用于预测甲状腺乳头状癌淋巴结转移的特异性基因及制备方法与流程

1.本发明属于生物医学领域，具体涉及一种用于预测甲状腺乳头状癌淋巴结转移的特异性基因及制备方法。


背景技术：

2.分化型甲状腺乳头状癌是常见恶性肿瘤之一，每年新发病例在全球和中国的肿瘤数据库中排名约为第六。发病率高严重影响了广大患者的健康。因其起病隐匿，且容易发生淋巴结转移，主要治疗手段以手术为主。手术后结合病理情况以及是否存在甲状腺腺体外侵犯、淋巴结转移情况，结合ata指南评价肿瘤风险等级，决定是否需要碘131同位素治疗，以及抑制tsh的标志值。
3.如前所述，甲状腺乳头状癌的转移以淋巴结转移为主，许多病例在发病早期即可发生颈淋巴结转移，然而淋巴结转移又是影响甲状腺乳头状癌预后的独立危险因素。目前由于没有能够准确预测甲状腺癌淋巴结转移的方法。有临床研究发现对甲状腺乳头状癌患者进行预防性中央区淋巴结清扫可以找到30～70％的隐匿性(查体和影像学均未发现的)淋巴结转移(病理学诊断)。
4.目前国内外对于预防性中央区淋巴结清扫的意见并不统一，国外由于缺少甲状腺专科医生，有研究报道对甲状腺乳头状癌患者进行预防性中央区淋巴结清扫会显著增加手术后并发症，影响患者生活质量，加上手术费用高昂，保险不予支付，因此国外大多数中心并不主张进行预防性中央区淋巴结清扫。而在国内，由于手术费不高，患者对于淋巴结转移影响疾病预后，以及和肿瘤复发相关，如果肿瘤在中央区复发转移，此时进行中央区淋巴结清扫，则会由于是二次手术所导致的局部并发症风险(术后出血、喉上或喉返神经损伤、旁腺损伤所致的低钙血症等)增加，严重危害患者的生活质量，因此患者更愿意在首次甲状腺切除术的同时进行预防性中央区淋巴结清扫，以期达到早期清扫潜在转移灶的目的。
5.尽管在一些患者的临床特征找到一些可能与淋巴结转移相关的患者特征，包括肿瘤较大，侵犯包膜，brafv600e突变等可能与预后不良、肿瘤复发和同位素治疗疗效不佳有关，但仍无法精准判断除此以外的其他情况是否也存在淋巴结转移，而在上述此类患者当中也有可能不伴有淋巴结转移。由于目前缺乏精准预测淋巴结转移的模型和方法，因此在国内外对于甲状腺乳头状癌患者是否应该接受预防性中央区淋巴结清扫在指南上都是保持谨慎推荐。对于临床评估淋巴结无转移的情况下(cn0)，只在特定条件下可以建议进行中央区淋巴结清扫。主要原因还是在于临床特征并不能达到精准医学的要求，影像学对于《0.5cm的淋巴结转移难以判断是否为恶性，也没有能够预测淋巴结转移的biomarker，即使是与甲状腺癌预后(复发转移风险)密切相关的brafv600e突变也不能预测淋巴结转移(图1)，临床特征等证据级别较低。
6.本发明的目的在于提供一种用于预测甲状腺乳头状癌淋巴结转移的特异性基因及制备方法。
7.本发明是这样实现的，一种用于预测甲状腺乳头状癌淋巴结转移的特异性基因，其基因包括：iii型胶原蛋白基因α1(collagen type iii alpha 1chain,col3a1)、i型胶原蛋白基因α1(collagen type i alpha 1chain,col1a1)、神经纤维蛋白2(neuronilin-2,nrp2)、乳脂球表皮生长因子8(milkfatglobuleepithelialgrowthfactor 8,mfge8)、谷胱甘肽氧化还原酶4(glutathioneoxidoreductase 4,gpx4)、前蛋白转化酶枯草溶菌素2(proprotein convertase subtilisin/kexin type 2，pcsk2)、抑制素bb(inhibin bb,inhbb)、钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶ii抑制物1(calcium/calmodulin-dependent protein kinase ii inhibitor 1,camk2n1)、g蛋白信号转导调节因子5(regulator of g protein signaling 1,rgs5)、细胞外基质蛋白1(extracellular matrix protein 1,ecm1)、血小板衍生生长因子a(platelet derived growth factor subunita,pdgfa)。
8.一种用于预测甲状腺乳头状癌淋巴结转移的特异性基因之制备方法，其包括以下步骤：
9.(1)穿刺甲状腺体的病变组织，在提取rna前先置于rna保存液冻存于-20℃环境下保存；
10.(2)用细胞裂解液、氯仿、depc水等试剂提取rna后保存在-20℃环境下，或直接进行逆转录反应，将rna转成cdna，cdna可暂存在-20℃环境下；
