方法步骤简单，制备效率高，具有很强的实用性。
[0039]
2、通过测试，肌酐衍生物与载体的偶联效率较高，且不易脱落，便于后期探索应用。
附图说明：
[0040]
图1为本发明采用dnba法测n＝4为实施例的肌酐衍生物cre-c4-cooh浓度标准曲线；
[0041]
图2为本发明采用dnba法测n＝8为实施例的肌酐衍生物cre-c8-cooh浓度标准曲线。
具体实施方式
[0042]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0043]
实施例1
[0044]
以n＝4，载体蛋白为牛血清白蛋白(bsa)为例，肌酐竞争抗原的制备过程，包括下列步骤进行合成：
[0045]
步骤s1、将60-100mmol的肌酐悬浮到50ml的二甲基甲酰胺dmf中，在80-95℃下逐滴加入80-110mmol5-溴戊酸乙酯，在80-95℃下反应5h；反应结束后，冷却到室温，加入300-600ml乙酸乙酯结晶，过滤，用丙酮清洗滤渣。得到中间产物1，用真空干燥箱除去残留溶剂。
[0046]
步骤s2、将中间产物1加入到50ml甲醇中，加入50mmol koh，能够将前一步反应生成的氢溴酸中和掉，室温搅拌1h，旋蒸去除甲醇。用乙醇溶解残渣，过滤析出的盐，旋蒸除去乙醇，得到中间产物2。
[0047]
步骤s3、在100ml纯水中加入1.1eq的naoh以及化合物2，加入naoh将酯水解，继而实现方便提纯，加热回流5h；反应结束后，蒸发掉乙醇，加入浓hcl溶液，将ph调至3左右，蒸发掉溶剂，得到淡黄色粘稠物质。
[0048]
步骤s4、通过硅胶柱提纯，得到纯物质肌酐衍生物，肌酐衍生物cre-c4-cooh的结构如式(
ⅴ
)所示：
[0049][0050][0051]
肌酐衍生物与载体的连接包括如下步骤：
[0052]
步骤s5、取20mg肌酐衍生物cre-c4-cooh，19mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)，5mg n-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)到0.5ml的mes缓冲液(50mm，ph＝
5.5)中，活化30min；
[0053]
步骤s6、加入3ml牛血清白蛋白(bsa)的碳酸盐缓冲溶液(100mm，ph＝8.5)，其中牛血清白蛋白(bsa)的浓度为20mg/ml，过夜；
[0054]
步骤s7、用超滤管离心反应液，收集下清液，在超滤管中加入50ml的pbs缓冲液，继续离心，重复以上步骤三次，获得蛋白浓缩液以及四次离心的下清收集液，该蛋白浓缩液即为制备的肌酐竞争抗原bsa-c4-cre。bsa-c4-cre的结构如式(ⅵ)所示：
[0055][0056]
实施例2
[0057]
以n＝5，载体蛋白为牛血清白蛋白(bsa)为例，肌酐竞争抗原的制备过程，包括下列步骤进行合成：
[0058]
步骤s1、将60-100mmol的肌酐悬浮到50ml的二甲基甲酰胺dmf中，在80-95℃下逐滴加入90-120mmol 6-溴己酸乙酯，在80-95℃下反应5h；反应结束后，冷却到室温，加入300-600ml乙酸乙酯结晶，过滤，用丙酮清洗滤渣。得到出中间产物1，用真空干燥箱除去残留溶剂。
[0059]
步骤s2、将中间产物1加入到50ml甲醇中，加入50mmol koh，能够将前一步反应生成的氢溴酸中和掉，室温搅拌1h，旋蒸去除甲醇。用乙醇溶解残渣，过滤析出的盐，旋蒸除去乙醇，得到中间产物2。
[0060]
步骤s3、在100ml纯水中加入1.1eq的naoh以及中间产物2，加热回流5h；反应结束后，蒸发掉乙醇，加入浓hcl溶液，将ph调至3左右，蒸发掉溶剂，得到淡黄色粘稠物质。
[0061]
步骤s4、通过硅胶柱提纯，得到纯物质肌酐衍生物cre-c5-cooh，结构如式(ⅶ)所示：
[0062][0063]
肌酐衍生物与载体的连接包括如下步骤：
[0064]
步骤s5、取20mg肌酐衍生物cre-c5-cooh，18mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)，4.4mg n-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)到0.5ml的mes缓冲液(50mm，ph＝5.5)中，活化30min；
