一种高效的人类血液免疫细胞CD4T分离培养技术的制作方法

一种高效的人类血液免疫细胞cd4t分离培养技术
技术领域
1.本发明涉及一种培养技术，特别涉及一种高效的人类血液免疫细胞cd4t分离培养技术，属于生物细胞体外免疫细胞分离培养技术领域。


背景技术：

2.免疫细胞(immune cell)俗称白细胞，包括淋巴细胞和各种吞噬细胞等，也特指能识别抗原、产生特异性免疫应答的淋巴细胞等。淋巴细胞是免疫系统的基本成分，在体内分布很广泛，主要是t淋巴细胞、b淋巴细胞受抗原刺激而被活化(activation)，分裂增殖、发生特异性免疫应答。除t淋巴细胞和b淋巴细胞外，还有k淋巴细胞和nk淋巴细胞，共四种类型。t淋巴细胞是一个多功能的细胞群。除淋巴细胞外，参与免疫应答的细胞还有浆细胞、粒细胞、肥大细胞、抗原呈递细胞及单核吞噬细胞系统的细胞，这些免疫细胞主要在我们的血液当中，当我们身体那个器官出现问题时血液就会把这些免疫细胞送到出现问题的部位进行战斗，进而清除进入身体的细菌和病毒，保护了我们身体里的细胞和器官。当我们身体里免疫细胞群数量缺少时就不能及时的清除外来入侵的细菌和病毒和自身变异的细胞，这时我们的身体就会出现个总疾病，比如乙肝(hbv)患者，癌症，这些疾病都是和免疫细胞有直接的关系。
3.高效的从外周中分离出免疫细胞群，在体外培养扩增，扩增到一定数量后进行临床应用或冻存，这个过程中就有一个人技术难点，这个技术难点主要是先获取外周血里足够的免疫细胞种子，在进行体外培养扩增。现在操作是抽取患者50ml外周血，用t淋巴细胞分离液进行分离血液中的t淋巴细胞，获得后在进行体外后续的培养扩增。培养的周期长短用的培养试剂的多少，都与种子细胞获得的多少有直接的关系。本发明大大提高了外周血中收获更多的免疫细胞群的元代种子细胞数量，以及改变培养方法，缩短培养周期，大大提高体外免疫细胞的活性，数量的关键问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种高效的人类血液免疫细胞cd4t分离培养技术，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种高效的人类血液免疫细胞cd4t分离培养技术，所述cd4t分离培养包括人类血液中的单个核细胞免疫细胞的分离方法和人类血液中的单个核细胞的体外培养扩增方法两部分，具体内容如下：
6.第一：制作分离血液的器械，分离血液的器械有三部分组成，一是离心管，二是抗凝血剂，三是分离胶，免疫细胞分离胶是一种疏水性的有机化合物，其作用原理是：一般血清比重约1.02，红细胞比重为：1.093，多形核白细胞比重：1.092，血小板比重约为：1.032，单个核细胞比重为：1.076-1.090，分离胶比重维持在1.77，在离心力的作用下，免疫细胞分离胶在血清、白细胞和红细胞间形成隔离层，把5ml分离胶置于50ml离心管底部，依次加入聚烯烃、聚酯和丙烯加入到离心管，进行离心3500r/min，离心15分钟，制备成带有免疫细胞
分离胶的离心管备用；
7.第二：用50ml注射器抽取2.0ml肝素抗凝剂，注射器推拉几次让肝素湿润注射器管壁，换新的注射器针头，抽取外周静脉自体血40ml，将40ml抗凝全血置于50ml分离胶的离心管中，配平上离心机，3500r/min，离心15分钟，得到分离胶即在血清、白细胞和红细胞之间形成隔离层，并使血清保持原状，无改变，隔离层紧密地粘附在试管璧上，避免了纤维蛋白和溶血的影响，分离胶上面粘附一个白膜层，此白膜层就是目标细胞层；
