一种枇杷果肉颜色的分子标记引物对、试剂盒和检测方法及应用

1.本发明属于分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种枇杷果肉颜色的分子标记引物对、试剂盒和检测方法及应用。


背景技术：

2.枇杷(eriobotrya japonica lindl.)是原产于我国四川大渡河流域的特色水果，其果实甜酸适口、柔软多汁，受到世界各国消费者的喜爱。枇杷品种丰富多样，生产上常依据果肉颜色将枇杷品种划分为黄肉枇杷和白肉枇杷两种类型。黄肉枇杷果肉较紧密，果皮较厚，较耐贮运，抗逆性强，平均单果重较大，而白肉枇杷肉质细嫩、汁多味甜，因其风味好、口感佳而更受消费者的青睐。
3.果肉颜色是枇杷果实的重要的农艺性状，选育不同果肉颜色的枇杷新品种/系成为果树育种家共同追求的目标。但枇杷杂交实生苗童期较长，基于果肉颜色性状的枇杷育种材料筛选需耗费育种者大量的时间和精力。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种枇杷果肉颜色的分子标记引物对、试剂盒和检测方法及应用，利用所述分子标记可准确的将黄肉和白肉枇杷种质资源区分。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种枇杷果肉颜色的分子标记引物对，所述分子标记引物对包括psy2a-1f和psy2a-1r的组合，或psy2a-2f和psy2a-2r的组合；
7.所述psy2a-1f的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述psy2a-1r的核苷酸序列如seq id no.2所示；
8.所述psy2a-2f的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述psy2a-2r的核苷酸序列如seq id no.4所示。
9.优选的，所述果肉颜色包括黄色和白色。
10.本发明还提供了一种鉴定枇杷果肉颜色的试剂盒，所述试剂盒中包括上述分子标记引物对和pcr扩增试剂。
11.优选的，所述pcr扩增试剂包括pcr mix。
12.本发明还提供了一种鉴定枇杷种质的果肉颜色的方法，包括以下步骤：以枇杷种质的基因组dna为模板，与上述分子标记引物对或上述试剂盒中的分子标记引物对配制pcr反应体系，进行pcr扩增，对pcr扩增产物进行基因分型；
13.当pcr扩增产物显示为300～400bp长度的一条带时，为白色果肉；当 pcr扩增产物显示为＞500bp长度的一条带时，为黄色果肉；当pcr扩增产物显示为300～400bp和＞500bp两条带时，为黄色果肉。
14.优选的，所述基因组dna来源于枇杷种质的嫩叶或茎尖。
15.优选的，所述pcr反应体系以25μl计，包括：1.0μl模板，12.5μl2
×
pcr mix，1.0μl 10μm的f引物，1.0μl 10μm的r引物和余量的ddh2o。
16.优选的，所述pcr扩增的程序包括：4℃预变性4min；95℃变性1min， 55℃退火45s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸10min。
17.优选的，使用1％的琼脂糖凝胶电泳和/或8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳对所述pcr扩增产物进行基因分型。
18.本发明还提供了上述分子标记引物对或上述试剂盒在分子标记辅助培育目标颜色果肉枇杷种质中的应用。
19.有益效果：本发明提供了一种枇杷果肉颜色的分子标记引物对，基于枇杷八氢番茄红素合成酶基因ejpsy2a在黄肉和白肉枇杷品种间的序列差异设计得到，利用所述分子标记引物对进行pcr扩增，当pcr扩增产物为小片段纯合带型材料的果实为白肉，而大片段纯合带型以及大片段与小片段杂合带型材料的果实为黄肉，可以有效地把黄肉和白肉枇杷种质资源及杂交后代区分开来，可用于枇杷果肉颜色的分子标记辅助育种。本发明实施例中利用世界各地85份枇杷种质资源及杂交后代进行验证，其中43份白肉枇杷材料带型为纯合的小片段，9份黄肉枇杷带型为纯合大片段，另有33份黄肉枇杷材料的带型为杂合带型，所有黄肉枇杷至少有一条大片段，准确率100％，因此根据带型可以将黄肉和白肉枇杷准确的区分开来。进一步ta克隆结果显示，白肉枇杷的小片段是由于ejpsy2a基因在3’端有一段694bp的碱基缺失，为ejpsy2ad等位基因；而黄肉枇杷中至少有一个正常的ejpsy2a基因，因此本发明可以用于不同果肉颜色枇杷品种选育，对指导枇杷杂交后代早龄选择育种具有重要意义。
附图说明
20.图1为完熟期枇杷果皮及果肉颜色(白肉材料：阳光白和贵妃；黄肉材料：大五星和黄丰)；
21.图2为使用新设计的indel引物对10份黄肉和10份白肉枇杷材料pcr 扩增结果；
22.图3为indel分子标记对43份白肉枇杷材料的分型结果；
