一种用于化学发光反应体系的清洗液及其制备方法与流程

1.本发明涉及体外诊断领域，具体涉及一种用于化学发光反应体系的清洗液及其制备方法。


背景技术：

2.免疫学检测主要是利用抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段，由于其可以利用同位素、酶、化学发光物质等对检测信号进行放大和显示，因此常被用于检测蛋白质、激素等微量物质，从上世纪六十年代开始，免疫分析就广泛应用于科研及临床领域，从最开始的放射免疫法逐步发展到酶联免疫法、直到目前广泛应用的化学发光免疫法。
3.化学发光免疫分析是将化学发光或生物发光与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术，化学发光的机制为某些化合物(发光剂或发光底物)可以利用一个化学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子激态，当此产物分子或中间态分子衰退至基态时，以发射光子的形式释放能量(即发光)。免疫测定是利用抗原体反应来测定标本中微量物质的方法，因此，化学发光反应体系与传统的酶联免疫法相比，灵敏度高、检测范围宽。
4.化学发光免疫分析的步骤包括：包被抗体——清洗液洗涤——加入待检血清和阳性标准品——清洗液洗涤——加入酶标抗体——清洗液洗涤——加入化学发光底物——测定化学发光强度，在化学发光免疫分析中，清洗液洗涤十分重要，其作用是除去样品与反应无关的成分和游离的结合物以及反应过程中吸附于固相载体上的非特异性干扰物质，使空白值处于较低的水平，不对后续检测结果产生干扰，避免因洗涤不彻底造成的灵敏度降低的问题。
5.现有技术中，化学发光免疫分析法中的清洗液一般采用pbs，如公开号为cn201710862223.2的中国专利公开了一种运用电化学发光成像识别技术的生物标志物检测方法，其中采用的0.1m pbs缓冲溶液作为清洗液，该清洗液的组分仅包括了磷酸盐、钠盐、钾盐，而应杯内未参加特异性反应物质的主要成分为蛋白质，使用该清洗剂，洗脱蛋白的效果并不好，导致空白值高，影响检测项目的结果。