8.第三：取出离心管，弃上清至中间层，预留15ml血浆，用吸管轻轻反复吹打血浆到免疫细胞分离胶表面，把分离胶上的白色膜完全吹散在血浆中，把吹打好的血浆置入到新的离心管中，进行清洗，1-2次，把分离好的细胞移入50ml离心管中加入盐水30ml，用吸管进行吹打，吹打后，上离心机配平，放入离心机中离心2200r/min转20min；
9.第四：免疫细胞培养液的配比，a瓶的免疫细胞培养基1000ml中加入8％胎牛血清，加入白介素2两瓶200万u，加入胸腺五肽10mg，加入干扰素a2b1m500万u，培养12天加入b瓶免疫细胞培养液：免疫细胞培养基1000ml中加入8％胎牛血清，加入白介素2两瓶200万u，加入胸腺五肽10mg，加入干扰素a2b 1m500万u，加入卡介苗0.25g；
10.第五：取出离心管，去上清后，留下沉淀，在往沉淀组织里加入a瓶免疫细胞培养液20ml，用巴士滴管反复吹打完全吹散沉淀物，吹散后，移植到t82细胞培养瓶中，在把t82细胞培养瓶放入5％co2的培养箱中进行培养，第三天往t82瓶中加入50mla瓶免疫细胞培养基，第六天把t82细胞瓶中的细胞到入细胞袋中培养，同时加入100mla瓶细胞培养液，第九天在往免疫细胞袋中加入150mla瓶免疫细胞培养液，第十二天在往免疫细胞袋中加入b瓶免疫细胞培养液。三天后补充细胞培养液，在免疫细胞培养15天后免疫细胞数量能达到1.6*1010细胞；
11.第六：把细胞袋里培养完成后置入500ml锥形离心瓶中，配平离心2600r/min转15min，离心完成后，弃上清，弃上清后在往离心瓶中加入40ml0.9％氯化钠用巴士滴管进行吹打，把瓶底细胞沉淀完全吹散在氯化钠溶液中，配平放入离心机2600r/min转15min，离心后两个500ml离心瓶去上清，每瓶离心瓶中加入20ml0.9％氯化钠溶液悬浮细胞，备用。
12.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
13.1.本发明一种高效的人类血液免疫细胞cd4t分离培养技术，本发明具有提高工作效率，节约工作时间，免疫细胞群收获率高，使用方便，耗材便宜，自血样注入采血管、血清分离、血样保存，废弃物处理的全过程都在同一支管中进行，避免血样沾污操作者，防止血液中病毒的感染，减少了医疗废物，提高了工作效率。
附图说明
14.图1为本发明五分类血细胞检测仪检测表格示；
15.图2为本发明分离胶提取单个核细胞与t淋巴细胞分离液提取做对比表格；
16.图3为本发明流式细胞仪检测细胞扩增前后cd4、cd56+cik、nk、nkt、细胞比例示意图。
具体实施方式
17.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完
整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
18.请参阅图1-3，本发明提供了一种高效的人类血液免疫细胞cd4t分离培养技术的技术方案：
19.一种高效的人类血液免疫细胞cd4t分离培养技术，其特征在于，所述cd4t分离培养包括人类血液中的单个核细胞免疫细胞的分离方法和人类血液中的单个核细胞的体外培养扩增方法两部分，具体内容如下：
20.第一：制作分离血液的器械，分离血液的器械有三部分组成，一是离心管，二是抗凝血剂，三是分离胶，免疫细胞分离胶是一种疏水性的有机化合物，其作用原理是：一般血清比重约1.02，红细胞比重为：1.093，多形核白细胞比重：1.092，血小板比重约为：1.032，单个核细胞比重为：1.076-1.090，分离胶比重维持在1.77，在离心力的作用下，免疫细胞分离胶在血清、白细胞和红细胞间形成隔离层，把5ml分离胶置于50ml离心管底部，依次加入聚烯烃、聚酯和丙烯加入到离心管，进行离心3500r/min，离心15分钟，制备成带有免疫细胞分离胶的离心管备用；
