基于Hn基因调控亚洲小车蝗聚集迁飞行为的应用及蝗虫治理方法

基于hn基因调控亚洲小车蝗聚集迁飞行为的应用及蝗虫治理方法
技术领域
1.本发明属于草原害虫治理技术领域，具体的说是涉及一种基于hn基因调控亚洲小车蝗聚集迁飞行为的应用及蝗虫治理方法。


背景技术：

2.亚洲小车蝗是一种重要的草原经济害虫，亚洲小车蝗广泛分布于北方草原地区，主要取食为害禾本科牧草和禾本科作物，对北方草原地区造成严重危害，严重威胁到农牧业生产，亚洲小车蝗为害的禾本科牧草如羊草、针茅和糙隐子草等，为害的禾本科作物如小麦、玉米和高粱等。现有技术中比较传统高效的针对亚洲小车蝗的害虫防治方法通常都是通过使用化学农药来实现，化学农药的使用将导致环境受到污染，而且大量的农药残留会危害人畜健康。此外，长期使用化学农药方法防治害虫会增强昆虫的抗药性，一方面阻碍了害虫的有效防控，另一方面也不利于环境的可持续发展，因此，绿色可持续的害虫防治技术急待开发。


技术实现要素：

3.本发明为了克服现有技术存在的不足，提供一种基于hn基因调控亚洲小车蝗聚集迁飞行为的应用及蝗虫治理方法。
4.本发明是通过以下技术方案实现的：本发明公开了一种基于hn基因调控亚洲小车蝗聚集迁飞行为的应用，该应用发现了一种调控亚洲小车蝗发生型变的关键基因hn，应用hn基因调控亚洲小车蝗的表型可塑性，利用hn基因的转录调控抑制亚洲小车蝗表型由散居型向群居型转变；
5.hn基因的核苷酸序列如下所示：
[0006][0007][0008]
该应用设计出一种亚洲小车蝗hn基因的有效干扰序列，hn基因有效干扰序列的核苷酸序列如下所示：
[0009][0010]
本发明还公开了一种基于hn基因调控亚洲小车蝗聚集迁飞行为的蝗虫治理方法，该蝗虫治理方法利用hn基因设计双链rna对亚洲小车蝗进行注射，显著降低亚洲小车蝗发生型变的比例，从而有效阻止亚洲小车蝗群居个体的形成和蝗群的暴发；
[0011]
hn基因双链rna片段的qpcr引物序列hn-3f和hn-3r的引物序列如下：
[0012]
hn-1f 5’atggacgattcgcaggttatg 3’；
[0013]
hn-1r 5’gctttggtatggtacaaatcagga 3’；
[0014]
hn-2f 5’taatacgactcactatagggctggcagggttggctttc 3’；
[0015]
hn-2r 5’taatacgactcactatagggtgaccatcttgacggcaca 3’；
[0016]
hn-3f 5’tcccacttctcattgaaaactg 3’；
[0017]
hn-3r 5’gaagtcccgtgatgacagaag 3’。
[0018]
本发明蝗虫治理方法通过人为注射hn基因的双链rna，有效抑制亚洲小车蝗由居留型向迁飞型转变，阻碍迁飞型群体的形成，从而有效防止亚洲小车蝗的暴发为害。
[0019]
本发明蝗虫治理方法具体包括如下步骤：
[0020]
(1)取5μl～6μl 1000ng/μl的双链rna于3-4龄居留型蝗虫2-3腹节进行注射，实验设置3个重复，每个重复20头；
[0021]
(2)设置等量对照组注射双链gfp，观察记录实验组和对照组蝗虫体表颜色的变化和发生型变的比例，记录周期为9天；
[0022]
(3)双链rna干扰后检测基因表达量，注射双链rna 48h后取整头蝗虫于液氮处理提取rna反转录生成模板cdna，根据hn基因保守区重新设计引物hn-3f和hn-3r；
[0023]
(4)用于hn基因表达量测定，以actin作为内参基因，利用实时荧光定量pcr方法检测处理组和对照组中hn基因的相对表达量，每个样本进行3个生物学重复；
[0024]
(5)hn基因双链rna干扰效率结果如图2所示，注射双链rna 48h后亚洲小车蝗hn基因的表达量显著低于对照组，mrna表达水平相对于对照组表达量下降了3.33～3.35倍，hn基因双链rna在亚洲小车蝗体内产生强烈的干扰效应，抑制了hn基因的表达。
[0025]
用rna提取试剂盒提取亚洲小车蝗总rna，反转录试剂盒反转录为cdna，以cdna为模板扩增亚洲小车蝗hn基因，hn基因的pcr扩增条件为：90℃～95℃预变性反应3min～5min；随后，92℃～96℃变性38s～32s，55℃～60℃退火25s～35s，70℃～75℃延伸0.8min～1.2min，循环32次～36次；最后70℃～75℃延伸8min～12min，反应体系为24μl～26μl：ddh2o 9～10；模板cdna0.8μl～1.2μl；上下游引物各10μl～12μl；2
