一种调控叶片衰老基因ZmSAG39、编码蛋白及其应用

一种调控叶片衰老基因zmsag39、编码蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种调控叶片衰老基因zmsag39、编码蛋白及其应用。


背景技术：

衰老是生物体在细胞、组织、器官及个体水平上随时间推移逐渐退化的一个生物学过程，其引发生命的终结。植物衰老是一个器官水平上的衰退过程，往往伴随叶肉细胞和个体的死亡，如水稻、玉米和大豆等一年生植物灌浆期间叶片的衰老。对树木等多年生植物而言，衰老主要体现在秋季叶片颜色的变化上。植物衰老并非一个被动无序的衰退过程，其本质上是一个叶肉细胞的程序性死亡过程。叶片是植物进行光合作用的主要场所，经过一段时间的光合作用并积累营养物质，叶肉细胞进入衰老期。衰老期间，叶肉细胞的结构、代谢和基因表达均经历有序的变化。叶绿体含有叶肉细胞约70％的总蛋白，是第一个被降解的细胞器。衰老叶片叶绿素含量迅速降低，是叶片衰老速率的一个重要指标。随后，过氧化物酶体等细胞器活性逐渐降低并降解。细胞核和线粒体控制基因转录和能量供应，其完整性一直维持到衰老最后阶段。在细胞代谢方面，衰老叶片的碳同化过程逐渐被叶绿素、蛋白质、膜脂及rna等生物大分子的降解过程取代，从而促进养分转移至幼嫩叶片、种子和果实等器官中。叶片衰老是自然界所有植物生命活动必须经历的一个生理现象，是植物演化过程中被选择保留下的一个生物学过程。在农业生产上，叶片衰老缩短作物生命周期，降低作物产量，导致蔬菜作物叶片黄化及养分流失。因此，挖掘叶片衰老的遗传控制基因，有助于加深人类对该生理现象的认识，从而为生物工程技术改良衰老相关性状提供理论据。研究表明，植物衰老受内在遗传因素和生长环境等外在因素互作调控。影响衰老发生的外在因素包括高温、低温、干旱、臭氧、营养缺乏、病原菌侵染和荫蔽等各种环境胁迫因素，内在因素主要包括基因(如光合作用调控基因cab2、蛋白合成调控基因rps与rbc，以及衰老相关标志基因sags等)表达水平的波动和植物激素(如细胞分裂素、乙烯、乙酰水杨酸和茉莉酸等)含量的变化等。目前已鉴定到的衰老调控基因极大地促进了人类对衰老过程的认识，但挖掘新的衰老调控基因仍将具有重要的理论意义和应用价值。虽然分离鉴定sags调控基因的技术方法已经成熟，但仍需考虑如何鉴定大量不依赖sags途径调控衰老的新基因。利用正向遗传学方法筛选衰老相关突变体，是鉴定到此类基因的有效方法之一。我们知道，衰老起始、发生和结束是一个受到精细调控的复杂生物学过程，现有遗传筛选远未达到饱和，因此选用不同衰老突变体克隆新的衰老调控基因显得尤为重要。相比t-dna插入突变体库，化学诱变方法将更加有价值，因为其可提供新的等位变异，如ahk3/ore12参与调控衰老现象的发现过程。筛选现有衰老突变体的抑制突变有助于进一步解析调控衰老的分子遗传网络。此外，衰老是叶片发育的最后一步，因此衰老控制基因也可能参与到其它生物学过程中发挥作用。为鉴定偶联调控衰老过程的其他生物学通路，分析衰老突变体转录组变化可提供重要
线索。值得指出的是，目前叶片衰老的分子调控机理主要基于基因表达水平的解析，基因表达仅仅是基因发挥生物学功能的一方面，其它调控机制(如蛋白水平、蛋白稳定性和蛋白亚细胞定位等)介导的衰老过程亦需被考虑到。整合蛋白质组和代谢组学分析方法有助于加深对衰老分子调控机理的进一步解析。叶片衰老研究领域的另一个重大挑战是评估衰老控制基因的应用前景。利用生物工程技术对单个基因进行遗传修饰而定向改良目标性状(如作物产量、营养品质、耐逆性或抗病性等)的方法已日趋成熟，能否鉴定到切实有效的衰老控制基因显得尤为重要。对大田生长的农作物而言，由于面临各种竞争抑制和环境胁迫，筛选到本质上改变作物衰老性状的调控基因，对选育抗衰老作物新品种具有重要的理论意义和应用价值。考虑到未来面临的粮食短缺和能源匮乏等重大问题，提高作物产量理应被优先考虑。


技术实现要素：