23.图4为indel分子标记对42份黄肉枇杷材料的分型结果；
24.图5为使用ta克隆法检测部分枇杷材料扩增片段的序列(白肉材料： tbw、新白8号和贵妃；黄肉材料：艳红、大五星和tby)。
具体实施方式
25.本发明提供了一种枇杷果肉颜色的分子标记引物对，所述分子标记引物对包括psy2a-1f和psy2a-1r的组合，或psy2a-2f和psy2a-2r的组合；
26.所述psy2a-1f的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述psy2a-1r的核苷酸序列如seq id no.2所示；
27.所述psy2a-2f的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述psy2a-2r的核苷酸序列如seq id no.4所示。
28.本发明所述分子标记引物对(表1)可用于鉴定果肉颜色，所述果肉颜色优选包括黄色和白色。
29.表1分子标记引物对信息
[0030][0031]
本发明所述分子标记引物对，优选为基于枇杷八氢番茄红素合成酶基因 ejpsy2a在黄肉和白肉枇杷品种间的序列差异设计得到的indel分子标记，在枇杷的白肉品种中，ejpsy2a基因在3’端发生大片段的缺失导致八氢番茄红素合成酶失活从而致使类胡萝卜素无法正常合成和积累；而在黄肉品种中，ejpsy2a基因序列正常。
[0032]
本发明还提供了一种鉴定枇杷果肉颜色的试剂盒，所述试剂盒中包括上述分子标记引物对和pcr扩增试剂。
[0033]
本发明所述试剂盒中除包括上述分子标记引物对外，还包括了pcr扩增试剂，所述pcr扩增试剂优选包括pcr mix。在实施例中，所述pcr mix 在使用时，优选利用2
×
pcr mix，所述2
×
pcr mix优选购自擎科。
[0034]
本发明所述试剂盒中，各引物优选均溶于ddh2o，并配制成10μm的工作液。
[0035]
本发明还提供了一种鉴定枇杷种质的果肉颜色的方法，包括以下步骤：以枇杷种质的基因组dna为模板，与上述分子标记引物对或上述试剂盒中的分子标记引物对配制pcr反应体系，进行pcr扩增，对pcr扩增产物进行基因分型；
[0036]
当pcr扩增产物显示为300～400bp长度的一条带时，为白色果肉；当 pcr扩增产物显示为＞500bp长度的一条带时，为黄色果肉；当pcr扩增产物显示为300～400bp和＞500bp两条带时，为黄色果肉。
[0037]
本发明对所述基因组dna的提取方法并没有特殊限定，优选利用改良 ctab法进行枇杷基因组dna的提取(doyle j.j.t.,and doyle j.l.,1990, isolation of plant dna from fresh tissue,focus 12(1):13-15.)。本发明所述基因组dna优选来源于枇杷种质的嫩叶或茎尖，因此利用本发明所述方法可早期对枇杷种质的果肉颜色进行区分。
[0038]
本发明所述pcr反应体系以25μl计，优选包括：1.0μl模板，12.5μl2
×
pcr mix，1.0μl 10μm的f引物，1.0μl 10μm的r引物和余量的ddh2o。本发明所述pcr扩增的程序，优选包括：4℃预变性4min；95℃变性1min， 55℃退火45s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸10min。
[0039]
本发明对所述pcr反应体系扩增得到的pcr扩增产物进行基因分型，优选使用1％的琼脂糖凝胶电泳和/或8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳对所述pcr 扩增产物进行基因分型。本发明对所述琼脂糖凝胶电泳和/聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规电泳方法即可。
[0040]
本发明还提供了上述分子标记引物对或上述试剂盒在分子标记辅助培育目标颜色果肉枇杷种质中的应用。
[0041]
本发明首先选用10份黄肉和10份白肉枇杷种质资源对基于ejpsy2a基因所设计的
indel分子标记引物进行初步验证和筛选，然后使用选定的引物对85份世界各地枇杷种质资源与杂交后代进行pcr扩增和基因分型，对分子标记的准确性进行最终的验证，验证准确率为100％，可用于枇杷果肉颜色分子标记辅助育种。
[0042]
下面结合实施例对本发明提供的一种枇杷果肉颜色的分子标记引物对、试剂盒和检测方法及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0043]
实施例1
[0044]
1、果肉颜色鉴定
[0045]
于2020年5月枇杷果实完全成熟时观察85份供试枇杷材料的果肉颜色，每个材料至少选取10个以上完全成熟的果实观察并拍照记录。所有枇杷供试材料种植于四川省农业科学院现代农业科技创新示范园(北纬30