21.第二：用50ml注射器抽取2.0ml肝素抗凝剂，注射器推拉几次让肝素湿润注射器管壁，换新的注射器针头，抽取外周静脉自体血40ml，将40ml抗凝全血置于50ml分离胶的离心管中，配平上离心机，3500r/min，离心15分钟，得到分离胶即在血清、白细胞和红细胞之间形成隔离层，并使血清保持原状，无改变，隔离层紧密地粘附在试管璧上，避免了纤维蛋白和溶血的影响，分离胶上面粘附一个白膜层，此白膜层就是目标细胞层；
22.第三：取出离心管，弃上清至中间层，预留15ml血浆，用吸管轻轻反复吹打血浆到免疫细胞分离胶表面，把分离胶上的白色膜完全吹散在血浆中，把吹打好的血浆置入到新的离心管中，进行清洗，1-2次，把分离好的细胞移入50ml离心管中加入盐水30ml，用吸管进行吹打，吹打后，上离心机配平，放入离心机中离心2200r/min转20min；
23.第四：免疫细胞培养液的配比，a瓶的免疫细胞培养基1000ml中加入8％胎牛血清，加入白介素2两瓶200万u，加入胸腺五肽10mg，加入干扰素a2b1m500万u，培养12天加入b瓶免疫细胞培养液：免疫细胞培养基1000ml中加入8％胎牛血清，加入白介素2两瓶200万u，加入胸腺五肽10mg，加入干扰素a2b 1m500万u，加入卡介苗0.25g；
24.第五：取出离心管，去上清后，留下沉淀，在往沉淀组织里加入a瓶免疫细胞培养液20ml，用巴士滴管反复吹打完全吹散沉淀物，吹散后，移植到t82细胞培养瓶中，在把t82细胞培养瓶放入5％co2的培养箱中进行培养，第三天往t82瓶中加入50mla瓶免疫细胞培养基，第六天把t82细胞瓶中的细胞到入细胞袋中培养，同时加入100mla瓶细胞培养液，第九天在往免疫细胞袋中加入150mla瓶免疫细胞培养液，第十二天在往免疫细胞袋中加入b瓶免疫细胞培养液。三天后补充细胞培养液，在免疫细胞培养15天后免疫细胞数量能达到1.6*1010细胞；
25.第六：把细胞袋里培养完成后置入500ml锥形离心瓶中，配平离心2600r/min转15min，离心完成后，弃上清，弃上清后在往离心瓶中加入40ml0.9％氯化钠用巴士滴管进行吹打，把瓶底细胞沉淀完全吹散在氯化钠溶液中，配平放入离心机2600r/min转15min，离心后两个500ml离心瓶去上清，每瓶离心瓶中加入20ml0.9％氯化钠溶液悬浮细胞，备用。
26.总结实验：通过两次自体9ml全血，用t淋巴细胞提取液分离提取免疫细胞群的方法，结果不是很理想，两次用五分类血细胞检测仪都未检出细胞计数，说明细胞数量太少，系统不能计数。通过另一种测试血细胞检测仪，检测到微量的单个核免疫细胞群总数。说名用t淋巴细胞分离液分离单个核细胞的方法是有效的，不能统一分离提取质量标准，操作步骤繁琐，操作分离一份血液时间一般在2个半小时左右，对靶向目标提取的质量受操作人员技术和提取的血量影响比较大，而且目标细胞获得率不高。五分类另一种方法检测两次3倍浓缩单个细胞，检测出微量，分别是：(mn1.243、提取全血单个核细胞的19％)(mn3.378.提取全血的单个核细胞的39％)
27.这里的mn是单个核细胞的总数，结果应该丢失了2倍左右的单个核免疫细胞量，用现有的分离技术方法收获的免疫细胞群(两次平均)只能占全血免疫细胞的30％，丢失了70％的免疫细胞群，应用本发明实验结果证明分离胶分离提取单个核免疫细胞数量能达到全血的93％，而且优化提取工艺，简化生产步骤，提高靶向目标获得率，可大大节约人力和耗材成本，缩短的免疫细胞培养周期。
28.实施例
29.实验材料：
30.器材：15ml锥形离心管、分离胶管、吸管、无菌干燥注射器、无菌棉球、橡皮止血带、水平式离心机、生物显微镜、五分类血细胞分析仪等。