[0065]
步骤s6、加入3ml牛血清白蛋白(bsa)的碳酸盐缓冲溶液(100mm，ph＝8.5)，其中牛血清白蛋白(bsa)的浓度为20mg/ml，过夜；
[0066]
步骤s7、用超滤管离心反应液，收集下清液，在超滤管中加入50ml的pbs缓冲液，继续离心，重复以上步骤三次，获得蛋白浓缩液以及四次离心的下清收集液，该蛋白浓缩液即为制备的肌酐竞争抗原bsa-c5-cre，结构如式(
ⅷ
)所示：
[0067][0068]
实施例3
[0069]
以n＝6，载体蛋白为牛血清白蛋白(bsa)为例，肌酐竞争抗原的制备过程，包括下列步骤进行合成：
[0070]
步骤s1、将60-100mmol的肌酐悬浮到50ml的二甲基甲酰胺dmf中，在80-95℃下逐滴加入90-120mmol 7-溴庚酸乙酯，在80-95℃下反应5h；反应结束后，冷却到室温，加入300-600ml乙酸乙酯结晶，过滤，用丙酮清洗滤渣。得到出中间产物1，用真空干燥箱除去残留溶剂。
[0071]
步骤s2、将中间产物1加入到50ml甲醇中，加入50mmol koh，能够将前一步反应生成的氢溴酸中和掉，室温搅拌1h，旋蒸去除甲醇。用乙醇溶解残渣，过滤析出的盐，旋蒸除去乙醇，得到中间产物2。
[0072]
步骤s3、在100ml纯水中加入1.1eq的naoh以及中间产物2，加热回流5h；反应结束后，蒸发掉乙醇，加入浓hcl溶液，将ph调至3左右，除去溶剂，得到淡黄色物质。
[0073]
步骤s4、通过硅胶柱提纯，得到纯物质肌酐衍生物cre-c6-cooh，结构如式(
ⅸ
)所示：
[0074][0075]
肌酐衍生物与载体的连接包括如下步骤：
[0076]
步骤s5、取20mg肌酐衍生物cre-c6-cooh，16.7mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)，4.2mg n-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)到0.5ml的mes缓冲液(50mm，ph＝5.5)中，活化30min；
[0077]
步骤s6、加入3ml牛血清白蛋白(bsa)的碳酸盐缓冲溶液(100mm，ph＝8.5)，其中牛血清白蛋白(bsa)的浓度为20mg/ml，过夜；
[0078]
步骤s7、用超滤管离心反应液，收集下清液，在超滤管中加入50ml的pbs缓冲液，继续离心，重复以上步骤三次，获得蛋白浓缩液以及四次离心的下清收集液，该蛋白浓缩液即为制备的肌酐竞争抗原bsa-c6-cre，结构如式(
ⅹ
)所示：
[0079][0080]
实施例4
[0081]
以n＝7，载体蛋白为牛血清白蛋白(bsa)为例，肌酐竞争抗原的制备过程，包括下列步骤进行合成：
[0082]
步骤s1、将60-100mmol的肌酐悬浮到50ml的dmf中，在80-95℃下加入100mmol 8-溴辛酸乙酯，在80-95℃下反应5h；反应结束后，冷却到室温，加入400-600ml乙酸乙酯结晶，过滤，用丙酮清洗滤渣。得到出中间产物1，用真空干燥箱除去残留溶剂。
[0083]
步骤s2、将中间产物1加入到60ml甲醇中，加入50mmol koh，室温搅拌1h，旋蒸去除甲醇。用乙醇溶解残渣，过滤析出的盐，旋蒸除去乙醇，得到中间产物2。
[0084]
步骤s3、在100ml纯水中加入1.1eq的naoh以及中间产物2，加热回流5h；反应结束后，蒸发掉乙醇，加入浓hcl溶液，将ph调至3左右，蒸发掉溶剂，得到淡黄色固体。
[0085]
步骤s4、通过硅胶柱提纯，得到纯物质肌酐衍生物cre-c7-cooh，结构如式(
ⅺ
)所示：
[0086][0087]
肌酐衍生物与载体的连接包括如下步骤：
[0088]
步骤s5、取20mg肌酐衍生物cre-c7-cooh，15.8mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)，4mg n-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)到0.5ml的mes缓冲液(50mm，ph＝5.5)中，活化30min；
[0089]