×
taq pcr master mix 12.4μl～12.6μl。
[0026]
作为本发明的优选实施方式，hn基因的pcr扩增条件为：94℃预变性反应4min；随后，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环34次；最后72℃延伸10min，反应体系为25μl：ddh2o 9.5；模板cdna 1μl；上下游引物各11μl；2
×
taq pcr master mix 12.51μl。
[0027]
pcr扩增得到的hn连接质粒转化大肠杆菌后送出测序；测序获得正确序列后取其保守区域重新设计引物hn-2f和hn-2r，分别在引物5’端加t7启动子用于双链rna合成，将引物进行pcr扩增，连接载体转化大肠杆菌后菌液测序，取正确的菌液过夜培养后提取质粒；以上步骤获得质粒作为模板使用t7rna合成试剂盒获得长度为254bp的双链rna，分光光度计检测浓度后于-20℃保存待用。
[0028]
蝗虫的表型可塑性对其爆发成灾具有重要的影响意义，亚洲小车蝗在田间存在两种表型，绿色的居留型和褐色的迁飞型，居留型和迁飞型的虫体如说明书附图的图1所示，居留型蝗虫的生存环境种群密度水平较低，迁飞型则更倾向于形成高密度种群且易暴发，蝗虫暴发地区迁飞型个体可达到种群密度的80％，居留型个体表型可在一定条件下向迁飞型转变，这种改变促进蝗虫种群的暴发。分子水平上促进散居表型向群居表型转变的一个重要基因是hn(苯丙氨酸羟化酶基因)，本发明通过人为注射hn基因的双链rna，能够有效抑制亚洲小车蝗由居留型向迁飞型转变，阻碍迁飞型群体的形成，从而有效防止蝗虫的暴发。
[0029]
本发明的有益效果是：本发明主要涉及草原害虫治理技术领域，并具体公开了一种基于hn基因调控亚洲小车蝗聚集迁飞行为的应用及蝗虫治理方法，具体的说是涉及一种有效抑制亚洲小车蝗发生型变的方法。本发明提供了亚洲小车蝗hn基因的有效干扰序列并用于防治蝗虫的应用，本发明通过注射双链rna片段抑制居留型亚洲小车蝗向迁飞型转变，降低亚洲小车蝗暴发为害的机率，达到有效控制蝗虫暴发为害的目的。本发明的主要治理原理为：hn基因缺乏会导致亚洲小车蝗发生型变的比例降低，抑制蝗虫由居留型向迁飞型转变，通过调控亚洲小车蝗苯丙氨酸羟化酶基因hn，抑制亚洲小车蝗的表型由绿色居留型体色转变为褐色迁飞型体色，该基因表达量的上升能够促进形成褐色迁飞型体色，缺乏hn基因会抑制蝗虫迁飞表型的形成。本发明中的蝗虫治理方法能够阻止亚洲小车蝗成群暴发，对亚洲小车蝗的防控具有重要意义。本发明利用hn基因可以调控草原害虫亚洲小车蝗型变的功能，通过基因调控手段，抑制其聚集迁飞，减少蝗虫对草原的为害。
附图说明
[0030]
图1是亚洲小车蝗群居型成虫和散居型成虫的虫体示意图；
[0031]
图2是注射双链rna后48h亚洲小车蝗hn基因表达量图；
[0032]
图3是注射双链rna后对照组和处理组发生型变的比例柱形图；
[0033]
图4是注射双链rna前后亚洲小车蝗体色变化情况示意图。
具体实施方式
[0034]
以下结合附图和具体实施方式对本发明作详细描述。下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不是用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造生产商所建议的条件进行。
[0035]
本发明所用试剂均为市售试剂，本发明所用的主试剂及生产商：rna提取试剂盒、反转录试剂盒(promega公司，美国)。4.2
×
taq pcr master mix、dna回收试剂(天根公司，中国)。pgem-t easy vector(takara公司，日本)。质粒dna提取试剂盒(天根公司，中国)。大肠杆菌dh5α感受态细胞(天根公司，中国)。t7 ribomax
tm express rnai system，qpcr master mix(promega公司，美国)。本发明实施例中用到的引物序列均由北京厚生博泰生物
技术有限公司完成。
[0036]
基于实验室亚洲小车蝗前期转录组结果获得亚洲小车蝗hn基因序列，通过ncb-biast进行搜索预测该基因cds区，设计双链rna片段和表达量测定的qpcr引物序列hn-3f和hn-3r。
