一种引物探针组合物、包含其的试剂盒及其检测方法与流程

1.本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的引物探针组合物、包含其的试剂盒及其检测方法。


背景技术：

2.呼吸道感染（respiratory tract infection，rti）是人类最常见的一类疾病，是全球范围内引起人群发病和死亡的最主要原因之一。呼吸道感染引起的临床表现主要为鼻炎、咽炎、喉炎、扁桃体炎等症状，严重的可引起气管炎、支气管炎及肺炎等，但不同病原体引起的感染，其治疗方法、疗效和病程也不尽相同。目前已证明，大部分呼吸道感染是由呼吸道病毒引起的，常见的呼吸道病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒等。
3.现有技术中，目前呼吸道病原体检测的主要方法包括病原体分离培养法、免疫法和分子诊断等方法。病毒分离培养是目前病毒病原学检测的金标准，但是对标本中病毒采集、运输及保存条件要求均较高，且操作复杂、耗时长、不稳定、敏感性不高，不适合临床检测应用；免疫法的特异性高，但灵敏度较低，且往往不可用于疾病的早期诊断；而实时荧光定量pcr技术是目前应用最广泛的分子诊断方法，该技术不仅实现了对核酸模板的定量检测，而且具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高的优点，但是现有的试剂盒检测效率低，因引物特异性的原因，难以在一个反应体系中，同时检测多种病毒；另外检测准确度低，会发生交叉反应性，容易出现假阳性或者假阴性的结果；并且检测灵敏度低，难以实现病毒的滴度微量的病毒的检测。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术中的上述不足，本发明的目的之一在于提供一种引物探针组合物，可以实现引物对和探针的特异性高效率的扩增。
5.本发明的目的之二在于提供一种检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂盒，可以实现一管多检，彻底解决了现有技术中试剂盒检测效率低、特异性差以及灵敏度低的问题。
6.本发明的目的之三在于提供非诊断目的检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的方法，可以实现操作便捷地对甲型流感病毒、乙型流感病毒或呼吸道合胞病毒进行检测，并且结果准确度高。
7.为了实现上述目的之一，本发明采用以下技术方案：本发明提供一种引物探针组合物，包括以下组分：甲型流感病毒的上游引物，其核酸序列如seq id no:1所示；甲型流感病毒的下游引物，其核酸序列如seq id no:2所示；甲型流感病毒的探针，其核酸序列如seq id no:3所示；乙型流感病毒的上游引物，其核酸序列如seq id no:4所示；
乙型流感病毒的下游引物，其核酸序列如seq id no:5所示；乙型流感病毒的探针，其核酸序列如seq id no:6所示；呼吸道合胞病毒的上游引物，其核酸序列如seq id no:7所示；呼吸道合胞病毒的下游引物，其核酸序列如seq id no:8所示；呼吸道合胞病毒的探针，其核酸序列如seq id no:9所示。
8.其中，所述seq id no:3所示探针的5’端标记vic荧光基团，3’端标记bhq1猝灭基团；所述seq id no:6所示探针的5’端标记rox荧光基团，3’端标记bhq2猝灭基团；所述seq id no:9所示探针的5’端标记fam荧光基团，3’端标记bhq1猝灭基团。
9.为了实现上述目的之二，本发明采用以下技术方案：本发明提供一种检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒，所述试剂盒包括含有权利要求1或2所述引物探针组合的pcr反应液。
10.其中，所述pcr反应液还包括pcr缓冲液、dntps、dna聚合酶和反转录酶。
11.其中，所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品为灭活的甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒基因片段的混合物，所述阴性质控品为灭活的内标基因片段，所述灭活的内标基因片段为人核糖核酸酶p的基因片段。
12.其中，所述反应液还包括所述人核糖核酸酶p的基因片段的上游引物、下游引物和探针，所述上游引物的核酸序列如seq id no:10所示，所述下游引物的核酸序列如seq id no:11所示，所述探针的核酸序列如seq id no:12所示。
13.其中，所述seq id no:12所示探针的5’端标记cy5荧光基团，3’端标记bhq2猝灭基团。
14.为了实现上述目的之三，本发明采用以下技术方案：本发明提供一种非诊断目的检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的方法，其以本发明所述的试剂盒对样本核酸进行检测，根据荧光信号判断样品是否存在甲型流感病毒、乙型流感病毒或呼吸道合胞病毒。
15.进一步地，将所述pcr反应液、dna聚合酶、反转录酶和样本核酸按以下反应体系的配比配制成核酸扩增反应混合液进行pcr反应，所述反应体系的配比如下：