本发明的目的在于提出一种调控叶片衰老基因zmsag39、编码蛋白及其应用，蛋白质zmsag39正调控植物衰老过程，过量表达zmsag39基因促进叶片衰老发生。该基因为一种新的植物衰老相关基因，该基因zmsag39可参与到衰老调控过程，调整植物群体发育时期以达到增产的目的，有非常重要的应用价值，可以用于培育抗衰老，特别是抗叶片衰老的转基因植物。本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供一种调控叶片衰老的基因zmsag39，其核苷酸序列如seq id no.1所示。本发明进一步保护如上述调控叶片衰老的基因zmsag39在调控叶片衰老性能中的应用。本发明进一步保护如上述调控叶片衰老的基因zmsag39在玉米种质资源改良中的应用。本发明进一步保护如上述调控叶片衰老的基因zmsag39在调控叶片衰老转基因玉米中的应用。本发明进一步保护一种上述调控叶片衰老的基因zmsag39的编码蛋白，其氨基酸序列如seq id no.2所示。本发明进一步保护含有上述调控叶片衰老的基因zmsag39的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体、工程菌或细胞。作为本发明的进一步改进，所述载体为pcambia3301载体，所述pcambia3301载体的多克隆位点区域依次连接有35s启动子、如上述的基因zmsag39和终止子。作为本发明的进一步改进，所述细胞为宿主细胞，所述宿主细胞含有如上述的载体，和/或其基因组中整合有外源的如上述的基因zmsag39的正向或反向序列。本发明进一步保护一种延缓植物叶片衰老的方法，将上述的调控叶片衰老的基因zmsag39整合到植物的细胞、组织和器官中，并使其过量表达。作为本发明的进一步改进，所述植物包括玉米、水稻、小麦、拟南芥。本发明具有如下有益效果：本发明提供了一种调控叶片衰老的基因zmsag39。蛋白质zmsag39正调控植物衰老过程，过量表达基因zmsag39促进叶片衰老发生。该基因为一种
新的植物衰老相关基因，该基因zmsag39可参与到衰老调控过程，调整植物群体发育时期以达到增产的目的，有非常重要的应用价值，可以用于培育抗衰老，特别是抗叶片衰老的转基因植物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为基因zmsag39在玉米自交系h8186不同组织中的表达模式；图2为重组表达载体pcambia3301-sag39的图谱示意图；图3为实施例4中基因zmsag39表达水平的鉴定结果；图4为实施例4中表型观察的结果；图5为实施例4中相对叶绿素含量检测的结果；图6为实施例4中相对离子渗透率检测的结果；图7为实施例4中h2o2含量检测的结果；图8为实施例4中黑暗处理对叶片衰老的影响。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
32.从玉米中发现一个新蛋白，如序列表的序列2所述，将其命名为zmsag39蛋白。编码sag39蛋白的全长基因如序列表的序列1所示。本实验选取了玉米自交系h8186成熟期的根、茎、叶、雌穗和雄穗，通过qrt-pcr的实验方法检测基因zmsag39的相对表达水平见图1，图2为重组表达载体pcambia3301-sag39的图谱示意图。基因zmsag39在各个组织中的转录水平不同，意味着基因zmsag39可能在某些特定的组织发挥着重要的功能。实施例1sag39基因的克隆选择玉米自交系h8186为实验材料，提取三叶期玉米叶片组织，并反转录成备用。从玉米数据库检索获取sag39的生物学信息，转录本id为grmzm2g070011_p01。以基因序列为模板设计特异性扩增引物，特异性扩增引物序列如下所示：sag39-f：5
’‑
aaacaactgcactagacatctc-3’；sag39-r：5
’‑
agcctaatcttatttattattgaaa-3’。以cdna为模板，sag39-f和sag39-r为引物，利用takara公司生产的高保真酶primer star max premix(2
×
)进行扩增反应，扩增反应体系如下表1：表1