步骤s6、加入3ml牛血清白蛋白(bsa)的碳酸盐缓冲溶液(100mm，ph＝8.5)，其中牛血清白蛋白(bsa)的浓度为20mg/ml，过夜；
[0090]
步骤s7、用超滤管离心反应液，收集下清液，在超滤管中加入50ml的pbs缓冲液，继
续离心，重复以上步骤三次，获得蛋白浓缩液以及四次离心的下清收集液，该蛋白浓缩液即为制备的肌酐竞争抗原bsa-c7-cre，结构如式(
ⅻ
)所示：
[0091][0092]
实施例5
[0093]
以n＝8，载体蛋白为牛血清白蛋白(bsa)为例，肌酐竞争抗原的制备过程，包括下列步骤进行合成：
[0094]
步骤s1、将60-100mmol的肌酐悬浮到50ml的dmf中，在80-95℃下加入100mmol 9-溴壬酸乙酯，在80-95℃下反应5h；反应结束后，冷却到室温，加入400-600ml乙酸乙酯结晶，过滤，用丙酮清洗滤渣。得到出中间产物1，用真空干燥箱除去残留溶剂。
[0095]
步骤s2、将中间产物1加入到60ml甲醇中，加入50mmol koh，室温搅拌1h，旋蒸去除甲醇。用乙醇溶解残渣，过滤析出的盐，旋蒸除去乙醇，得到中间产物2。
[0096]
步骤s3、在100ml纯水中加入1.1eq的naoh以及中间产物2，加热回流5h；反应结束后，蒸发掉乙醇，加入浓hcl溶液，将ph调至3左右，蒸发掉溶剂，得到淡黄色固体。
[0097]
步骤s4、通过硅胶柱提纯，得到纯物质肌酐衍生物cre-c8-cooh，结构如式(xiii)所示：
[0098][0099]
肌酐衍生物与载体的连接包括如下步骤：
[0100]
步骤s5、取20mg肌酐衍生物cre-c8-cooh，15mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)，3.7mgn-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)到0.5ml的mes缓冲液(50mm，ph＝5.5)中，活化30min；
[0101]
步骤s6、加入2.5ml牛血清白蛋白(bsa)的碳酸盐缓冲溶液(100mm，ph＝8.5)，其中牛血清白蛋白(bsa)的浓度为20mg/ml，过夜；
[0102]
步骤s7、用超滤管离心反应液，收集下清液，在超滤管中加入50ml的pbs缓冲液，继续离心，重复以上步骤三次，获得蛋白浓缩液以及四次离心的下清收集液，该蛋白浓缩液即为制备的肌酐竞争抗原bsa-c8-cre，结构如式(xiv)所示：
[0103][0104]
实施例6
[0105]
以n＝15，载体蛋白为牛血清白蛋白(bsa)为例，肌酐竞争抗原的制备过程，包括下列步骤进行合成：
[0106]
步骤s1、将60-100mmol的肌酐悬浮到50ml的dmf中，在80-95℃下加入100mmol 16-溴十六酸乙酯，在80-95℃下反应5h；反应结束后，冷却到室温，加入400-600ml乙酸乙酯结晶，过滤，用丙酮清洗滤渣。得到出中间产物1，用真空干燥箱除去残留溶剂。
[0107]
步骤s2、将中间产物1加入到60ml甲醇中，加入50mmol koh，室温搅拌1h，旋蒸去除甲醇。用乙醇溶解残渣，过滤析出的盐，旋蒸除去乙醇，得到中间产物2。
[0108]
步骤s3、在100ml纯水中加入1.1eq的naoh以及中间产物2，加热回流5h；反应结束后，蒸发掉乙醇，加入浓hcl溶液，将ph调至3左右，除掉溶剂，得到淡黄色固体。
[0109]
步骤s4、通过硅胶柱提纯，得到纯物质肌酐衍生物cre-c15-cooh，结构如式(xv)所示：
[0110][0111]
肌酐衍生物与载体的连接包括如下步骤：
[0112]
步骤s5、取40mg肌酐衍生物cre-c15-cooh，21mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)，5.4mg n-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)到0.5ml的mes缓冲液(50mm，ph＝5.5)中，活化30min；
[0113]
步骤s6、加入3.6ml牛血清白蛋白(bsa)的碳酸盐缓冲溶液(100mm，ph＝8.5)，其中牛血清白蛋白(bsa)的浓度为20mg/ml，过夜；
[0114]