11.(3)用定量pcr试剂盒以及iii型胶原蛋白基因α1(collagen type iii alpha 1chain,col3a1)、i型胶原蛋白基因α1(collagen type i alpha 1chain,col1a1)、神经纤维蛋白2(neuronilin-2,nrp2)、乳脂球表皮生长因子8(milkfatglobuleepithelialgrowthfactor 8,mfge8)、谷胱甘肽氧化还原酶4(glutathioneoxidoreductase 4,gpx4)、前蛋白转化酶枯草溶菌素2(proprotein convertase subtilisin/kexin type 2，pcsk2)、抑制素bb(inhibin bb,inhbb)、钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶ii抑制物1(calcium/calmodulin-dependent protein kinase ii inhibitor 1,camk2n1)、g蛋白信号转导调节因子5(regulator of g protein signaling 1,rgs5)、细胞外基质蛋白1(extracellular matrix protein 1,ecm1)、血小板衍生生长因子a(platelet derived growth factor subunita,pdgfa)的引物(引物设计的转录本信息来源于pubmed数据库，转录本信息见下表1)进行pcr反应，把上述目的基因片段扩增出来。
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表1
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本发明的优点：该基因的检测能有效地用于临床上判断患甲状腺乳头状癌的病人是否发生淋巴结转移，以利临床专科医生对病人作出合理化治疗；该制备方法结合肿瘤实质中各种不同成分细胞差异表达基因更精准的找到与甲状腺乳头状癌转移密切相关的基因，且这些基因在前期基础或转化研究都得到证实和肿瘤预后不良或转移相关。
附图说明
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图1为对甲状腺结节患者手术前进行brafv600e基因突变的病例进行分析的示意图。
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图2为通过单细胞测序方法找到内皮系统的特异性细胞群(内皮细胞在淋巴结转移更多的患者群体中数量呈递增)示意图。
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图3为对于不同转移状态的甲状腺癌细胞差异表达的基因进行比较的示意图。
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图4为提示内皮细胞标志物前50基因与甲状腺癌高风险有关(ssgsea分析)，*：p值《0.05的示意图。
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图5为对中/高度淋巴结转移和无/微淋巴结转移的甲状腺乳头状癌差异基因表达差异的热图。
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图6为通过临床病理标本的免疫组化可见血管内皮标志物在甲状腺乳头状癌合并淋巴结转移的病例中表达更高的示意图。
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图7为通过单细胞测序方法的热图分析甲状腺乳头状癌组织内各细胞在不同淋巴结转移状态下的差异表达基因(p值《0.05)的示意图。
具体实施方式
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下面通过附图及实施例对本发明作详细描述。
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参阅图1所示，图1是对甲状腺结节患者手术前进行brafv600e基因突变的病例进行分析，有阳性突变的病理是有淋巴结转移的病理不到50％，还有部分是良性结节或没有淋巴结转移，因此没办法用brafv600e作为准确预测甲状腺癌淋巴结转移，那么对于已经诊断淋巴结转移的41基因检测评估高复发风险的时候，我们看到也只有3/4的患者有brafv600e基因突变，阳性预测价值不高。
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首先，利用单细胞测序的方法把不同淋巴结转移状态的甲状腺乳头状癌进行检测和大数据分析。单细胞测序是目前一种最先进研究肿瘤及各大肿瘤的前沿方法，在对甲状腺癌单细胞测序的研究中分析到，甲状腺癌的淋巴结转移，主要是中高转移组的内皮系统中未成熟内皮细胞和激活态内皮细胞计数明显增加(参阅图2所示)，对应淋巴结转移更多的病例中内皮标志基因在转移淋巴结中表达更高。