31.免疫细胞分离胶：免疫细胞分离胶是一种粘性流体，其结构中含有大量氢键，由于氢键的缔合作用形成网状结构。在离心力的作用下，网状结构被破坏，变成粘度低的流体。当离心力消失之后又重新形成网状结构，恢复成粘度高的流体，这种性质被称为触变性，利用这一特性可制成一种免疫细胞分离胶。当免疫细胞分离胶与抗凝的血液在同一试管中离心时，免疫细胞分离胶便在血清和红细胞之间形成胶状的隔离层将血清，白细胞，红细胞。从而提高了免疫细胞的收得率，提高了工作效率。
32.免疫细胞分离胶是一种疏水性的有机化合物，其作用原理是：一般血清比重约1.02、血块比重约1.08、分离胶比重维持在1.05。在离心力的作用下，免疫细胞分离胶在血清和白细胞，红细胞间形成隔离层。免疫细胞分离胶，聚烯烃、聚酯和丙烯，分离胶置于试管底部，注入血样后置离心机中离心，分离胶即在血清、血块之间形成隔离层。并使血清保持原状，无改变。此隔离层紧密地粘附在试管璧上，也避免了纤维蛋白和溶血的影响。
33.试剂：
34.肝素溶液，用生理盐水配制成500u/ml
35.盐水
36.2g/l台盼蓝染液。
37.标本肝素抗凝的人外周静脉血。
38.实验方法：
39.用10ml注射器抽取0.5ml肝素抗凝剂，注射器推拉几次让肝素湿润注射器管壁，换新的注射器针头，抽取外周静脉自体血11ml。
40.将11ml抗凝全血注射到2ml负压采血管中备检，在将剩下的9ml抗凝全血置于15ml分离胶的离心管中。
41.配平上离心机，3500r/min，离心15分钟。
42.取出离心管，弃上清至中间层，预留3ml血浆，用吸管轻轻反复吹打血浆到分离胶表面，把白色膜完全吹散在血浆中，把吹打好的血浆置入到新的离心管中，准备检测。
43.也可以进行清洗，1-2次，把分离好的细胞移入50ml离心管中加入盐水30ml，用吸管进行吹打，吹打后，上离心机配平，放入离心机中离心2200r/min转20min。
44.取出离心管，去上清后，继续后续操作。
45.实验结果：
46.通过用分离胶进行单个核细胞分离提取，制备出三倍浓缩液，用五分类电阻法检测与原血进行对比，如图1所示。
47.分离获得的单个核细胞进行质量检验：分离胶分离处理的单个核细胞进行细菌培养，活性检测，内毒素残留，溶出物等检测，如图2所示。
48.用45ml检验合格全血的单个核细胞进行体外培养扩增：取出离心管，弃上清至中间层，预留15ml血浆，用吸管轻轻反复吹打血浆到免疫细胞分离胶表面，把分离胶上的白色膜完全吹散在血浆中，把吹打好的血浆置入到新的离心管中，进行清洗，1-2次，把分离好的细胞移入50ml离心管中加入盐水30ml，用吸管进行吹打，吹打后，上离心机配平，放入离心机中离心2200r/min转20min。
49.免疫细胞培养液的配比，a瓶康宁牌的免疫细胞培养基1000ml中加入8％胎牛血清，加入白介素2两瓶200万u，加入胸腺五肽10mg，加入干扰素a2b1m500万u，培养12天加入b瓶免疫细胞培养液：康宁牌的免疫细胞培养基1000ml中加入8％胎牛血清，加入白介素2两瓶200万u，加入胸腺五肽10mg，加入干扰素a2b 1m500万u，加入卡介苗0.25g。来刺激诱导单个核细胞。
50.取出离心管，去上清后，留下沉淀，在往沉淀组织里加入a瓶免疫细胞培养液20ml，用巴士滴管反复吹打完全吹散沉淀物，吹散后，移植到t82细胞培养瓶中，在把t82细胞培养瓶放入5％co2的培养箱中进行培养，第三天往t82瓶中加入50mla瓶免疫细胞培养基，第六天把t82细胞瓶中的细胞到入细胞袋中培养，同时加入100mla瓶细胞培养液，第九天在往免疫细胞袋中加入150mla瓶免疫细胞培养液，第十二天在往免疫细胞袋中加入b瓶免疫细胞培养液。