步骤s7、用超滤管离心反应液，收集下清液，在超滤管中加入50ml的pbs缓冲液，继续离心，重复以上步骤三次，获得蛋白浓缩液以及四次离心的下清收集液，该蛋白浓缩液即为制备的肌酐竞争抗原bsa-c15-cre，结构如式(xvi)所示：
[0115][0116]
实施例7
[0117]
以n＝20，载体蛋白为牛血清白蛋白(bsa)为例，肌酐竞争抗原的制备过程，包括下列步骤进行合成：
[0118]
步骤s1、将60-100mmol的肌酐悬浮到50ml的dmf中，在80-95℃下加入100mmol 21-溴二十一酸乙酯，在80-95℃下反应5h；反应结束后，冷却到室温，加入300-600ml乙酸乙酯结晶，过滤，用丙酮清洗滤渣。得到出产物，用真空干燥箱除去残留溶剂，称量产物化合物1。
[0119]
步骤s2、将化合物1加入到50ml甲醇中，加入50mmol koh，室温搅拌1h，旋蒸去除甲醇。用乙醇溶解残渣，过滤析出的盐，旋蒸除去乙醇，得到化合物2
[0120]
步骤s3、在100ml纯水中加入1.1eq的naoh以及化合物2，加热回流5h；反应结束后，蒸发掉乙醇，加入浓hcl溶液，将ph调至3左右，除掉溶剂，得到淡黄色固体。
[0121]
步骤s4、通过硅胶柱提纯，得到纯物质肌酐衍生物cre-c20-cooh，结构如式(xvii)所示：
[0122][0123]
肌酐衍生物与载体的连接包括如下步骤：
[0124]
步骤s5、取40mg肌酐衍生物cre-c20-cooh，18.5mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)，4.6mg n-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)到0.5ml的mes缓冲液(50mm，ph＝5.5)中，活化30min；
[0125]
步骤s6、加入2ml牛血清白蛋白(bsa)的碳酸盐缓冲溶液(100mm，ph＝8.5)，其中牛血清白蛋白(bsa)的浓度为30mg/ml，过夜；
[0126]
步骤s7、用超滤管离心反应液，收集下清液，在超滤管中加入50ml的pbs缓冲液，继续离心，重复以上步骤三次，获得蛋白浓缩液以及四次离心的下清收集液，该蛋白浓缩液即为制备的肌酐竞争抗原。bsa-c20-cre，结构如式(xviii)所示：
[0127][0128]
实施例8
[0129]
以n＝4为例，载体蛋白为牛血清白蛋白(bsa)与肌酐衍生物cre-c4-cooh之间结合的稳定性检测方法：
[0130]
步骤：用dnba法测试肌酐衍生物与蛋白的偶联效率
[0131]
其中计算偶联效率的方法为：dnba(3,5-二硝基苯甲酸)与肌酐衍生物存在明显的变色反应，且反应物在525nm左右有特征吸收峰。因此，分别配制不同浓度的肌酐衍生物的水溶液，1mg/ml、0.8mg/ml、0.6mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml、0.18mg/ml、0.14mg/ml、0.1mg/ml、0.08mg/ml，配制dnba与肌酐衍生物的混合溶液，测试525nm左右的最高吸收峰吸光度，绘制标准曲线y＝0.351x-0.072(x为525nm左右吸光度；y为肌酐衍生物含量，单位为mg/ml)，r2＝0.995，如图1所示。测试四次离心收集的下清与dnba混合溶液的吸光度，根据标准曲线，计算可得下清中肌酐衍生物的质量，已知投入反应的肌酐衍生物cre-c4-cooh的总量为20mg，可知与蛋白偶联的cre-c4-cooh的质量0.6067mg。因牛血清白蛋白(bsa)在280nm处存在特征吸收峰，因此配制不同浓度的牛血清白蛋白(bsa)的pbs缓冲溶液，以pbs缓冲液为空白，扫描各溶液吸收峰，同理，可以绘制标准曲线，y＝4.203x-0.262(x为280nm处吸光度；y为牛血清白蛋白(bsa)的含量，单位是mg/ml)，r2＝0.998；
[0132]
测量超滤管中上清液的体积，将超滤管中收集的蛋白浓缩液，用pbs稀释一定的倍数，测量280nm处的吸光度，计算出蛋白浓度、超滤管中蛋白质量以及蛋白的回收率。目前已知超滤管中蛋白质量和肌酐衍生物的质量，牛血清白蛋白(bsa)与肌酐衍生物cre-c4-cooh的分子量已知，可计算出二者的结合效率为17.98。
[0133]