pcr扩增程序为95℃5min预变性，95℃30s变性，52℃35s退火，72℃30s延伸，最后，72℃下继续延伸10min完成反应，获得的pcr产物用质量比为2％的琼脂糖凝胶泳检测。将目标基因用axygen公司的胶回收试剂盒进行切胶回收，与pmd-18t载体连接后转化到dh5α大肠杆菌感受态细胞中，进行菌液pcr，筛选阳性克隆，并送去测序。实施例2sag39基因过表达载体的构建根据pcambia3301的多克隆位点及目的基因的序列特征，选择在目的基因pmd-18t-sga39两端加入bglii和bsteii酶切位点，扩增引物序列如下所示：sag39-f：5
’‑
actcttgaccatggtagatctaaacaactgcactagacatctc-3’；sag39-r：5
’‑
ggggaaattcgagctggtcaccagcctaatcttatttattattgaaa-3’。用bglii和bsteii双酶切质粒得到pcambia3301大片段。在37℃下酶切3小时，之后与目的基因再进行连接，连接体系如下：表2表2连接反应在52℃下进行15min后，将重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞中，挑菌、摇菌、提质粒，并通过双酶切验证以及公司测序后，获得如图3所示的基因过表达载体pcambia3301-sag39-bar。实施例3基因zmsag39的拟南芥遗传转化(1)拟南芥种子的清洗先取50ml次氯酸钠溶液于50ml水中，配置成5％的次氯酸钠溶液。取待清洗种子于
无菌离心管中，每管加入1ml的5％的次氯酸钠溶液，浸泡清洗10-15min，期间间隔摇晃再用无菌水漂洗次，期间摇晃混匀，以洗净种子表面次氯酸钠溶液和杂质将清洗杀菌之后的哥伦比亚野生型拟南芥种子在4℃冰箱处理2-3天，备用。(2)拟南芥的培养取出清洗之后种子，借助移液枪均匀铺散在ms固体培养基的培养皿上，拟南芥培养室培养将培养基上生长15天左右的幼苗移入混合后的营养土中生长，营养黑土和蛙石体积比为3:8，继续温室培养需要注意的是，刚刚移栽的幼苗需保持水分，采用透光塑料膜覆盖法，2-3天后揭开。(3)农杆菌介导转化拟南芥将构建的pcambia3301-sag39-bar过表达载体导入gv3101农杆菌感受态细胞中，获得侵染菌。待移栽的拟南芥大部分准备第一次开花时，即为拟南芥侵染最佳时期。为了促进拟南芥有花枝的增生，可修剪提前开花的花苞同时将已经有的角果剪去，提高转基因种子的阳性率。转化方法如下：将侵染菌进行扩大培养至od
600
值为0.6-0.8。同时配置转化buffer溶液，1l的buffer溶液需要2.1gms，50g蔗糖，1ml b5维生素，用naoh调节ph值到5.8。处理液使用前还需加入表面活性剂。取搅拌后的混合buffer溶液悬浮离心得到的菌块，即得到侵染溶液。浸染拟南芥花序：拟南芥抽蔓约10厘米高时，用农杆菌浸染液浸湿拟南芥花序，重复2-3次，用保鲜膜包裹住植株地上部分，在黑暗下培养3天。一个礼拜后，再次重复浸染。大约两个月，收获成熟拟南芥的t0代种子，干燥后置于4℃下保存。(4)zmsag39转基因拟南芥的筛选将上述收获的拟南芥t0代种子经消毒(用5％的次氯酸钠溶液漂洗，然后用灭菌的蒸馏水冲洗2-3次，每次清洗时间约1分钟)，4℃春化1天(避光)，种子均匀洒在含除草剂的培养基平板上，同时以野生型拟南芥种子作为对照。如果野生型拟南芥种子在不含抗性的平板上能够正常萌发生长，在含抗性的平板上均不能正常萌发生长，而转基因拟南芥中却有种子在含抗性的平板上能够正常萌发生长，则认为筛选阳性拟南芥植株是有效的。以基因zmsag39为目的基因，对筛选的阳性植株进行分子检测，初步鉴定转基因拟南芥是否转化成功。(5)zmsag39转基因拟南芥后代的获得按照步骤的方法，将初步鉴定为转基因拟南芥植株的种子(t1代)用含除草剂的培养基平板进行筛选，获得t1代植株，待t1代植株果荚成熟时，收获转基因t2代种子，以此类推，最终获得了两组稳定遗传的转基因拟南芥t2代株系，分别为oe1和oe6。转基因株系在整个生理过程发挥着重要的协调作用。实施例4植株的鉴定将供试植株为同一条件下培养。培养条件：光照16小时/黑暗8小时，24℃。一、基因zmsag39表达水平的鉴定供试植株：野生型拟南芥、oe1株系的t3代植株、oe6株系的t3代植株。在同一正常条件下培养供试植株。取生长至4周的供试植株的叶片，提取总rna，反转录得到cdna。以cdna为模板进行实时荧光定量pcr。参考基因为actin。一次平行试验设3次重复。利用2-δδct