51.每天观察细胞生长状态，每4天进行一次细胞计数。根据细胞生长状态补加白介素2(50万u)三天后补充细胞培养液。在免疫细胞培养14天后免疫细胞数量能达到3.5
×
109细胞。第21天8.5
×
109结束培养。
52.扩增前后细胞数量、扩增倍数、活率表
[0053][0054]
把细胞袋里培养完成后置入500ml锥形离心瓶中，配平离心2600r/min转15min。离
心完成后，弃上清，弃上清后在往离心瓶中加入40ml 0.9％氯化钠用巴士滴管进行吹打，把瓶底细胞沉淀完全吹散在氯化钠溶液中，配平放入离心机2600r/min转15min，离心后两个500ml离心瓶去上清，每瓶离心瓶中加入20ml 0.9％氯化钠溶液悬浮细胞，备用。
[0055]
流式细胞检测方法：取实施例1中当天分离出的外周血单个核细胞中培养21天后所获得的细胞样本6x106细胞/管，pbs洗涤1次。分别加入流式检测抗体进行双标记流式表型检测：fitc标记的鼠抗人cd4抗体和apc标记的鼠抗人cd56抗体；常温下等待20分钟,pbs洗涤1次，细胞通过流式细胞仪进行分析。
[0056]
结果如图3所示，经过21天的诱导培养cd4+cd56+与cik/nk/nkt群免疫细胞从第0天的约11.7％(图3cd4 a),培养21天后流式检测cd4+cd56+与cik/nk/nkt群免疫细胞升至87％(图3cd4 b)。
[0057]
实施例:细胞杀伤活性检测
[0058]
取对数生长期的k562人慢性髓原白血病细胞作为靶细胞，并配比细胞密度为7x105个/ml,取48孔培养板中每孔铺0.1ml。取本发明实施例6中获得的第14天和第21天的cd4免疫细胞群调整密度为2x106个/ml、8x106个/ml、1.6x107个/ml、3.2x107个/ml,加入48孔培养板中，每孔0.1ml,使效靶比分别为1:1、5:1、10:1、20:1,每组设三个复孔，接种方式如下：
[0059]
空白组(a)：aim-v-dmem(0.2ml)
[0060]
(b)：cd4免疫细胞群(0.1ml)+aim-v-dmem(0.1ml)
[0061]
对照组(c)：k562(0.1ml)+aim-v-deem(0.1ml)
[0062]
实验组(d)：k562(0.1ml)+cd4免疫细胞群(0.1ml)
[0063]
将接种好的细胞，置于37℃,5％co2条件下共培养48小时后，每孔加20微升cck-8试剂，摇匀，37℃,5％co2条件下继续培养5小时，酶标仪波长450nm测定吸光度。
[0064]
按下式计算杀伤活性：杀瘤效率＝[1-(d值－b值－a值)/(c值－a值)]x100％.结果显示本发明制备的cd4免疫细胞群对肿瘤k562细胞株具有很高的杀伤活性，在10:1、20:1的效靶比下第14天杀伤率即可达到100％；在5:1的效靶比下第14天杀伤率可达到90％以上，第21天杀伤率可达到100％；在1:1的效靶比下第14天和21天的杀伤率均低于40％,但第21天的杀伤率显著高于第14天。
[0065]
cd4免疫细胞群对肿瘤k562细胞的杀伤活性表：
[0066]
效靶比1：15：110：120：1第14天26％90％100％100％第21天40％100％100％100％
[0067]
在本发明的描述中，需要理解的是，指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
[0068]
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
[0069]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。