进一步地，所述扩增的程序包括：与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：（1）本发明的一种引物探针组合物，该组合物中的上下游引物和探针有良好的特异性，避免脱靶效应，保证检测结果更准确。
16.（2）本发明的一种检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒，使用该试剂盒检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒，检测特异性高，不发生
交叉反应，并且检测准确度和灵敏度高，可以实现一管多检，检测效率高，与现有的市售试剂盒相比，该试剂盒更优越。
17.（3）本发明的一种非诊断目的检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的方法，采用q-pcr的方法对甲型流感病毒、乙型流感病毒或呼吸道合胞病毒进行检测，操作便捷，结果准确。
附图说明
18.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
19.图1是本技术实施例提供的试剂盒对甲型流感病毒进行检测的扩增曲线图。
20.图2是本技术实施例提供的试剂盒对乙型流感病毒进行检测的扩增曲线图。
21.图3是本技术实施例提供的试剂盒对呼吸道合胞病毒进行检测的扩增曲线图。
22.图4是本技术实施例提供的试剂盒进行交叉反应检测的扩增曲线图。
23.图5是本技术实施例提供的试剂盒进行甲型流感病毒灵敏度检测的扩增曲线图。
24.图6是本技术实施例提供的试剂盒进行乙型流感病毒灵敏度检测的扩增曲线图。
25.图7是本技术实施例提供的试剂盒进行呼吸道合胞病毒灵敏度检测的扩增曲线图。
具体实施方式
26.为了使本技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下将结合实施例对本技术的技术方案进行清楚、完整的描述。应当理解此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。
27.所用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
28.实施例1检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的引物探针组合物、包含其的试剂盒的制备如下：试剂盒中的引物和探针序列如下表1所示：表1 引物、探针序列组
本实施例中，seq id no:3所示探针的5’端标记vic荧光基团，3’端标记bhq1猝灭基团，保证在反应过程中可对甲型流感病毒进行区分，提高检测效率。
29.本实施例中，seq id no:6所示探针的5’端标记rox荧光基团，3’端标记bhq2猝灭基团，保证在反应过程中可对乙型流感病毒进行区分，提高检测效率。
30.本实施例中，seq id no:9所示探针的5’端标记fam荧光基团，3’端标记bhq1猝灭基团，保证在反应过程中可对呼吸道合胞病毒进行区分，提高检测效率。
31.本实施例中，检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒中包括阴性质控品，阴性质控品为灭活的内标基因片段。
32.本实施例中，灭活的内标基因片段为人核糖核酸酶p的基因片段，如seq id no:12所示探针的5’端标记cy5荧光基团，3’端标记bhq2猝灭基团，一方面保证在反应过程中可对人核糖核酸酶p的基因片段进行区分，提高检测效率，另外一方面可用于监控整个扩增体系是否正常扩增，同时还可以用于监测样本的采集和核酸提取等方面。
33.本实施例中，检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒中还包括阳性质控品，保证整个扩增体系不存在试剂和操作的问题，避免假阴性结果的出现。
34.实施例2非诊断目的检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的方法
本发明采用的检测方法是q-pcr，将所述pcr反应液、dna聚合酶、反转录酶和样本核酸按以下反应体系的配比配制成核酸扩增反应混合液进行pcr反应，所述反应体系的配比如表2所示：表2核酸扩增反应混合液的配置核酸扩增反应混合液配置完成后，pcr反应按如表3所示的程序进行：表3 荧光定量pcr反应条件
荧光检测通道的选择：选择vic通道检测甲型流感病毒核酸；选择rox通道检测乙型流感病毒核酸；选择fam通道检测呼吸道合胞病毒核酸；选择cy5通道，检测内标核酸；参比荧光（passive reference）设置为none。
35.性能实验以下为检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒的性能实验。
36.1、试剂盒检测准确性实验（1）甲流、乙流及呼吸道合胞病毒核酸扩增反应混合液配制采用实施例2的检测方法制备甲流、乙流及呼吸道合胞病毒核酸联合检测pcr反应液。
