一种可视化混合染料及其在LAMP检测中的应用的制作方法

一种可视化混合染料及其在lamp检测中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种可视化混合染料及其在lamp检测中的应用。


背景技术：

2.环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，lamp)是一种近年来发展较快的核酸恒温扩增技术。它能够在恒定温度下对靶基因序列进行扩增，进而实现目的基因的快速检测，因其时间短、灵敏度高、特异性好和操作便捷等优点受到越来越多的关注。目前，lamp结果的读取主要分为浊度检测、琼脂糖凝胶电泳检测和荧光/可视化染料检测等3类方法。但由于浊度检测和电泳检测都依赖于仪器并需要较复杂操作，因而可视化染料检测方法越来越受到专家学者的青睐。该方法只需在lamp反应开始前于反应体系中加入染料，反应后，阴性反应试剂和阳性反应试剂即会呈现出明显的颜色差异，从而实现反应结果的快速判读。
3.目前，应用比较广泛的染料由以下两种：1)羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue，hnb)，hnb作为金属离子指示剂，深紫色粉末，易溶于水和乙醇，也可作为lamp反应可视化指示剂。在lamp体系中提前加入hnb水溶液，起初镁离子与hnb结合使得反应液为紫色，随着反应的进行，mg
2+
与析出的p2o
74-反应生成mg2p2o7沉淀，hnb失去mg
2+
使得体系颜色变为天蓝色，而未反应的体系则仍保持紫罗兰色；2)钙黄绿素(calcein)，亮黄色粉末，溶于乙醇和碱，微溶于水，荧光指示剂，与mg
2+
结合而成的复合物可产生强烈荧光，自然光下阴性、阳性结果间存在一定差异，但并不明显。首先在钙黄绿素中加入mn
2+
，mn
2+
使钙黄绿素的绿色荧光淬灭。当lamp扩增反应发生后，产生的副产物焦磷酸离子与mn
2+
结合并释放钙黄绿素，淬灭状态解除。最终呈现的结果为在365nm蓝光激发下，阳性反应发出强绿色荧光，阴性反应发出较弱绿色荧光。
4.上述两种染料通常被单独使用，但是它们存在一个极大的弊端，就是阴性和阳性结果之间颜色差异不够明显，或者需要仪器辅助判读结果，过程复杂。尤其是在自然光下，当目标基因浓度过低时，弱阳性结果与阴性结果难以区分，从而导致结果判读不准确。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提供一种可视化混合染料及其在lamp检测中的应用。
6.本发明采用的技术方案是：一种可视化混合染料，包括试剂a和试剂b，试剂a和试剂b体积比为1：2；
7.试剂a中含有钙黄绿素和氯化锰，钙黄绿素的浓度为500μm，氯化锰浓度为10mm；
8.试剂b中含有羟基萘酚蓝，羟基萘酚蓝浓度为0.32mm。
9.优选地，试剂a和/或试剂b由去核酸酶水制备得到。
10.可视化混合染料在lamp检测中的应用。
11.优选地，在lamp反应前预先加入到lamp反应体系中。
12.优选地，lamp扩增前，反应体系呈灰蓝色；
13.lamp扩增结束后，阳性反应体系为天蓝色，阴性反应体系为紫罗兰色。
14.本发明具有的优点和积极效果是：与目前常见可视化染料相比，本方案所公开的可视化混合染料使lamp反应结果更容易判断，阴性和阳性结果间颜色差异更加明显，极大程度避免了结果的判断，而且不需要复杂的仪器设备来辅助检测实验结果；
15.另外，该可视化混合染料预先添加与lamp反应体系中，在lamp反应后，不必再打开pcr管盖，避免了对实验室环境造成核酸污染；
16.该可视化混合染料为非dna嵌入型染料，对lamp反应干扰小，不影响lamp检测的灵敏度与特异性。
附图说明
17.图1是本发明实施例lamp扩增前新型混合染料显色；
18.图2是本发明实施例lamp扩增后新型混合染料显色；
19.图3是本发明实施例核酸电泳图；
20.图4是本发明对比例lamp扩增前显色情况；
21.图5是本发明对比例lamp扩增后显色情况；
22.1：106copies/μl，2：105copies/μl，3：104copies/μl，4：103copies/μl，5：102copies/μl，6：101copies/μl，7：1copies/μl，8：ntc。
具体实施方式
23.下面结合附图对本发明的实施例做出说明。
24.本发明公开一种可视化混合染料，包括试剂a和试剂b，试剂a和试剂b体积比为1：2；试剂a中含有钙黄绿素和氯化锰，用去核酸酶水溶解，钙黄绿素的浓度为500μm，氯化锰浓度为10mm；试剂b中含有羟基萘酚蓝，用去核酸酶水溶解，羟基萘酚蓝浓度为0.32mm。这种可视化混合染料能够应用在lamp检测中，在lamp反应前预先加入到lamp反应体系中，反应结束后，可根据体系颜色直接判断阳性阴性，且颜色对比差异明显；lamp扩增前，反应体系呈灰蓝色；lamp扩增结束后，阳性反应体系为天蓝色，阴性反应体系为紫罗兰色。