技术实现要素：

6.为解决上述问题，本发明提供一种用于化学发光反应体系的清洗液及其制备方法，洗脱非特异性干扰物质效果好，为基于化学发光反应体系建立的检测方法的灵敏度提供较好的基础。
7.发明人发现，影响化学发光反应体系建立的检测方法的灵敏度的因素有很多，如抗体本身的效价高低、抑制率的大小，所建立的方法中ic50的大小、线性范围的宽广等等，这类前端物料对灵敏度的影响在使用化学发光反应的检测试剂盒前已经成型，但在使用化学发光反应的检测试剂盒时，清洗液对基于化学发光反应体系建立的检测方法的空白值起重要作用，若清洗液洗涤效果不好，导致多孔板中的杂质较多，空白值高，则对后续反应产
生干扰，致使达不到化学发光反应的检测试剂盒原有的检测灵敏度。
8.清洗液不仅为免疫反应提供适宜的酸碱环境及电解质，更重要的是除掉反应过程中未结合免疫反应物，终止抗原抗体继续结合，而通过在清洗液中添加非离子表面活性剂，与未结合免疫反应物及吸附于固相载体上的非特异性干扰物质发生化学反应，从而除掉这些干扰免疫的杂质，保证化学发光免疫检验能正常进行；不添加非离子表面活性剂时，清洗液可保存较长时间，但是，添加了非离子表面活性剂后，清洗液中包括的低浓度钠/钾盐、高浓度磷酸根、非离子表面活性剂均是助长微生物生长的良好条件，清洗液放置长时间后容易长菌沉淀，不仅不能提高洗涤效果，反而会增加杂质，最终也引起空白值高，对反应产生干扰，因此本方案中，还添加了用于抑菌的防腐剂等。
9.根据本发明的第一方面，提供一种用于化学发光反应体系的清洗液，包括磷酸缓冲盐、钠盐和/或钾盐、非离子表面活性剂、增稠剂、复配防腐剂、蒸馏水的混合物，所述非离子表面活性剂为曲拉通x-100；本技术中，磷酸缓冲盐用于使溶液保持一定的离子强度，使其具有一定的电导率及合适的ph值，增稠剂能使该洗涤剂保持较高的渗透压，钠盐和/或钾盐中的钾离子、钠离子补充清洗液所需的离子浓度，非离子表面活性剂可加速抗体非特异性结合的分离，与未结合免疫反应物及吸附于固相载体上的非特异性干扰物质发生化学反应，且非离子表面活性剂对缓冲盐有助溶作用，而防腐剂的组分可延长储存时间，解决了因添加非离子表面活性剂而造成长菌的缺陷。
10.另外，本方案所述非离子表面活性剂为曲拉通x-100，浓度为0.02 0.11mmol/l，曲拉通x-100的主要组成成分为聚氧乙烯-8-辛基苯基醚，具亲水端和疏水端，可将膜蛋白从细胞膜上解离下来，达到提取膜蛋白的作用，与同作为非离子表面活性剂的吐温相比，具有破膜作用，可穿透活性细胞细胞膜，除了作为非离子表面活性剂之外，还作为细胞通透剂，增加抗体对细胞膜的通透性，去除非特异性干扰物质的效果更好，洗涤更彻底。
11.优选地，所述增稠剂为丙二醇，浓度为1.5-2.3mol/l,增稠剂能使该洗涤剂保持较高的渗透压，减轻化学发光免疫分析仪的驱动压力，延长化学发光免疫分析仪的使用寿命。
12.优选地，所述复配防腐剂包括proclin300防腐剂、bronidox防腐剂的混合物，防腐剂proclin300的浓度为0.5-18g/l，防腐剂bronidox的浓度0.2g-2g/l，本方案使用的是复配型防腐剂，单一使用防腐剂proclin300不能完全起到防腐作用，而复配型防腐剂相较于常用的防腐剂如叠氮钠，成本低且防腐效果好。
13.优选地，所述钠盐为氯化钠，所述钾盐为氯化钾。
14.优选地，所述清洗液的ph为6.7-7.2，例如6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2，该范围内，不会对抗原-抗体反应产生干扰，也不会对仪器反应体系产生损害负荷。
15.优选地，所述磷酸缓冲盐包括的磷酸氢二钠与磷酸二氢钾的混合物，为了调整清洗液的ph值，选取磷酸氢二钠与磷酸二氢钾按照公知比例配置，使之达到6.7-7.2的范围，。
16.优选地，所述磷酸氢二钠的浓度为0.3-0.8 mmol/l，例如，0.3 mmol/l、0.4mmol/l、0.5 mmol/l、0.6 mmol/l、0.7 mmol/l、0.8 mmol/l，所述磷酸二氢钾的浓度为14.5-18.7 mmol/l，例如，14.5mmol/l、15mmol/l、16mmol/l、17mmol/l、18mmol/l、18.7mmol/l，二者配制的磷酸缓冲盐若浓度太高，则整体清洗液的盐离子浓度大，易对仪器造成辅食，若浓度太
低，则起不到效果。
17.优选地，所述钠盐和/或钾盐中的离子浓度为130-180mmol/l，大于该范围，则清洗液过饱和，易析出晶体，小于该范围，则离子强度低，起不到清洗效果。
18.根据本发明的第二方面，还提供一种用于化学发光反应体系的清洗液的制备方法，包括以下步骤：将称量好的磷酸缓冲盐、钠盐和/或钾盐、增稠剂、复配防腐剂用部分蒸馏水溶解后，再在搅拌状态下加入非离子表面活性剂，而后用剩余部分的蒸馏水定容摇匀，即得所述清洗液；由于非离子表面活性剂粘度大且易起泡，若直接将所有原料混合并溶解摇匀，会使配制得到的清洗液上层存在气泡，不便于使用。
19.本发明的有益效果在于：1.本方案的清洗液可去除化学发光反应体系中未结合的免疫反应物，终止抗原抗体的继续结合，除去样品与反应无关的成分和游离的结合物以及反应过程中吸附于固相载体上的非特异性干扰物质，如残留的蛋白进行清洗，洗涤效果好，为基于化学发光反应体系建立的检测方法的灵敏度提供较好的基础；2.本方案的清洗液对滋生的细菌具有良好的抑制作用，储存时间长；3.本方案的清洗液对仪器的损害负荷小，能够普遍应用到不同厂家机型的化学发光免疫分析仪的清洗工作中，可替代相应的原装试剂，降低检测成本，降解性好，不易造成环境污染。
附图说明
20.图1为清洗效果验证结果。
具体实施方式
21.下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
22.本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
23.实施例1一种用于化学发光反应体系的清洗液，包括如下组分：氯化钠
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35g/l氯化钾
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145 g/l磷酸氢二钠
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0.3mmol/l磷酸二氢钾
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14.5mmol/l曲拉通x-100
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0.02mmol/l丙二醇
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1.5mol/lproclin300
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0.5g/ lbronidox
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0.2g/ l实施例2一种用于化学发光反应体系的清洗液，包括如下组分：
氯化钠
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45g/l氯化钾
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160g/l磷酸氢二钠
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0.3mmol/l磷酸二氢钾
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14.5mmol/l曲拉通x-100