[0037]
本发明公开了一种基于hn基因调控亚洲小车蝗聚集迁飞行为的应用，该应用发现了一种调控亚洲小车蝗发生型变的关键基因hn，应用hn基因调控亚洲小车蝗的表型可塑性，利用hn基因的转录调控抑制亚洲小车蝗表型由散居型向群居型转变。该应用设计出一种亚洲小车蝗hn基因的有效干扰序列。
[0038]
本发明还公开了一种基于hn基因调控亚洲小车蝗聚集迁飞行为的蝗虫治理方法，该蝗虫治理方法利用hn基因设计双链rna对亚洲小车蝗进行注射，显著降低亚洲小车蝗发生型变的比例，从而有效阻止亚洲小车蝗群居个体的形成和蝗群的暴发；hn基因双链rna片段的qpcr引物序列hn-3f和hn-3r的引物序列如下：
[0039][0040][0041]
本发明蝗虫治理方法通过人为注射hn基因的双链rna，有效抑制亚洲小车蝗由居留型向迁飞型转变，阻碍迁飞型群体的形成，从而有效防止亚洲小车蝗的暴发为害。
[0042]
本发明蝗虫治理方法具体包括如下步骤：(1)取5μl～6μl 1000ng/μl的双链rna于3-4龄居留型蝗虫2-3腹节进行注射，实验设置3个重复，每个重复20头；(2)设置等量对照组注射双链gfp，观察记录实验组和对照组蝗虫体表颜色的变化和发生型变的比例，记录周期为9天；(3)双链rna干扰后检测基因表达量，注射双链rna 48h后取整头蝗虫于液氮处理提取rna反转录生成模板cdna，根据hn基因保守区重新设计引物hn-3f和hn-3r；(4)用于hn基因表达量测定，以actin作为内参基因，利用实时荧光定量pcr方法检测处理组和对照组中hn基因的相对表达量，每个样本进行3个生物学重复；(5)hn基因双链rna干扰效率结果如图2所示，注射双链rna 48h后亚洲小车蝗hn基因的表达量显著低于对照组，mrna表达水平相对于对照组表达量下降了3.33～3.35倍，hn基因双链rna在亚洲小车蝗体内产生强烈的干扰效应，抑制了hn基因的表达。
[0043]
用rna提取试剂盒提取亚洲小车蝗总rna，反转录试剂盒反转录为cdna，以cdna为模板扩增亚洲小车蝗hn基因，hn基因的pcr扩增条件为：94℃预变性反应4min；随后，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环34次；最后72℃延伸10min，反应体系为25μl：
ddh2o 9.5；模板cdna 1μl；上下游引物各11μl；2
×
taq pcr master mix 12.51μl。
[0044]
pcr扩增得到的hn连接质粒转化大肠杆菌后送出测序；测序获得正确序列后取其保守区域重新设计引物hn-2f和hn-2r，分别在引物5’端加t7启动子用于双链rna合成，将引物进行pcr扩增，连接载体转化大肠杆菌后菌液测序，取正确的菌液过夜培养后提取质粒；以上步骤获得质粒作为模板使用t7rna合成试剂盒获得长度为254bp的双链rna，分光光度计检测浓度后于-20℃保存待用。
[0045]
注射双链rna后将对照组和处理组分别以20头/笼(30cm
×
30cm
×
30cm)的密度饲养，观察记录亚洲小车蝗体色变化情况，并连续观察9日，比较对照组和处理组发生型变个体的比例以评估hn基因双链rna在亚洲小车蝗体内的干扰效率和对表型的影响。结果如图3所示，对照组个体在群居处理9天后大量个体体色由绿色转变为褐色，注射hn基因双链rna 9天后仅个别个体体色发生变化，对照组型变比例显著高于实验组这表明hn基因双链rna能够有效抑制亚洲小车蝗群居体色的形成。发生型变比例结果如图3所示，相同空间和种群密度下对照组型变个体比例为45％，处理组型变比例仅为3.33％，注射hn基因双链rna后显著降低亚洲小车蝗的型变比例，即注射hn基因双链rna能够显著抑制居留型亚洲小车蝗由居留型向迁飞型转变。
[0046]
本发明合成了hn基因的双链rna，并将hn基因的双链rna注射到亚洲小车蝗体内，通过种群密度对亚洲小车蝗型变比例的影响检测hn基因在亚洲小车蝗由居留型(散居型)向迁飞型(群居型)转变的调控作用，可应用于控制亚洲小车蝗的暴发为害。
[0047]
hn orf1(开放阅读框)：
[0048]
[0049][0050][0051]
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。