°
46
′
47
″
，东经104
°
12
′
28
″
，海拔489m)，园区内枇杷种质资源树龄6-8年，株行距 3m
×
5m，疏散分层型，采取常规土肥水与树体管理措施。果实完熟期观察每个品种的果肉颜色并拍照记录。收集各个品种枇杷的幼嫩叶片用于dna提取以及后续的基因分型工作。
[0046]
观察结果显示，85份供试材料中42份材料的果实为黄肉，43份材料的果实为白肉(表2)，部分枇杷品种的果肉颜色如图1。
[0047]
表2枇杷材料信息(黄肉枇杷：y1-y42；白肉枇杷：w1-w43)
[0048]
[0049]
[0050][0051]
1.2、indel分子标记的开发
[0052]
基于已公布的psy2a基因的序列设计2对indel分子标记的引物(表1)。首先，选取20份枇杷材料(10份黄肉材料y1-y10和10份白肉材料w1-w10) 对两对indel引物的扩增效率以及条带清晰度进行检验，结果显示两对indel 引物均能扩增出目的条带，且两对引物对同一品种扩增出来的带型一致(图 2)。所有白肉枇杷材料扩增小片段纯合带型，表明基因型为纯合ejpsy2ad。黄肉枇杷材料中y1艳红、y3大五星、y12西蜀4号扩增出来大片段纯合带型，表明这三个样品的基因型为纯合ejpsy2a，无法扩增出ejpsy2ad的片段，未发生基因的大片段缺失，其余黄肉材料均为杂合带型，为ejpsy2a和 ejpsy2ad的杂合基因型。
[0053]
其中，改良ctab法用于枇杷基因组dna的提取：使用液氮和研钵将新鲜嫩叶磨成粉并转入2.0ml离心管中，加入600μl 65℃预热的ctab提取液，混匀后65℃水浴30min，中途混匀2次；加入350μl 25:24:1的酚: 氯仿:异戊醇抽提液，离心；上清液转入新的1.5ml离心管，加入等体积预冷的异丙醇，离心；倒掉上清，加入1ml 75％乙醇漂洗；自然风干沉淀，加入te溶液溶解dna。使用nano drop one微量紫外可见分光光度计检测 dna浓度和质量，备用。
[0054]
pcr反应体系：1.0μl dna模板，12.5μl 2
×
pcr mix(擎科)，1.0μl 10 μm正反向引物，加ddh2o至25μl。
[0055]
pcr扩增程序：94℃预变性4min，95℃变性1min，55℃退火45s，72℃延伸1min s，循环35次，最后72℃延伸10min。
[0056]
使用1％的琼脂糖凝胶电泳和8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳对pcr产物进行基因分型。
[0057]
1.3、indel分子标记的验证
[0058]
使用第二对indel引物psy2a-2对85份枇杷供试材料进行pcr扩增和基因分析。pcr扩增和基因分析方法同上。
[0059]
分型结果显示43份白肉枇杷材料均为小片段纯合带型，表明所有白肉枇杷的基因型为纯合ejpsy2ad(图3)。42份黄肉枇杷材料中，3个黄肉枇杷选育品种(y1艳红、y3大五星、y39洛阳青)、2个杂交后代(y19 cb5-2、 y20 cb10-14)、1个引进品种(y30田中)、1个地方品种(y36中国台湾恒春)以及2份野生枇杷种质资源(y37椭圆枇杷和y41大花枇杷)为大片段纯合带型，基因型为纯合ejpsy2a；其余33份黄肉枇杷材料和杂交后代均为大片段和小片段的杂合带型，同时具有ejpsy2ad和ejpsy2a等位基因(图 4)。验证结果显示小片段纯合带型材料的果实为白肉，而大片段纯合带型以及大片段与小片段杂合带型材料的果实为黄肉，表明该indel分子标记可以有效地把黄肉和白肉枇杷种质资源和杂交后代区分开来，可用于枇杷果肉颜色的分子标记辅助育种。
[0060]
1.4、ta克隆验证
[0061]
使用ta克隆的方法对目的片段进行测序。白肉枇杷材料w3 tbw、 w5新白8号和w131贵妃的单一扩增片段测序结果与ejpsy2a参考基因组 (ejpsy2a，kf922364)序列相比，在ejpsy2a基因的2296-2989bp处有 694bp的大片段缺失，为ejpsy2ad等位基因(图5)。
[0062]
黄肉枇杷品种y1艳红的单一扩增片段的测序结果与ejpsy2a参考基因组序列完全一致，为ejpsy2a等位基因。黄肉枇杷品种y3大五星的单一扩增片段的测序结果显示在2296-2989bp处未发生694bp的大片段缺失，但是在2942-2947bp处有6个碱基的缺失(图5)。黄肉枇杷材料y8 tby的目的片段有两条，其中小片段的测序结果与白肉材料w3 tbw、w5新白8号和w11贵妃完全一致，有694bp的大片段缺失，为ejpsy2ad等位基因；而大片段的测序结果与参考基因组序列基本一致，无694bp的大片段缺失，但是在2800bp处有一个t
→
c的snp(图5)。
[0063]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。