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0.11mmol/l丙二醇
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2mol/lproclin300
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0.5g/ lbronidox
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0.2g/ l实施例3一种用于化学发光反应体系的清洗液，包括如下组分：氯化钠
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210g/l磷酸氢二钠
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0.8mmol/l磷酸二氢钾
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18.7 mmol/l曲拉通x-100
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0.08mmol/l丙二醇
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1.5mol/lproclin300
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5g/ lbronidox
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1g/ l实施例4一种用于化学发光反应体系的清洗液，包括如下组分：氯化钾
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210g/l磷酸氢二钠
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0.8mmol/l磷酸二氢钾
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18.7 mmol/l曲拉通x-100
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0.02mmol/l丙二醇
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2.3mol/lproclin300
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18g/ lbronidox
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2g/ l实施例5一种用于化学发光反应体系的清洗液的制备方法，先按照下述配方称量好原料：氯化钠
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45g/l氯化钾
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160g/l磷酸氢二钠
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0.3mmol/l磷酸二氢钾
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14.5mmol/l曲拉通x-100
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0.11mmol/l丙二醇
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2mol/lproclin300
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0.5g/ lbronidox
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0.2g/ l，将称量好的磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、丙二醇、proclin300、bronidox用800ml蒸馏水溶解后，再在搅拌状态下加入曲拉通x-100，而后用蒸馏水定容至1l后摇匀，即得所述清洗液。
24.对比例1一种用于化学发光反应体系的清洗液，其他组分与实施例1相同，所不同的是，不包括曲拉通x-100。
25.对比例2一种用于化学发光反应体系的清洗液，其他组分与实施例1相同，所不同的是，不包括防腐剂。
26.对比例3一种用于化学发光反应体系的清洗液，其他组分与实施例1相同，所不同的是，不包括防腐剂及非离子表面活性剂。
27.对比例4一种用于化学发光反应体系的清洗液，其他组分与实施例1相同，所不同的是，不包括增稠剂。
28.对比例5一种用于化学发光反应体系的清洗液，其他组分与实施例1相同，所不同的是，将曲拉通x-100替换为吐温-80。
29.对比例6一种用于化学发光反应体系的清洗液，其他组分与实施例1相同，所不同的是，将防腐剂由proclin300、bronidox的混合物替换为proclin300。
30.对比例7一种用于化学发光反应体系的清洗液，其他组分与实施例1相同，所不同的是，将防腐剂由proclin300、bronidox的混合物替换为bronidox。
31.对比例8一种用于化学发光反应体系的清洗液，其他组分与实施例1相同，所不同的是，将防腐剂由proclin300、bronidox的混合物替换为叠氮钠。
32.测试例1使用实施例1-4及对比例1-8中的清洗液作为清洗试剂运用于促甲状腺素试剂盒的检测，步骤如下：首先将大量空白血清与促甲状腺素试剂盒反应，再将以上反应液分装于空白比色杯中，静置30min，倒掉，使用实施例1-4及对比例1-8中的清洗液在相同的加入量的情况下进行比色杯清洗，各进行3组平行实验并取平均值，清洗后加入等量的水，摇匀，在蛋白质最大吸收波长280nm下，测试空白比色杯中因未清洗干净而引起的非特异性反应产生的吸光度，观察结果，结果如表1所示，表明本发明的改进配方的清洗液，清洗效果好，空白值低，抗干扰能力强。
33.测试例2将实施例1-4及对比例1-8中的清洗液放置于30℃环境下，加入等量的金黄色葡萄球菌，观察出现絮状沉淀的时长，结果如表2所示，说明本方案的抑菌效果好。
34.表1 测试评价结果ꢀ吸光度1吸光度2吸光度3平均值出现絮状沉淀（天）实施例10.020.050.030.0360实施例20.010.040.030.0360
实施例30.030.020.020.0260实施例40.010.040.030.0360对比例10.120.150.180.1565对比例20.020.040.030.0315对比例30.150.160.130.1520对比例40.160.150.180.1625对比例50.180.170.170.1745对比例60.020.030.020.0245对比例70.030.010.020.0245对比例80.030.030.010.0260测试例3先将大量空白血清与促甲状腺素试剂盒反应，再将以上反应液分装于空白比色杯中，静置30min，倒掉，使用自配清洗液与原装配套试剂在相同的加入量的情况下进行比色杯清洗(各进行20组平行试验)，清洗后加入等量的水，摇匀，在蛋白质最大吸收波长280nm下，测试吸光度，观察结果，结果如图1所示。
35.本领域普通技术人员可以理解，以上各实施例仅用以说明本技术的技术方案，而非对其限制，尽管参照前述各实施例对本技术进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本技术权利要求所限定的范围。