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我们对不同转移状态的甲状腺癌细胞表达差异的基因进行了分析，发现ecm1、pcsk2、hla-drb5、gpx3、slc26a7、phex、hsd17b6、gnas、npnt、rps4y1、slc16a9、rpl29、rpl3等是淋巴结中/高度转移与无/微转移表达比较差异最明显(有统计学差异，p《0.05)的基因(见下面表2)，同时进行tcga的数据库验证和比较不同淋巴结转移情况的生信分析(参阅图3所示)，同时在激活态内皮中，我们结合单细胞数据和rna测序数据库找到gpx4(p＝0.0013)，pdgfa(p＝0.0067)，nrp2(p＝0.011)，camk2n1(p＝0.00069)，inhbb(p＝0.0008)，mfge8(p＝0.000089)基因高表达与淋巴结转移相关且有统计学意义。发现col3a1、col1a1、nrp2、mfge8、gpx4、pcsk2、inhbb、camk2n1、rgs5、ecm1、pdgfa这些差异基因主要涵盖以下通路和相关机制，包括和诱导内皮间质转化，tgf-β信号通路，血管生成，notch信号通路，tnfα相关nf-κb信号通路，以及铁死亡发生等有关(参阅图4所示)。结合这些基因的表达差异，进行了临床样本的免疫组化和测序数据验证，均得到一致的结果。(参阅图5所示，其中发现ecm1和pcsk2基因在中高转移组显著更高。)
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表2
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我们对甲状腺乳头状癌手术前的诊断可通过对甲状腺癌病灶进行细针穿刺，取得
局部细胞，并对细胞团进行基因检测分析。其制备方法和步骤如下：
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(1)细针穿刺甲状腺乳头状癌取得新鲜标本后，将细胞置于rna保存液，冻存在-20℃以下保存以备用；
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(2)提取细胞rna前，将含用细胞的rna保存液解冻后，离心收集细胞，在离心得到的细胞中加入1ml trizol细胞裂解液，常温下摇匀后静置3-5分钟；
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(3)消化好的细胞裂解液吸到1.5ml ep管(depc处理过)中，加新开的氯仿0.2ml，轻摇15秒；室温静置3分钟，然后4℃，12000rpm转速离心15分钟。离心后分3层，上层为无色或淡粉色含有rna，中层为白色蛋白质层，下层为红色含有脂质和培养基。我们所需的rna就在氯仿的作用在分在上层的水相中；
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(4)吸取上层水相到新的ep管中(depc处理过)，加入等体积的异丙醇。两者充分混匀，室温放置10分钟，然后4℃，12000rpm离心10分钟。离心结束后，弃去上清，管底的白色沉淀为rna；
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(5)加入75％乙醇1.0ml洗涤(用depc水新配制)沉淀物，在4℃，7500rpm转速下离心5min。离心后弃上清，保留底部沉淀，用depc水再次洗涤rna一次(离心条件同样是在4℃，7500rpm转速下离心5min)，弃上清，加入新的depc水重悬，取小样测od值和跑电泳，质检合格后-20℃保存rna；
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(6)制备cdna，将rna从冰箱取出后在冰上解冻后，取样加入high capacity cdna reverse transcription kit逆转录试剂盒(参考themo fisher scientific公司说明书)；
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(7)获取cdna后，质控样本通过后则可进行定量rt-pcr反应，参考荧光定量pcr试剂盒(sybr green qpcr mix)说明书，加入col3a1、col1a1、nrp2、mfge8、gpx4、pcsk2、inhbb、camk2n1、rgs5、ecm1、pdgfa引物后，在pcr反应仪器设定的程序下进行变形、退火、延伸等反应，上机分析溶解曲线，计算出各个基因表达量。
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(8)结合各基因表达的权重，计算穿刺标本的基因评分，结合基因表达差异对甲状腺乳头状癌患者是否合并发生淋巴结转移可能进行预测。
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结合单细胞数据中找到的差异基因及临床验证后的潜在marker，我们分别对这些基因表达在甲状腺癌的意义进行注释(见下面表3)
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表3
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参阅图6所示，通过临床病理标本的免疫组化可见血管内皮标志物在甲状腺乳头状癌合并淋巴结转移的病例中表达更高。
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参阅图7所示，通过单细胞测序方法的热图分析甲状腺乳头状癌组织内各细胞在不同淋巴结转移状态下的差异表达基因(p值《0.05)。