稳定性测试：分别将肌酐衍生物与牛血清白蛋白(bsa)的偶联物加入到不同ph的缓冲液中，考察合成的抗原在不同ph环境中稳定性。配制ph＝8.5的碳酸盐缓冲液和ph＝5.5的2-吗啉乙磺酸(mes)缓冲液，分别加入定量的合成抗原，配制成抗原溶液。4℃静置4h后将溶液用超滤离心，用dnba法测试下清液中是否有游离的肌酐衍生物cre-c4-cooh。
[0134]
竞争抗原cre-c4-cooh在两种缓冲液中稳定性考察
[0135] 4h8h1d4dph＝8.5
‑‑‑
+ph＝5.5
‑‑‑
+
[0136]
注：-表示下清液与dnba无变色反应
[0137]
+表示下清液与dnba有变色反应
[0138]
实施例9
[0139]
以n＝8，载体蛋白为牛血清白蛋白(bsa)与肌酐衍生物cre-c8-cooh之间偶联稳定
性的检测方法
[0140]
用dnba法测试肌酐衍生物cre-c8-cooh与蛋白的偶联效率，以及测试后期的稳定性。
[0141]
其中计算偶联效率的方法通过dnba(3,5-二硝基苯甲酸)与肌酐衍生物cre-c8-cooh存在明显的变色反应，且反应物在525nm左右有特征吸收峰。
[0142]
因此，分别配制不同浓度的肌酐衍生物cre-c8-cooh的水溶液，配制dnba与肌酐衍生物的混合溶液，测试525nm左右的最高吸收峰吸光度，绘制标准曲线y＝0.724x-0.154(x为525nm左右吸光度；y为肌酐衍生物含量，单位为mg/ml)，r2＝0.992，如图2所示；
[0143]
测试四次离心收集的下清与dnba混合溶液的吸光度，根据标准曲线，计算可得下清中肌酐衍生物的质量，已知投入反应的肌酐衍生物的总量为20mg，可知与蛋白偶联的肌酐衍生物的质量0.6766mg。因牛血清白蛋白(bsa)在280nm处存在特征吸收峰，已知标准曲线为y＝4.203x-0.262(x为280nm处吸光度；y为牛血清白蛋白(bsa)的含量，单位是mg/ml)，r2＝0.998。测量超滤管中上清液的体积，将超滤管中收集的蛋白浓缩液，用pbs稀释一定的倍数，测量280nm处的吸光度，计算出蛋白浓度、超滤管中蛋白质量以及蛋白的回收率。已知超滤管中蛋白质量和肌酐衍生物cre-c8-cooh的质量，牛血清白蛋白(bsa)与肌酐衍生物cre-c8-cooh的分子量已知，可计算出二者的结合效率为18.58。
[0144]
其中稳定性测试的方法分别将肌酐衍生物cre-c8-cooh与牛血清白蛋白(bsa)的偶联物加入到不同ph的缓冲液中，考察合成的抗原在不同ph环境中稳定性。配制ph＝8.5的碳酸盐缓冲液和ph＝5.5的mes(2-吗啉乙磺酸)缓冲液，分别加入定量的合成抗原，配制成抗原溶液。4℃静置4h后将溶液用超滤管离心，用dnba法测试下清液中是否有游离的肌酐衍生物cre-c8-cooh。
[0145]
竞争抗原cre-c8-cooh在两种缓冲液中稳定性考察
[0146] 4h8h1d4dph＝8.5
‑‑‑
+ph＝5.5
‑‑‑
+
[0147]
注：-表示下清液与dnba无变色反应
[0148]
+表示下清液与dnba有变色反应
[0149]
实施例10
[0150]
检测肌酐竞争抗原与抗肌酐抗体的结合能力
[0151]
用pbs将实施例1-7中的肌酐竞争抗体稀释成一定浓度，100μl/孔包被在96孔酶联板上，4℃放置12-24h，用pbs将上述包被有肌酐竞争抗体的96孔酶联板洗涤3次后，加入200μl/孔的0.5％的bsa溶液，4℃封闭放置8-16h。然后用pbs洗涤3次，加入100μl/孔hrp-抗肌酐抗体偶联物，室温下孵育30min后用pbs洗板5次，然后每孔加入100μltmb底物，室温孵育30min。再每孔加入100μl终止液。测定450nm的吸光值。比对每种肌酐竞争抗原与肌酐抗体的结合能力。
[0152]
n空白456781520od值0.00462.80222.8412.91093.23813.41212.93422.9021
[0153]
要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在
任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0154]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。