计算相对表达量。
qsag39-f：5'-acatgaaccatgcagtgacg-3'；qsag39-r：5'-agctgcatgaaaccgttctc-3'；actin-f:5'-ctacgagcaggaactcgaga-3'；actin-r:5'-gatggacctgactcgtcatac-3'。结果见图3。转基因株系的基因zmsag39相对表达量明显高于生态型拟南芥。二、性状鉴定1、表型观察生长至6周的植株的照片见图4。转基因株系的衰老程度高于野生型拟南芥，衰老程度高具体体现为莲座叶变黄程度高，变黄的莲座叶数量大。2、相对叶绿素含量检测长至6周的植株，取莲座叶，检测其中的相对叶绿素含量(每个株系对3株植株进行检测)。相对叶绿素含量测定的方法如下：向样品中加入5ml80％丙酮提取液，黑暗条件下浸提24小时使叶片完全褪绿。以80％丙酮做对照，然后，用uv2400 uv/vis分光光度计在665nm和645nm处检测吸光度来测定叶绿素含量。结果见图5和表2。转基因株系莲座叶中相对叶绿素含量显著低于野生型拟南芥。表3 相对叶绿素含量(spad)生态型拟南芥14.2531
±
1.4021oe1株系6.9455
±
1.4234oe6株系5.8835
±
0.89943、相对离子渗透率检测生长至5周的植株，取莲座叶，检测相对离子渗透率。相对离子渗透率测定方法如下：将叶片放入15ml的离心管中，加入10ml蒸馏水，摇匀，180rpm室温振荡12h，检测电导率即为初始电导率(s1)；然后把离心管放入水浴锅中，100℃反应10min，然后冷却至室温，检测电导率即为最终电导率(s2)。叶片的相对电导率(rec)计算公式为：rec(％)＝s1/s2
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100。检测电导率采用ddsj-308a型电导率仪，上海仪点科学仪器股份有限公司。结果见图6和表3。转基因株系莲座叶中相对离子渗透率显著高于野生型拟南芥。表4表44、h2o2含量检测
生长至4周的植株，取莲座叶，采用red过氧化氢/过氧化氢酶检测试剂盒检测h2o2含量(每个株系对3株植株进行检测)。结果见图7和表4。转基因株系莲座叶中h2o2含量显著高于野生型拟南芥。表5 h2o2含量(μm/g鲜重)生态型拟南芥0.1895
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0.0047oe1株系0.2836
±
0.0034oe6株系0.3194
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0.00285、黑暗处理参见图8，对于离体叶子的黑暗处理，取30天龄拟南芥的第5或者第6片叶子，将叶片放置在用3mm mes，0.5
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ms的混合缓冲液浸泡过的滤纸上。对于要暗处理的叶片，用铝箔包裹，黑暗处理6天。综上所述，过表达基因zmsag39，导致植株莲座叶中叶绿素含量降低、相对离子渗透率升高、过氧化氢含量升高。说明zmsag39蛋白具有促进叶绿素含量降低以及促进过氧化氢积累的能力，从而促进植物叶片衰老。因此，通过调控植物中基因zmsag39的表达量，可以调控植物叶片衰老的进程。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。