37.（2）样本核酸提取使用广州科方生物技术股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（备案号：粤穗械备20210387号）对不同型别的甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒样本进行核酸的提取，同步提取阴性质控及阳性质控的核酸。
38.（3）样本核酸检测将10
µ
l上步提取得到的样本核酸加入到甲流、乙流及呼吸道合胞病毒核酸联合检测pcr反应液中，按照实施例2中检测方法进行检测。
39.（4）结果分析通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对不同型别的甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的样本进行检测，甲型流感病毒检测结果如附图1所示，从图中可以看出，1号曲线为甲型h1n1核酸检测扩增曲线，2号曲线为甲型h3n2核酸检测扩增曲线，3号曲线为甲型h5n1核酸检测扩增曲线，乙型流感病毒检测结果如附图2所示，从图中可以看出，1号曲线为b/victoria型核酸检测扩增曲线，2号曲线为b/yamagata型核酸检测扩增曲线，呼吸道合胞病毒检测结果如附图3所示，从图中可以看出，1号曲线为呼吸道合胞病毒a型核酸检测扩增曲线，2号曲线为呼吸道合胞病毒b型核酸检测扩增曲线。结果表明本发明试剂盒可特异性检测出甲型h1n1型病毒、甲型h3n2型病毒、甲型h5n1型病毒；乙型流感病毒victoria型病毒、yamagata型病毒；呼吸道合胞病毒a型病毒、b型病毒，具体数据如表4所示。
40.表4 试剂盒检测准确性的检测“noct”表示无扩增。
41.2、试剂盒检测的交叉反应性评价（1）甲流、乙流及呼吸道合胞病毒核酸扩增反应混合液配制采用实施例2的检测方法制备甲流、乙流及呼吸道合胞病毒核酸联合检测pcr反应液。
42.（2）核酸提取使用广州科方生物技术股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（备案号：粤穗械备20210387号）对金黄色葡萄球菌（1
×
106cfu/ml）、大肠埃希氏菌（1
×
10
6 cfu/ml）、铜绿假单胞菌（1
×
106cfu/ml）、肠道病毒71型（1
×
10
5 tcid50/ml）、柯萨奇病毒a16型（1
×
10
5 tcid50/ml）、副流感病毒1型（1
×
10
5 tcid50/ml）、副流感病毒2型（1
×
10
5 tcid50/ml）、副流感病毒3型（1
×
10
5 tcid50/ml）、流感病毒4型（1
×
10
5 tcid50/ml）、干酪乳杆菌（1
×
10
6 cfu/ml）样本进行核酸的提取，同步提取阴性质控及阳性质控的核酸。
43.（3）核酸检测将10
µ
l上步提取得到的样本核酸加入到甲流、乙流及呼吸道合胞病毒核酸联合检测pcr反应液中，按照实施例2中检测方法进行检测。
44.（4）结果分析通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、肠道病毒71型、柯萨奇病毒a16型、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、流感病毒4型、干酪乳杆菌等病原体进行检测，检测结果如附图4所示，从图中可以看出，1号曲线为甲型流感病毒，2号曲线为乙型流感病毒，3号曲线为呼吸道合胞病毒，4号曲线为金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、肠道病毒71型、柯萨奇病毒a16型、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、流感病毒4型、干酪乳杆菌），结果表明本试剂盒与以上病原体均无交叉反应，说明本发明试剂盒特异性较高，具体数据如表5示。
45.表 5试剂盒检测的交叉反应性评价3、试剂盒检测的灵敏度评价（1）甲流、乙流及呼吸道合胞病毒核酸扩增反应混合液配制采用实施例2的检测方法制备甲流、乙流及呼吸道合胞病毒核酸联合检测pcr反应液。
46.（2）核酸提取使用广州科方生物技术股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（备案号：粤穗械备20210387号）对甲型流感病毒（甲型h1n1）5.0
×
102～1.0
×
105copies/ml样本、乙型流感病毒（b/victoria）2.0
×
102～1.0
×
105copies/ml样本、呼吸道合胞病毒a型1.0
×
103～1.0
×
105copies/ml样本进行核酸的提取。
47.（3）核酸检测将10
µ
l上步提取得到的样本核酸加入到甲流、乙流及呼吸道合胞病毒核酸联合检测pcr反应液中，按照实施例2中检测方法进行检测。
48.（4）结果分析通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对甲型流感病毒（甲型h1n1）5.0
×
102～1.0
×
105copies/ml样本、乙型流感病毒（b/victoria）2.0
×
102～1.0
×
105copies/ml样本、呼吸道合胞病毒a型1.0
