一种睾丸内巨噬细胞的分选方法

1.本发明涉及生物细胞技术领域，具体涉及一种睾丸内巨噬细胞的分选方法。


背景技术：

2.巨噬细胞属于免疫细胞，是单核吞噬细胞系统的一部分，其主要作用是吞噬死细胞、细胞碎片、病原体和其他异物。此外，它们还具有信号传导和调节功能。巨噬细胞具有很强的组织特异性及可塑性，能够响应环境信号改变其表型。目前，巨噬细胞在衰老、免疫、发育、组织修复和癌症等领域都得到了广泛且深入的研究。巨噬细胞存在于人体的许多组织中，它不是功能一致的一群细胞，而是具有丰富异质性的一群细胞。不同的巨噬细胞亚群具有不同的基因表达谱和细胞功能。为了更好地理解这些差异，目前主要通过对巨噬细胞表面的不同蛋白质标记物进行流式分选研究。常见的巨噬细胞蛋白标志物包括：f4/80、cd206、cd86、cd68、cd14、cd163、cd11b等。
3.随着单细胞测序技术的不断发展，越来越多巨噬细胞表面蛋白标志物被发现，而这也使得越来越多不同组织内的巨噬细胞亚群被发掘，比如说肿瘤相关的tcr
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巨噬细胞、红细胞生成相关的cd169
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巨噬细胞和慢性心力衰竭相关的cd72
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的巨噬细胞。然而，对于睾丸巨噬细胞来说，目前仍主要根据其它组织已报道的表面蛋白标志物f4/80、cd11b等进行标记，而忽视了巨噬细胞组织特异性强的特点，这也导致更多功能性的睾丸内巨噬细胞亚群难以被深入研究。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种睾丸内巨噬细胞的分选方法。
5.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：cd74作为蛋白标志物在巨噬细胞分选中的应用。
6.本技术发明人针对现有睾丸内巨噬细胞表面蛋白标志物组织特异性不强的缺点，结合单细胞测序技术，以小鼠为研究对象，分析不同年龄状态下的小鼠睾丸内巨噬细胞的表面蛋白标志物，并筛选出组织特异性最强、分选效果最佳的标志物，从而构建一种分选睾丸内巨噬细胞的新方法。
7.作为本发明所述的cd74作为蛋白标志物在巨噬细胞分选中的应用的优选实施方式，所述巨噬细胞为睾丸内巨噬细胞。
8.本发明还提供一种睾丸内巨噬细胞的分选方法，通过cd74抗体分选睾丸组织细胞获得睾丸内巨噬细胞。
9.作为本发明所述的睾丸内巨噬细胞的分选方法的优选实施方式，所述分选方法包括以下步骤：
10.(1)获取睾丸组织浆；
11.(2)获取睾丸组织细胞；
12.(3)cd74抗体孵育睾丸组织细胞；
13.(4)使用流式分析检测，得到睾丸巨噬细胞。
14.作为本发明所述的睾丸内巨噬细胞的分选方法的优选实施方式，所述分选方法具体包括以下步骤：
15.(1)取睾丸，去除睾丸白膜后，加入pbs，将睾丸剪碎成糊状，得睾丸组织浆；
16.(2)取上述睾丸组织浆，加入ⅳ型胶原酶，37℃水浴消化15min，再吹打睾丸组织浆，加入冰pbs终止消化，经70μm筛网过滤后，将细胞悬液于1500rpm离心5min，取细胞沉淀，得睾丸组织细胞；
17.(3)睾丸组织细胞加入pbs重悬，取细胞悬液加入流式管中，并加入含2％fbs的pbs溶液，作为阴性对照样品；再取细胞悬液加入cd74抗体进行染色，并于4℃避光孵育30min；染色结束后，于1500rpm离心5min，取细胞沉淀；使用pbs重悬细胞沉淀，于1500rpm离心5min，弃上清，重复两次；在细胞沉淀中加入含2％fbs的pbs溶液重悬，经40μm筛网过滤，留滤液，得细胞悬液；
18.(4)将步骤(3)的细胞悬液进行流式分选，得所述丸内巨噬细胞。
19.本技术发明人经过大量实验发现，在获取睾丸组织浆时，将睾丸组织剪碎成糊状，将操作时间控制在3-5min内，可以避免对细胞的活性造成影响。
20.作为本发明所述的睾丸内巨噬细胞的分选方法的优选实施方式，所述cd74抗体的浓度小于0.5μg/million cell。
21.作为本发明所述的睾丸内巨噬细胞的分选方法的优选实施方式，所述ⅳ型胶原酶的浓度为1mg/ml。
22.本技术发明人经过大量实验发现，在使用ⅳ型胶原酶对睾丸组织进行消化时，当ⅳ型胶原酶的浓度为1mg/ml，其消化效果最佳。
23.本发明还提供由上述睾丸内巨噬细胞的分选方法制备的睾丸内巨噬细胞。