25.下面结合附图对本发明方案做出说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。
26.实施例1：
27.1.1可视化混合染料的制备
28.称取钙黄绿素粉末与氯化锰粉末置于同一容器内，用去核酸酶水溶解，使溶液中钙黄绿素浓度为500μm，氯化锰浓度为10mm，调节ph值至弱碱性，充分混匀，获得溶液为试剂a，即单一钙黄绿素储存液，4℃保存待用。
29.称取hnb粉末，用去核酸酶水溶解，使溶液中hnb的浓度为0.32mm，充分混匀，所得到的溶液为试剂b，即单一hnb染料储存液，4℃保存待用。
30.将试剂a和试剂b按照1:2体积充分混匀，获得的溶液即为可视化混合染料，4℃保
存待用。
31.1.2可视化混合染料用于lamp扩增反应
32.按照下表配置lamp反应体系。
[0033][0034][0035]
kpc特征序列：
[0036]
ctgaccaacctcgtcgcggaaccattcgctaaactcgaacaggactttggcggctccatcggtgtgtacgcgatggataccggctcaggcgcaactgtaagttaccgcgctgaggagcgcttcccactgtgcagctcattcaagggctttcttgctgccgctgtgctggctcgcagccagcagcaggccggcttgctggacacacccatccgttacggcaaaaatgcgctggtt
[0037]
根据kpc特征序列设计kpc-lamp引物组，信息如下：
[0038]
f3-kpc：tcgaacaggactttggcg
[0039]
b3-kpc：aaccagcgcatttttgcc
[0040]
fip-kpc：cctcagcgcggtaacttacagtttttctccatcggtgtgtacgc
[0041]
bip-kpc：tcaagggctttcttgctgccgttttacggatgggtgtgtccag
[0042]
lf-kpc：gcctgagccggtatccat
[0043]
lb-kpc：ccagcagcaggccggctt
[0044]
用kpc基因的阳性对照菌株做为阳性对照株，以阳性对照菌提取的dna模板为初始浓度，初始浓度均调至106cfu/μl，然后进行10倍系列梯度稀释，命名反应管为1-8号管，按照次序向1-7号管中的lamp扩增反应体系中加入不同浓度的kpc-dna模板，浓度依次为1
×
106cfu，1
×
105cfu，1
×
104cfu，1
×
103cfu，1
×
102cfu，1
×
101cfu，1
×
100cfu；8号管为阴性对照ntc管，加入相同体积去核酸酶水。
[0045]
将配置好的lamp反应体系置于65℃恒温条件下，反应45min，随后置于80℃条件下10min终止反应。肉眼观察判断lamp扩增后阳性和阴性结果之间的差异。
[0046]
结果判读：在自然光下，肉眼观察反应液前后颜色变化，结果如图1所示，lamp扩增
前，含有可视化混合染料的阳性和阴性反应体系都为灰蓝色；lamp扩增结束后，结果如图2所示，含有可视化混合染料的阳性反应体系为天蓝色，阴性反应体系为紫罗兰色；所有结果与图3核酸电泳图结果保持一致。据肉眼判断，可清除清楚看出含有新型混合染料的试剂阳性、阴性结果间颜色差异明显，易于可视化结果判读。
[0047]
另外，体系中dna模板含量越多，其颜色越深，可通过直接比色的方法直接对比两个样本中dna含量。
[0048]
与目前常见染料相比，该可视化混合染料使lamp结果更容易判读，阳性、阴性结果之间颜色差异更加明显，极大程度避免了结果的误判，而且不需要复杂的仪器设备来辅助检测实验结果；另外，染料预先加入lamp扩增反应液中，在lamp反应后，不必再打开pcr管盖，避免了对实验室环境造成核酸污染；最后，该可视化混合染料非dna嵌入型染料，对lamp反应干扰小，不影响lamp检测的灵敏度。
[0049]
对比例：
[0050]
现有技术中，cn108315390a所公开专利同样公开了一种包含试剂a和试剂b的混合染料，试剂a中含有钙黄绿素与氯化锰，试剂b中含有羟基萘酚蓝。但是该篇专利中试剂a和试剂b的混合比例是不同的，按照该篇专利所公开的混合比例范围1.8-2.2:1，选择比例为2:1，制备混合染料，同样用于实施例1中lamp扩增反应体系，扩增前后结果如图4和图5，在65℃恒温扩增结束后，阴性对照和阳性对照之间颜色差异不明显，区分难度系数大。
[0051]
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。