×
103～1.0
×
105copies/ml样本进行检测，甲型流感病毒检测结果如附图5所示，从图中可以看出1号曲线、2号曲线、3号曲线、4号曲线分别为甲型h1n1的500copies/ml、1.0
×
103copies/ml、1.0
×
104copies/ml、1.0
×
105copies/ml样本，乙型流感病毒检测结果如附图6所示，从图中可以看出，1号曲线、2号曲线、3号曲线、4号曲线分别为b/victoria型的200copies/ml、1.0
×
103copies/ml、1.0
×
104copies/ml、1.0
×
105copies/ml样本，呼吸道合胞病毒检测结果如附图7所示，从图中可以看出，1号曲线、2号曲线、3号曲线分别为呼吸道合胞病毒a型的1.0
×
103copies/ml、1.0
×
104copies/ml、1.0
×
105copies/ml样本，结果表明本试剂盒可检出500copies/ml浓度以上的甲型h1n1样本、200copies/ml浓度以上b/victoria型样本、1.0
×
103copies/ml浓度以上的呼吸道合胞病毒a型样本，说明本发明试剂盒灵敏度较高，具体数据见表6所示。
49.表6试剂盒检测的灵敏度评价
注：“noct”表示无扩增。
50.4、本发明试剂盒与a厂家甲型流感病毒核酸检测试剂盒（pcr-荧光探针法）检测甲型流感病毒样本检测效果比较（1）甲流、乙流及呼吸道合胞病毒核酸扩增反应混合液配制采用实施例2的检测方法制备甲流、乙流及呼吸道合胞病毒核酸联合检测pcr反应液。
51.（2）核酸提取使用广州科方生物技术股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（备案号：粤穗械备20210387号）对甲型流感病毒（甲型h1n1）1.0
×
104～1.0
×
106copies/ml样本进行核酸的提取。
52.（3）核酸检测将10
µ
l上步提取得到的样本核酸加入到甲流、乙流及呼吸道合胞病毒核酸联合检测pcr反应液中，按照实施例2中检测方法进行检测，同时采用a厂家生产的甲型流感病毒核酸检测试剂盒（pcr-荧光探针法）进行以上样本的检测。
53.（4）结果分析具体检测结果如下表4所示，结果表明本发明试剂盒对甲型流感病毒核酸检测结果的ct值小于a厂家试剂盒检测结果的ct值，说明本发明的试剂盒灵敏度高于a厂家的试剂盒。
54.表7本发明的试剂盒与a厂家试剂盒检测结果对比注：“noct”表示无扩增。
55.5、本发明试剂盒与b厂家乙型流感病毒核酸检测试剂盒（pcr-荧光探针法）检测乙型流感病毒样本效果比较（1）甲流、乙流及呼吸道合胞病毒核酸扩增反应混合液配制采用实施例2的检测方法制备甲流、乙流及呼吸道合胞病毒核酸联合检测pcr反应液。
56.（2）核酸提取使用广州科方生物技术股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（备案号：粤穗械备20210387号）对乙型流感病毒（b/victoria）1.0
×
104～1.0
×
106copies/ml样本进行核酸的提取。
57.（3）核酸检测将10
µ
l上步提取得到的样本核酸加入到甲流、乙流及呼吸道合胞病毒核酸联合检测pcr反应液中，按照实施例2中检测方法进行检测。同时采用b厂家生产的乙型流感病毒核酸检测试剂盒（pcr-荧光探针法）进行以上样本的检测。
58.（4）结果分析测结果如下表8所示，结果表明本发明试剂盒对乙流感病毒核酸检测结果的ct值小于b厂家试剂盒检测结果的ct值，说明本发明的试剂盒灵敏度高于b厂家的试剂盒。
59.表8本发明的试剂盒与b厂家试剂盒检测结果对比注：“noct”表示无扩增。
60.6、本发明试剂盒与c厂家呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒（pcr-荧光探针法）检测呼吸道合胞病毒样本效果比较（1）甲流、乙流及呼吸道合胞病毒核酸扩增反应混合液配制采用实施例2的检测方法制备甲流、乙流及呼吸道合胞病毒核酸联合检测pcr反应液。
61.（2）核酸提取使用广州科方生物技术股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（备案号：粤穗械备20210387号）对呼吸道合胞病毒a型1.0
×
103～1.0
×
105copies/ml样本进行核酸的提取。
62.（3）核酸检测将10
µ
l上步提取得到的样本核酸加入到甲流、乙流及呼吸道合胞病毒核酸联合检测pcr反应液中，按照实施例2中检测方法进行检测。同时采用c厂家生产的呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒（pcr-荧光探针法）进行以上样本的检测。
63.（4）结果分析具体检测结果如下表9所示，结果表明本发明试剂盒对呼吸道合胞病毒核酸检测结果的ct值小于c厂家试剂盒检测结果的ct值，说明本发明的试剂盒灵敏度高于c厂家的试剂盒。
64.表9本发明的试剂盒与c厂家试剂盒检测结果对比
注：“noct”表示无扩增。
65.上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。