24.本发明还提供所述睾丸内巨噬细胞在睾丸内巨噬细胞功能性研究中的应用。目前针对睾丸巨噬细胞主要根据其它组织已报道的表面蛋白标志物f4/80、cd11b等进行标记，而忽视了巨噬细胞组织特异性强的特点，这也导致更多功能性的睾丸内巨噬细胞亚群难以被深入研究。本发明分选的睾丸内巨噬细胞采用蛋白标志物cd74，分选效果好，可用于睾丸巨噬细胞相关的研究。
25.本发明还提供一种用于分选睾丸内巨噬细胞的试剂盒，所述试剂盒包含cd74抗体。
26.本发明的有益效果：本发明提供了一种睾丸内巨噬细胞的分选方法，本技术发明人经过大量的实验筛选，最终发现本发明所涉及的睾丸巨噬细胞蛋白标志物cd74比现有常见的巨噬细胞蛋白标志物，包括f4/80、cd206、cd86、cd68、cd14、cd163、cd11b，在睾丸巨噬细胞群里具有更广泛的表达，体现出了最强的睾丸特异性；采用本发明的睾丸内巨噬细胞的分选方法能够准确高效的分离睾丸巨噬细胞。
附图说明
27.图1为3月龄(3m)与21月龄(21m)小鼠睾丸内细胞分布图。
28.图2为3月龄(3m)与21月龄(21m)小鼠睾丸内总体细胞分群图。
29.图3为小鼠睾丸单细胞测序中特异性细胞标志物的热图及其功能分析图。
30.图4为3月龄(3m)与21月龄(21m)小鼠睾丸单细胞测序中巨噬细胞标志物表达情况图。
31.图5为3月龄(3m)与21月龄(21m)小鼠睾丸cd74阳性巨噬细胞流式分选及分选后cd74的表达情况图。
32.图6为3月龄(3m)与21月龄(21m)小鼠睾丸cd74阳性巨噬细胞流式分选后普通转录组测序中常见巨噬细胞蛋白标志物的表达情况。
33.图7为3月龄(3m)与21月龄(21m)小鼠睾丸cd74阳性巨噬细胞流式分选后普通转录组测序的细胞功能分析图。
具体实施方式
34.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
35.实施例1
36.本实施例提供一种睾丸内巨噬细胞的分选方法，并采用该方法分别分选3月龄(3m)与21月龄(21m)小鼠睾丸内巨噬细胞，具体实验方法如下：
37.(1)获取睾丸组织浆：颈椎脱臼处死小鼠，经腹腔解剖，剔除多余脂肪，取出睾丸组织；去除睾丸白膜后，加入适量pbs，使用显微剪将睾丸组织剪碎成糊状，得睾丸组织浆；
38.(2)获取睾丸组织细胞：每只小鼠双侧睾丸加入1ml浓度为1mg/ml的ⅳ型胶原酶，37℃水浴消化15min，7min左右至棉絮状，吹打一次；再加入6ml冰pbs终止消化，经70μm筛网过滤后，将细胞悬液置于1500rpm离心5min，取沉淀，得睾丸组织细胞；
39.(3)cd74抗体孵育睾丸组织细胞：将睾丸组织细胞加入1ml pbs重悬后，取200μl细胞悬液加入流式管中，并加入800μl含2％fbs的pbs溶液，作为阴性对照样品；剩余细胞悬液加入alexa fluor647anti-mouse cd74(抗体浓度为《0.5μg/million cell)染色，4℃避光孵育30min；染色结束后，混合液经1500rpm离心5min，弃上清；用pbs重悬细胞沉淀，并置于1500rpm离心5min，弃上清，重复两次以除去残余抗体；最后在细胞沉淀加入2ml含2％fbs的pbs溶液重悬，经40μm筛网过滤除去多余杂质，得细胞悬液；
40.(4)使用流式分析检测，得到睾丸巨噬细胞。
41.实施例2
42.本实施例将实施例1中提取的3月龄(3m)与21月龄(21m)小鼠睾丸组织细胞进行细胞测序，观察不同年龄小鼠睾丸内的细胞的分布、睾丸内总体细胞分群和睾丸细胞巨噬细胞标志物表达情况。实验结果如图1～图4所示。由图1可知，3m组共捕获7524个睾丸细胞，21m组共捕获3597个睾丸细胞。二者间的细胞数量比例未见明显变化。由图2可知，去除单倍体后，3m组与21m组睾丸内主要的细胞群，包括固有淋巴细胞、管周肌样细胞、内皮细胞、睾丸间质细胞、巨噬细胞、精原细胞、精母细胞、长形精子、圆形精子及支持细胞。此外，结果较好地还原了精子发生的整个过程。图3的睾丸单细胞测序结果真实地还原了睾丸内不同细胞的功能及其特异性细胞标志物，包括巨噬细胞的抗原递呈功能及其标志物cd74与f4/80。由图4可知，与现有常见的巨噬细胞蛋白标志物f4/80、cd206、cd86、cd68、cd14、cd163、cd11b等相比，cd74在睾丸巨噬细胞群里具有更广泛且更高水平的表达。
43.实施例3
44.本实施例将实施例1中提取的3月龄(3m)与21月龄(21m)小鼠睾丸巨噬细胞进行细胞测序，观察不同年龄小鼠巨噬细胞cd74和各蛋白标志物的表达情况。实验结果如图5～图7所示。由图5～图7可知，3月龄(3m)与21月龄(21m)小鼠睾丸巨噬细胞中cd74的表达水平比其他蛋白高。
45.最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。